COP9信号小体（COP9 signalosome）又称CSN复合体,是一种进化上高度保守的多亚基蛋白复合体[1,2]。最初是邓兴旺等生物学家于1992年在拟南芥光形态建成的研究的过程中,采用T-DNA标签技术,分离筛选到一系列突变体,这些突变株由于相应基因的缺失导致暗中的生长植物呈现出一种类似于光下生长的状态,并克隆了COP1基因。随后,他们又克隆了其他COP成员[3,4,5,6]。CSN也在多种有机体中相继被发现,并且证实CSN复合体参与调控多个重要的生物过程。在高等真核生物,COP9信号小体由8个CSN成员组成,分别命名为CSN1~CSN8,其中6个亚基CSN1、CSN2、CSN3、CSN4、CSN7和CSN8含有PCI（Proteasome, COP9 signalosome and eIF3）结构域[7]。另外2个亚基CSN5和CSN6含有MPN（Mpr1-Pad1-N-terminal）结构域[6, 8]。在植物中,CSN一个主要的功能就是参与蛋白的降解。作为泛素-蛋白酶降解系统的组分,CSN通过移除cullin蛋白中的NEDD8（neural precursor cell- expressed developmentally downregulated-8,植物中也称为RUB（RELATED TO UBIQUITIN））来调控cullin- RING E3泛素连接酶的活性[8,9,10,11,12]。通过这种方式,CSN与SCF（SKP1-CUL1-F-box-type CRLs）复合体协作参与多种信号转导过程,在植物的生长发育、次生代谢调控中起着重要的作用。如CSN与SCFTIR1互作参与植物生长素信号途径[10, 13];CSN与SCFUFO互作参与花发育[14];CSN与SCFCOI1互作参与茉莉酸信号途径[15,16];CSN与SCFSLY1互作参与赤霉素的信号途径[17,18];CSN与SCFCFK1互作参与种子的发育[19]。
在天然橡胶生产中,人们通过有规律地重复切割橡胶树树干树皮（割胶）,切断树皮中的乳管,多次收集从乳管伤口处流出的乳汁状的胶乳来提炼橡胶。割胶显著促进橡胶树胶乳的合成,割胶树的胶乳内源茉莉酸含量显著高于未开割树,橡胶合成效率显著高于未开割树,外施茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate,MeJA）促进胶乳的生物合成,并鉴定了茉莉酸信号途径的核心环节HbCOI1- HbJAZ3-HbMYC2及其对法尼基焦磷酸合酶和小橡胶粒子膜蛋白基因的转录调节[20]。这些结果表明,割胶促进橡胶生物合成与激活茉莉酸信号传导途径有密切联系。为了进一步丰富和了解茉莉酸信号途径在橡胶生物合成中的作用,本文克隆了COP9信号小体的8个CSN成员并进行了组织特异性表达分析及割胶和茉莉酸甲酯处理的基因表达模式。
1 材料与方法
1.1 植物材料及处理
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）为热研73397品系,种植于中国热带农业科学院实验场。组织特异性表达的样品的采集：于同一天分别采集3株树的树皮、古铜期叶、淡绿期叶、成熟期叶、胶乳、雄花和雌花混合后置于液氮中用于RNA的提取。割胶处理样品的采集：选取3株8 a树龄的未开割树,采用S/2 d/3（1/2树围,3 d 1刀）的割制进行连续割4刀,收集每刀的胶乳样品于RNA提取液中用于RNA的提取。茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate,MeJA）处理样品的采集：参照郝秉中等[21]的方法,用0.07% MeJA分别处理橡胶树萌条第三伸长单位,于处理后2 h、4 h、8 h、1 d、2 d、3 d划破受伤部位的树皮采集胶乳,每一处理分别采集9株萌条的胶乳混合于RNA提取液中用于RNA的提取,对照为灭菌水处理萌条的胶乳样品。
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成 采用RNAprep Pure Plant Kit（天根生化科技（北京）有限公司,北京）提取不同组织样品的RNA,并采用试剂盒附带的DNase I进行痕量DNA的消化。采用NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, USA) 测定RNA的浓度,并用RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, USA)对RNA进行反转录合成第一链cDNA。
