蛋白质的组分蛋白包括清蛋白（可溶解于水中）、球蛋白（溶解于稀盐溶液）、醇溶蛋白（溶解于70%~85%的乙醇溶液）、酸溶性谷蛋白（谷蛋白-1）和碱溶性谷蛋白（谷蛋白-2）,不同组分蛋白的溶解性差异很大[1]。蛋白质中组分蛋白的构成是影响其营养价值、理化性质和功能特性的重要因素,而功能特性如溶解性和乳化性等又决定了蛋白质在食品工业中应用范围[2]。目前,食品工业中蛋白质的研究与应用多集中在分离蛋白或浓缩蛋白上,对于组分蛋白的研究与应用较少[3]。在制备分离蛋白与浓缩蛋白时,由于所用提取溶剂单一,因此无法针对性地将各种组分蛋白提取出来。这既限制了蛋白质产品的溶解性与应用范围,也无法实现对蛋白质的精细化利用。为了满足食品工业中特定的工艺需求或应用条件,对组分蛋白的研究是十分必要的。
椰麸（coconut cake）是椰子加工副产物,目前中国年产椰麸约20万t,是来源丰富的植物蛋白质资源[3]。研究表明椰麸蛋白质的营养价值较高,同时有降血脂、降血压等功效,是理想的活性蛋白质资源,开发潜力巨大,但目前各椰子主产国对椰麸的开发利用程度很低,造成了资源的极大浪费[4]。目前椰子蛋白的研究主要集中在椰子球蛋白（cocosin）上[5,6,7,8,9]。例如林源等[5]对椰浆球蛋白的结构与部分多肽序列进行了鉴定;ZHENG等[6]从椰子球蛋白中分离出多种抗氧化多肽;ANGELIA等[7]对椰子球蛋白的氨基酸组成与降血脂活性进行了分析。然而,目前关于椰子球蛋白的营养价值与功能特性的研究报道则较少。尽管ZHENG等[10]从椰麸清蛋白中分离出抗氧化肽与降血压肽,但是国内外关于椰麸清蛋白、谷蛋白与醇溶蛋白的研究报道极少,尤其缺乏谷蛋白- 1与谷蛋白-2方面的研究,这对于椰麸的综合利用与精深加工是十分不利的。本研究从椰麸中依次提取清蛋白、球蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-2,分析这些组分蛋白的氨基酸组成、营养价值、结构与乳化性,以期为椰子蛋白质的精深加工与利用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料 椰麸由海南美椰食品有限公司提供。
1.1.2 主要试剂 无水乙醚、无水乙酸、丙三醇、85%磷酸、过硫酸铵、丙烯酰胺、N,N’-二甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、TEMED（四甲基乙二胺）、考马斯亮蓝R-250、十二烷基硫酸钠（SDS）、8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）、甘氨酸、标准牛血清蛋白等均采购于生工生物工程（上海）股份有限公司,低分子量标准蛋白购于上海生物化学研究所。
1.1.3 仪器 DYCZ-24D型电泳槽、DYY-6C型电泳仪,北京六一生物仪器有限公司;PHS-2B pH 计,上海仪电科学仪器股份有限公司;XR 53648数显恒温水浴锅,金坛区西城新锐仪器厂;SHA-B双功能数显恒温震荡器,湖南衡阳仪器有限公司;D-78532型台式高速冷冻离心机,德国Hettich公司;FJ200-S均质机,浙江杭州齐威仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 椰麸组分蛋白的提取 采用依次提取法[6],从椰麸中依次提取清蛋白、球蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-2。首先将椰麸在45℃下干燥13 h后粉碎并过80目筛,然后将椰麸粉末按照1:25（g/mL）的比例浸入石油醚中,振荡脱脂6 h,过滤,收集滤渣,再次浸入石油醚中,反复脱脂3次,得到脱脂椰麸粉末。
（1）椰麸清蛋白（coconut cake albumin, CCA）的提取。称取100 g脱脂椰麸粉,以1:20的比例与蒸馏水（deionized water, dH2O）混合均匀,用磁力搅拌器搅拌提取2 h,将提取液倒入中速滤纸中,过滤,收集滤液,此为一次清蛋白的提取。将滤渣用于二次提取,再重复一次以上操作,收集滤液,8450 g下离心30 min,收集上清液,合并两次上清液,经真空冷冻干燥后得到CCA。而过滤所得残渣用以提取椰麸球蛋白。