1.2.2 HbCSN基因的克隆 将拟南芥AtCSNs的序列同热研8-79的转录组序列（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE59981.）[22]进行同源性比对,获得8个HbCSNs的unigene序列。这8个unigene序列缺失5′端序列,HbCSN1、HbCSN2、HbCSN4和HbCSN6缺失3′端序列。为了获得完整的全长cDNA序列,采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, USA)试剂盒对HbCSNs序列进行了RACE（rapid-amplification of cDNA ends）实验,引物如表1。对于5′-RACE,采用试剂盒附带的5′-CDS primer A和SMARTer II A oligonucleotide对1 μg总RNA进行反转录,获得用于5′-RACE的cDNA。对于3′-RACE,采用3′-RACE CDS Primer A按照试剂盒说明对1 μg总RNA进行反转录,获得用于3′-RACE的cDNA。以获得5′-RACE和3′-RACE cDNA为模板,采用PrimeSTAR Max Premix （TaKaRa, Dalian, China）进行5′和3′端序列的扩增。将获得的5′和3′端序列与unigene序列进行拼接,并设计全长cDNA扩增引物（表1）,进行PCR扩增验证。
表1 引物序列Tab. 1 Sequences of the primers |
| 基因Gene | 上游引物 Forward primer | 下游引物 Reverse primer | 引物类型 The type of primer | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 名称Name | 序列Sequence（5′-3′） | 名称Name | 序列Sequence（5′-3′） | ||
| HbCSN1 | 5-1-P | CCCATCTCGATGCTAACAAGAATTG | 5-1-NP | CCCAAGAGCACCATGAGCATAATAG | 5′-RACE |
| 3-1-P | CGATCAAATCCGTAACAAAGCACTC | 3-1-NP | TAGGTTTCTTGAGCTGTCCAAGACG | 3′-RACE | |
| 1-F | TTAGCTAGCGTGTACGGTCAGA | 1-R | AACCAACTTGTTAAATAAATCCAAG | 全长cDNA扩增 | |
| Q1-F | GCATAGCCCAGTTTGTTCAA | Q1-R | TGCTGTATTCCCATCCTGCA | qRT-PCR | |
| HbCSN2 | 5-2-P | CTAGCTGATCCAGAAACGAAGTCCA | 5-2-NP | CCATGCTAACAACTTCTGCAAAACC | 5′-RACE |
| 3-2-P | AAGATGTTGAGCAGCTGTTGGTTTC | 3-2-NP | GCTCTCTTGTGAGGCCACAATTCTA | 3′-RACE | |
| 2-F | TCCGACGAGCTTCCATTGTTTCC | 2-R | ACGCAAGCCGTCAGATTGGTCC | 全长cDNA扩增 | |
| Q2-F | GTCAGTAGGTAGTGTGATTTCCA | Q2-R | AGTAGCTTCTAGAATTGTGGCC | qRT-PCR | |
| HbCSN3 | 5-3-P | TGCATTTCCGCCTCTTTTGG | 5-3-NP | TGAGTTGCACTGTGTTGGCT | 5′-RACE |
| 3-F | TGGGGAGTGAATTTGTCCGTG | 3-R | ACCGGATGCTTATCACAATGTCA | 全长cDNA扩增 | |
| Q3-F | GAGGCATGTGGACGAGATGTT | Q3-R | GGGGACTTTGACATGTGCATTAATT | qRT-PCR | |
| HbCSN4 | 5-4-P | GCCTGACACAAGCCAACAAT | 5-4-NP | TGCTATCTTTTCTGCCTTGTTTGG | 5′-RACE |
| 3-4-P | CCAAACAAGGCAGAAAAGATAGCA | 3-4-NP | TGCAGCAATGGGATCAACAGA | 3′-RACE | |
| 4-F | CAATTAGCAGAGGAAGCCGAGA | 4-R | AAAATAACTCACACAGGGATTGATAAG | 全长cDNA扩增 | |
| Q4-F | ATGTCCTGGATAGCATGGCG | Q4-R | TGCTATTATCATGGACTAGTCGT | qRT-PCR | |
| HbCSN5 | 5-5-P | GAGAGCCAGCATCCATACCC | 5-5-NP | ACAACATTCTCCAACCGCCC | 5′-RACE |
| 5-F | AGCGAGTAGGAAGCAAAGCAA | 5-R | ATCTTCTGTTGCATCACCAGGAA | 全长cDNA扩增 | |
| Q5-F | GTCCATGGTCTAATGTCACAGGT | Q5-R | ACCTTAACCCTCTCTGCAGAAGA | qRT-PCR | |
| HbCSN6 | 5-6-P | AGGAAAGCTCGGTCTAGGGA | 5-6-NP | CGTCCCCTCTGCACTCCTAT | 5′-RACE |
| 3-6-P | ACACAATTGGCTGCTCACCT | 3-6-NP | TGCCAGCCATTGAATCCGAA | 3′-RACE | |