（2）椰麸球蛋白（coconut cake globulin, CCG）的提取。在上述滤渣中加入0.4 mol/L NaCl（m/V= 1:23）,振荡提取2 h,过滤,收集滤液。滤渣中再次加入0.4 mol/L NaCl（m/V=1:15）,振荡提取2 h,将提取液在滤纸上过滤,合并滤液,8450 g下离心30 min,收集上清液,经真空冷冻干燥后得到CCG。而过滤所得残渣用以提取椰麸谷蛋白-1。
（3）椰麸谷蛋白-1（coconut cake glutelin-1, CCG-1）的提取。在已经提取了清蛋白和球蛋白的滤渣中,加入50%乙酸溶液（m/V=1:12）,35℃下搅拌提取2 h,过滤,收集滤液,滤渣再次用50%乙酸溶液（m/V=1:8）提取1次,过滤,合并滤液,10 000 g下离心20 min,收集上清液,装入透析袋（MW 3500 Da）中,4℃下透析24 h,每隔2 h换一次dH2O。透析结束后,将透析袋中溶液冷冻干燥,得到CCG-1。而所剩椰麸残渣用于提取谷蛋白-2。
（4）椰麸谷蛋白-2（coconut cake glutelin-2, CCG-2）的提取。在已经依次提取了清蛋白、球蛋白和谷蛋白-1的残渣中按照1:15（m/V）的比例加入0.1 mol/L的NaOH,35℃下搅拌提取2 h,过滤,收集滤液,滤渣用0.1 mol/L的NaOH（m/V= 1:10）再次提取1次并过滤。将两次过滤的滤液合并,10 000 g下离心20 min,收集上清液,装入透析袋（MW 3500 Da）中于4℃下透析24 h,每隔2 h换一次dH2O。将透析袋中溶液经冷冻干燥后,即得到CCG-2。
所提各组分蛋白的浓度用考马斯亮蓝法测定[11],并计算其在椰麸蛋白中的含量。
1.2.2 SDS-PAGE分析 参考ANGELIA等[7]方法进行,将上述所提各椰麸组分蛋白分别溶解于样品缓冲液中,使其终浓度都为1 mg/mL,在100℃下煮沸4 min,上样12 μL,恒压电泳（浓缩胶100 V,分高胶150 V）。电泳结束后,将胶片用考马斯亮蓝R-250染色过夜,放入脱色液中脱色,直至胶片背景蓝色完全透明,用Gene TBFW-1型凝胶成像仪分析。低分子量标准蛋白包括磷酸化酶b（97.4 kDa）,牛血清白蛋白（66.2 kDa）,卵清蛋白（43.0 kDa）,碳酸酐酶（31.0 kDa）,胰蛋白酶抑制剂（20.1 kDa）和溶菌酶（4.4 kDa）。
1.2.3 氨基酸组成分析 参考李艳等[12]方法进行,各椰麸组分蛋白的氨基酸组成与含量的分析在RL-9200型氨基酸自动分析仪上进行。以氨基酸组成为依据,分析椰麸各组分蛋白的NPS值（非极性氨基酸的总含量,含缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、异亮氨酸和酪氨酸）、P值（极性基团与非极性基团比值）。
1.2.4 生物效价预测 参考李艳等[12]方法,以必需氨基酸组成与含量为依据,预测各组分蛋白的生物效价（biological value, BV）,公式如下：
$\begin{aligned}B V=&\left.10^{2.15} \times q^{0.41} \text { 赖氦酸 } \times q^{0.60} \text { (苯丙氦酸酪氨酸 }\right) \times \\&\left.q^{0.77} \text { (甲硫氨酸 }+\text { 半胱氨酸 }\right) \times q^{2.4 \text { 苏氨酸 }} \times q^{0.2} \text { 色氦酸 }\end{aligned}$
式中各氨基酸的q值的计算方法如下：
当FAO/WHO的推荐值≥样品中该氨基酸含量时,q=该氨基酸含量/推荐值;
当FAO/WHO的推荐值≤样品中该氨基酸含量时,q=推荐值/该氨基酸含量。
FAO/WHO推荐值：赖氨酸=5.44 g/100 g,甲硫氨酸+半胱氨酸=3.52 g/100 g,苯丙氨酸+酪氨酸=6.08 g/100 g,苏氨酸=4.00 g/100 g,色氨酸= 0.96 g/100 g[13]。