| 6-F | ATCCCTGCATCTGTTTCTCCTG | 6-R | TCAGCATTTACTTCCATACAAGAGCT | 全长cDNA扩增 | |
| Q6-F | TTCAACACTGCCTATGACAG | Q6-R | TCCTTGAATGGTTATGAAATCAGCA | qRT-PCR | |
| HbCSN7 | 5-7-P | CGGGAATTTTCAGTTCCTTCAAGCTC | 5-7-NP | AAAGTGATGGATGAGTTCAGCTTGC | 5′-RACE |
| 7-F | ACTCGTGGCTTGACAATACCT | 7-R | CTGTTGCTGGAATGCTATGAATG | 全长cDNA扩增 | |
| Q7-F | GAAGACCGAAGCAGACCCAA | Q7-R | TGCTATGAATGAAAACCTGGCA | qRT-PCR | |
| HbCSN8 | 5-8-P | TCTGAGAATGCAGCAACAAGAACAC | 5-8-NP | AATTCTCCAAGCTGCTACCACTTCC | 5′-RACE |
| 8-F | CTTTCTCTGCTTCTCCTACTCTT | 8-R | TCTGGCAACCAAACACTCCCT | 全长cDNA扩增 | |
| Q8-F | GAACGTGGATGTGCAGCTAG | Q8-R | GGCAACCAAACACTCCCTTC | qRT-PCR | |
| HbActin | Actin-F | GATTCCGTTGCCCAGAAGTC | Actin-R | CACCACTCAGCACAATGTTACC | 内参基因引物 |
1.2.3 生物信息学及进化树分析 采用NCBI网站上的ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/gorf.html）对获得的HbCSNs全长cDNA进行开放阅读框的预测,并翻译成氨基酸。用Conserved Domain Search Service（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行氨基酸保守结构域的预测。利用PSORT（http:// psort.hgc.jp/form.html）对氨基酸序列进行亚细胞定位预测。采用基因结构显示在线系统GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）[23]对8个橡胶树CSN成员进行基因结构分析。
从NCBI数据库下载拟南芥的AtCSN蛋白序列,首先用Clustal W进行序列多重比对,再利用MEGA 4.0软件,选择neighbour-joining（NJ）模型,并进行1000次Bootstrap统计学检验,构建HbCSNs蛋白序列与拟南芥CSN蛋白的系统进化树。采用ProtParam tool (http://web.expasy.org/ protparam/)评估HbCSNs蛋白的分子量及理论等电点（pI）。
1.2.4 荧光定量PCR分析 不同组织样品及不同处理样品第一链cDNA稀释10倍用作模板采用Maxima SYBR Green qPCR Master Mixes (Thermo Scientific Inc., USA)试剂基于CFX384 System (Bio-Rad Laboratories Inc., USA)平台进行实时荧光定量PCR。10 μL反应体系中,包含1 μL模板、5 μL 2×SYBR Premix、10 μmol/L上游引物和下游引物（表1）各0.3 μL、灭菌水补足10 μL。每1个PCR反应重复3次,反应程序为：95 ℃预变性30 s;95 ℃变性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共40个循环;循环完后进行产物溶解曲线分析。利用CFX manager 3.0软件自动进行基线和Cq值分析,以HbActin （GenBank HQ260674.1）作为内参基因[24,25,26],采用CFX384系统中2-ΔΔCq算法进行基因的相对定量表达分析。
1.3 数据处理
采用one-way ANOVA对处理及对照进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 COP9家族基因HbCSNs的克隆及特征分析