1.2.5 椰麸组分蛋白的表面疏水性测定 采用荧光探针法[14]。首先将各组分蛋白溶解于蒸馏水中,浓度分别调至0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL。然后取不同浓度的椰麸组分蛋白溶液各2 mL分别与20 μL的ANS（8 mmol/L）混匀,2 min后测荧光强度。每组至少重复测定3次。激发波长390 nm,发散波长470 nm,缝隙波长5 nm。数据建立浓度与荧光强度的回归曲线,初始段的斜率即为表面疏水性（hydrophobicity）。
1.2.6 不同离子强度下椰麸各组分蛋白的乳化性能 通过添加不同质量的氯化钠,将椰麸各组分蛋白溶液的离子强度分别调节为0.2、0.4、0.6 mol/L。然后取调节好离子强度的椰麸组分蛋白溶液15 mL,与5 mL大豆油混合,在高速分散器中以12 000 r/min的速度均值90 s[14]。迅速从底部吸取50 μL乳浊液,加入4.95 mL 1% SDS溶液中,摇匀后立即在500 nm处测定吸光值（A0）,放置10 min后的吸光值记录为At。乳化性（emulsifying activity index, EAI）和乳化稳定性（emulsion stability index, ESI）的计算公式如下：
$\mathrm{EAI}=\left(2.303 \times 2 \times A_{0} \times \text { 稀释倍数 }\right) /(C \times \Phi \times 10000)$
其中,C（蛋白质浓度）=0.001 g/mL;Ф=油相体积数(0.25)。
$\mathrm{ESI}=A_{t} / A_{0} \times 100 \%$
1.3 数据处理
本研究中的各处理至少重复3次,取平均值。采用SPSS Version 16.0软件对结果进行分析,方差分析采用one-way ANOVA法。
2 结果与分析
2.1 椰麸组分蛋白的含量与SDS-PAGE分析
图1 椰麸各组分蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图谱M：标准蛋白;1：清蛋白;2：球蛋白;3：谷蛋白-1;4：谷蛋白-2。 Fig. 1 SDS-PAGE profiles of coconut cake protein fractions M: Maker protein; 1: Albumin; 2: Globulin; 3: Glutenlin-1; 4: Glutelin-2. |
表1 椰麸4种组分蛋白中亚基的分子量和含量Tab. 1 Molecular weight and composition of subunits of coconut cake protein fractions |
| 亚基序号 Number of subunits | 清蛋白 Albumin | 球蛋白 Globulin | 谷蛋白-1 Glutelin-1 | 谷蛋白-2 Glutelin-2 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 分子量 Molecular weight/kDa | 含量 Composition/% | 分子量 Molecular weight/kDa | 含量 Composition/% | 分子量 Molecular weight/kDa | 含量 Composition/% | 分子量 Molecular weight/kDa | 含量 Composition/% | |
| 1 | 53.3 | 18.0 | 53.3 | 19.1 | 50.6 | 14.6 | 119.2 | 2.2 |
| 2 | 25.2 | 37.5 | 51.0 | 24.3 | 33.4 | 26.6 | 53.3 | 9.9 |
| 3 | 17.7 | 44.5 | 34.0 | 12.8 | 28.7 | 12.5 | 50.4 | 3.2 |
| 4 | 28.7 | 1.4 | 27.3 | 5.4 | 43.7 | 2.0 | ||