通过比对分析,在橡胶树热研8-79中发现了8个匹配COP9家族基因的unigene,经过ORF（open reading frame）分析,发现这8个unigene不具有完整的阅读框,因此进行了5′-RACE,3′-RACE分析,通过拼接及RT-PCR扩增测序验证,获得了8个具有完整阅读框的COP家族基因,根据与拟南芥的同源性,我们将这8个成员分别命名为HbCSN1~HbCSN8,并将HbCSN1~ HbCSN8的全长cDNA序列登陆NCBI,GenBank登录号分别为KX156270~KX156277。以热研73397的基因组中CSN基因序列为依据,采用GSDS2.0分析了HbCSN1~HbCSN8的基因结构,结果表明橡胶树中的CSN基因家族成员的基因结构均是由多个外显子及多个内含子组成（图 1）。COP家族基因HbCSN1~HbCSN8的ORF长594~1320 bp,编码197~439个氨基酸,蛋白质的分子量（molecular weight,MW）介于22.641~ 51.395 ku之间,理论等电点pI介于4.98~6.26之间。根据NCBI的CDD保守结构域预测显示,HbCSN1、HbCSN2、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN7和HbCSN8具有PCI结构域,HbCSN5和HbCSN6具有MPN结构域（表2）。HbCSNs蛋白序列的亚细胞定位预测结果显示,HbCSN1、HbCSN2、HbCSN3被定位于细胞质内;HbCSN4和HbCSN6被定位于叶绿体中;HbCSN5和HbCSN7被定位于细胞核中;HbCSN8被定位于微体（过氧物酶体）中。
图1 橡胶树HbCSN基因序列的结构分析Fig. 1 Structural analysis of HbCSN gene sequences in rubber tree |
表2 HbCSN1~HbCSN8蛋白的特征分析Tab. 2 Characterization of identified HbCSN1—HbCSN8 proteins. |
| 基因 Gene | 基因登录号GenBank Acc. No. | 全长cDNA Full length cDNA | 推导蛋白Deduced proteins | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 5′非编码区5′UTR | 开放阅读框 ORF | 3′非编码区 3′UTR | 氨基酸 Amino acid | 结构域 Domain | 分子量 Molecular weight/ku | 等电点 pI | 亚细胞定位预测 Subcellular location prediction | 同源性 Amino acid identity/% | |||
| HbCSN1 | KX156270 | 101 | 1302 | 262 | 433 | PCI | 49.460 | 6.13 | 细胞质 | 80.05 (AtCSN1) | |
| HbCSN2 | KX156271 | 74 | 1320 | 265 | 439 | PCI | 51.395 | 5.89 | 细胞质 | 88.38 (AtCSN2) | |
| HbCSN3 | KX156272 | 66 | 1275 | 174 | 424 | PCI | 48.012 | 6.09 | 细胞质 | 65.97 (AtCSN3) | |
| HbCSN4 | KX156273 | 123 | 1194 | 227 | 397 | PCI | 45.190 | 5.08 | 叶绿体 | 85.89 (AtCSN4) | |
| HbCSN5 | KX156274 | 25 | 1104 | 95 | 367 | MPN | 40.971 | 4.98 | 细胞核 | 80.49 (AtCSN5A) 79.89 (AtCSN5B) | |
| HbCSN6 | KX156275 | 185 | 996 | 189 | 331 | MPN | 36.827 | 6.26 | 叶绿体 | 79.46 (AtCSN6A) 77.04 (AtCSN6B) | |
| HbCSN7 | KX156276 | 165 | 744 | 137 | 247 | PCI | 28.149 | 6.09 | 细胞核 | 70.45 (AtCSN7i) 67.31 (AtCSN7ii) | |
| HbCSN8 | KX156277 | 58 | 594 | 232 | 197 | PCI | 22.641 | 5.18 | 微体 | 71.07 (AtCSN1) | |
2.2 HbCSNs组织特异性表达分析
通过实时荧光定量PCR技术分析了8个HbCSNs基因在橡胶树树皮、不同发育时期的叶片、胶乳、雌花及雄花中的表达量。结果显示,8个HbCSNs基因均能在树皮、古铜期叶、淡绿期叶、成熟期叶、胶乳、雄花和雌花中检测到表达,其中HbCSN1、HbCSN2、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN6和HbCSN8基因在淡绿期叶片中的表达量最高,其次是成熟期叶片;HbCSN5在胶乳中的表达量最高,HbCSN7在成熟期叶片中的表达量最高（图3）。
图3 HbCSNs在橡胶树不同组织中的基因表达分析B：树皮;BL：古铜期叶;PGL：淡绿期叶;ML：成熟期叶;La：胶乳;FF：雄花;MF：雌花。 Fig. 3 Transcript profiles of the HbCSNs in different Hevea tissues These tissues (abbreviations in brackets) include bark (B); bronze-leaf (BL); pale-green-leaf (PGL); mature-leaf (ML); latex (La); female flower (FF) and male flower (MF). |