| 5 | 25.7 | 26.7 | 22.4 | 31.6 | 36.6 | 12.0 | ||
| 6 | 21.2 | 4.3 | 20.6 | 9.1 | 34.2 | 15.5 | ||
| 7 | 18.4 | 11.4 | 27.9 | 10.8 | ||||
| 8 | 25.8 | 27.9 | ||||||
| 9 | 21.0 | 14.7 | ||||||
| 10 | 18.8 | 3.6 | ||||||
从图1和表1中结果可以看出,4种椰麸组分蛋白的亚基构成差异很大。椰麸清蛋白主要由3个亚基组成,分子量范围为17.7~53.3 kDa,其中分子量为25.2 kDa和17.7 kDa的亚基含量分别为37.5%和44.5%,这表明椰麸清蛋白中主要由小分子量亚基构成。而椰麸球蛋白主要由7条亚基组成,分子量范围为18.4~53.3 kDa,其中分子量为53.3、51.0、25.7 kDa的3条亚基的总含量为70.1%,表明球蛋白主要由中小分子量亚基构成。谷蛋白-1的亚基构成与球蛋白类似,由主要的6条亚基组成,分子量范围为20.6~50.6 kDa。与前三种组分蛋白相比,椰麸谷蛋白-2所含亚基条数最多（10条）,分子量范围分布最广,为18.8~119.2 kDa,其中分子量范围为18.8~53.3 kDa的亚基的总含量为97.8%,这表明谷蛋白-2也主要由中小分子量亚基构成。根据MARCONE等[16]对单子叶或双子叶植物蛋白中亚基的划分依据,郑亚军等[17]将分子量为20~27 kDa和30~39 kDa的椰子蛋白亚基分别划分为酸性亚基和碱性亚基。从图1中泳道3、泳道4以及表1中可以看出,椰麸谷蛋白-1中酸性亚基包括分子量分别为20.6、22.4和27.3 kDa的3个亚基,这3个亚基的总含量为46.1%,而椰麸谷蛋白-2中碱性亚基包括分子量分别为34.2和36.6 kDa的亚基,二者的总含量为27.5%,这应该是谷蛋白-1和谷蛋白- 2溶解性差异的主要原因。
2.2 椰麸组分蛋白的氨基酸分析
椰麸清蛋白、球蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-2的氨基酸组成与营养价值预测见表2。椰麸清蛋白、球蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-2都含有17种氨基酸,8种必需氨基酸的种类齐全。与FAO/ WHO推荐值相比,4种椰麸组分蛋白的亮氨酸、苏氨酸和酪氨酸的含量都较高;但其赖氨酸与缬氨酸的含量都较低。值得关注的是,这4种椰麸组分蛋白的必需氨基酸总含量均显著大于FAO/ WHO推荐值。其中,谷蛋白-1和球蛋白的必需氨基酸比例最高,分别为40.86%和39.26%,其次是谷蛋白-2和清蛋白。依据8种必需氨基酸的含量与比例,可以预测蛋白质的生物效价。表2中结果表明,4种椰麸组分蛋白中,清蛋白的生物效价值最高,球蛋白其次,而谷蛋白-2最低。球蛋白的缬氨酸含量和色氨酸含量最高,而谷蛋白-1的酪氨酸含量最高。综合以上分析可知,椰麸清蛋白、球蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-2的氨基酸组成较合理,营养价值较高,尤其是清蛋白的生物效价最高,这与KWON等[15]的研究报道一致。
表2 椰麸各组分蛋白的氨基酸组成与分析Tab. 2 Amino acid composition and analysis of coconut cake protein fractions g·(100 g)-1 |
| 氨基酸 Amino acid | 清蛋白 Albumin | 球蛋白 Globulin | 谷蛋白-1 Glutelin-1 | 谷蛋白-2 Glutelin-2 | FAO/WHO推荐值 Recommendation of FAO |
|---|---|---|---|---|---|
| 异亮氨酸 | 2.85±0.22c | 4.12±0.52a | 3.72±0.23b | 3.22±0.30b | 3.4 |
| 亮氨酸 | 4.12±0.36b | 6.51±0.15a | 6.51±0.17a | 6.29±0.16a | 3.5 |