2.3 割胶处理对胶乳中HbCSNs基因表达的影响
荧光定量PCR结果显示,HbCSN1、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN5、HbCSN7和HbCSN8基因的表达量在割胶后显著上调,其中HbCSN1、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN7和HbCSN8基因第2、3、4刀的表达量与第1刀相比,表达量的上升达到极显著水平;HbCSN5基因第3、4刀的表达量与第1刀相比,表达量的上升达到极显著水平。相反,HbCSN6基因的表达量在割胶的第2、3刀后显著下调。HbCSN2基因的表达量不受割胶的影响（图4）。
图4 橡胶树胶乳中HbCSNs在割胶处理下的表达分析横坐标1、2、3、4分别代表割胶的第1刀、第2刀、第3刀、第4刀。*表示差异显著（p<0.05）,**表示差异极显著（p<0.01）。 Fig. 4 Expression analysis of HbCSNs in rubber tree latex after tapping treatment Latex samples were collected from virgin trees by the first tapping (1); second tapping (2); third tapping (3) and fourth tapping (4) respectively. * means significant difference (p<0.05), ** means extremely significant difference (p<0.01). |
2.4 外施茉莉酸甲酯（MeJA）处理对胶乳中HbCSNs基因表达的影响
荧光定量表达分析显示,除了HbCSN2和HbCSN7的表达不受MeJA处理的外,其他6个HbCSNs基因的表达量在不同处理时间表达上调,其中HbCSN1、HbCSN3、HbCSN6和HbCSN8基因的表达在MeJA处理8 h后显著上调,1 d后达到最高,在2 d后降下来。而且,HbCSN1的基因表达量上升的幅度最大,MeJA处理8 h和1 d后的表达量约是对照的2倍。HbCSN4和HbCSN5基因分别在MeJA处理1 d和4 h后上调表达（图5）。
3 讨论
氨基酸序列比对及系统进化分析表明,橡胶树HbCSN1~HbCSN8与拟南芥AtCSNs相似,其中HbCSN1、HbCSN2、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN7、HbCSN8分别和AtCSN1、AtCSN2、AtCSN3、AtCSN4、AtCSN7、AtCSN8结构相似,均具有PCI结构域;HbCSN5、HbCSN6分别和AtCSN5、AtCSN6结构相似,均具有MPN结构域。PCI结构域对于COP9蛋白复合体的组装是必须的,这是因为PCI结构域介导了多亚基复合物中蛋白与蛋白互作的稳定性[27,28]。MPN结构域可以细分为具有生物活性的MPN+和无活性的MPN[29]。CSN5含有MPN+结构域,该结构域具有一个嵌入式的金属蛋白酶基序JAMM（Jab1/ MPN/Mov24）,JAMM基序作为CSN异肽酶的催化中心起作用[1, 9, 30-32]。CSN6含有非活性MPN结构域,缺少JAMM基序,但是可能参与调控JAMM活性[33,34]。橡胶树HbCSNs与拟南芥的AtCSNs具有相似的结构域,可能具有与拟南芥相似的功能。
Feng等[15]采用免疫共沉淀和凝胶过滤分析在拟南芥体内证实CSN3、CSN4、CSN5和CSN6与SCFCOI1具有直接的联系,基因组表达图谱分析表明,JA引发的基因组表达在很大程度上依赖于COI1的剂量,更重要的是COI1依赖性JA应答基因要求CSN起作用,而且CSN的丰度对于JA响应具有重要的作用,据此推测CSN与SCFCOI1在体内相互作用介导JA的响应。本研究中,MeJA处理能显著上调HbCSN1、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN5和HbCSN8基因的表达丰度,HbCSNs表达丰度的上调是否也与JA的响应相关还需要进一步的研究。CSN不仅参与调节茉莉酸的响应,可能还参与调控茉莉酸的合成和植物应对食草动物及病原体的伤害[35]。在拟南芥,一种具有环状单链基因组DNA的双生病毒,通过CSN介导的SCF E3连接酶复合体的脱氢化抑制JA信号[16]。因此,CSN基因可能介导JA信号反应调控植物的发育和防卫反应。在本研究中,橡胶树8个CSN基因在多个组织中均能检测到表达,表明CSN可能参与了多种生理及发育的进程。在胶乳中,HbCSN1、HbCSN3、HbCSN4、HbCSN5和HbCSN8表达受割胶和MeJA处理显著上调。这些基因的表达模式与JA信号途径相关成员HbCOI1[36]、HbJAZ1[37]和HblMYC1[23]的表达模式相似。而且,有证据表明割胶和JA处理与天然橡胶的生物合成显著相关[20, 38],由此推测CSN可能参与胶乳的JA信号途径,但是其具体的机制还有待于进一步的研究。