| 赖氨酸 | 5.15±0.43a | 3.53±0.26b | 3.52±0.30b | 5.54±0.16a | 5.8 |
| 甲硫氨酸 | 1.26±0.25c | 2.82±0.13a | 2.14±0.31b | 1.26±0.06c | |
| 苯丙氨酸 | 3.05±0.34c | 5.86±0.12a | 4.65±0.29b | 4.45±0.21b | |
| 苏氨酸 | 3.05±0.35a | 3.21±0.18a | 3.23±0.04a | 3.00±0.11a | 2.5 |
| 色氨酸 | 3.13±0.67a | 3.85±0.09a | 3.06±0.33a | 1.79±0.14b | 2.8 |
| 缬氨酸 | 3.72±0.33c | 7.41±0.07a | 4.35±0.57b | 4.05±0.08b | 6.6 |
| 酪氨酸 | 3.35±0.47b | 3.64±0.10b | 5.68±0.86a | 3.59±0.72b | 0.5 |
| 组氨酸 | 1.74±0.10b | 2.15±0.35a | 2.54±0.80a | 1.89±0.11b | 1.9 |
| 天冬酰胺 | 6.95±0.49b | 8.51±0.42a | 5.75±0.59c | 8.31±0.50a | |
| 丝氨酸 | 3.45±0.40d | 4.55±0.51b | 3.89±0.34c | 3.84±0.06cd | |
| 谷氨酸 | 23.8±1.56b | 20.7±4.52c | 17.01±3.61d | 27.21±0.88a | |
| 甘氨酸 | 4.01±0.42b | 4.78±0.14a | 4.54±0.07a | 4.95±0.31a | |
| 丙氨酸 | 2.84±0.24b | 3.89±0.23a | 3.93±0.45a | 3.74±0.35a | |
| 精氨酸 | 17.65±0.0.36a | 15.15±0.23bc | 14.25±1.37c | 16.11±1.27a | |
| 脯氨酸 | 2.75±0.18b | 3.14±0.23a | 3.22±0.39a | 2.45±0.82b | |
| 必需氨基酸总和 | 28.29±1.19b | 39.25±0.95a | 36.34±1.41a | 33.29±1.12ab | 12.7 |
| E/T/% | 31.52b | 39.26a | 40.86a | 33.32b | |
| 非极性氨基酸比例 | 0.22±0.03b | 0.31±0.06a | 0.24±0.11b | 0.32±0.03a | |
| 生物效价 | 58.63a | 40.01b | 38.46b | 32.75c | |
| 表面疏水性 | 844.00c | 1100.01a | 990.21b | 1111.65a |
注：同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）;E/T表示必需氨基酸在总氨基酸中所占比例。 | |
Note: Different lowercase letters in the same line indicate significant difference (P<0.05); E/T, Ratio of essential amino acid to total amino acids. |
此外,这4种椰麸组分蛋白中,谷氨酸和精氨酸的含量都很高,分别为17.01~27.21 g/100 g和14.25~17.65 g/100 g。由于谷氨酸和精氨酸都是极性氨基酸,因此导致椰麸组分蛋白中非极性氨基酸的比例较低。清蛋白和谷蛋白-1中,非极性氨基酸在总氨基酸中的比例是最低的,仅为0.22和0.24。氨基酸是构成蛋白质的结构单元,氨基酸的组成与含量对蛋白质的营养价值、理化性质和功能特性有重要意义。其中,极性氨基酸与非极性氨基酸的比例会影响蛋白质亲水性与表面疏水性,进而影响蛋白质溶解性、黏度、乳化性等功能特性与生物活性[5]。研究表明,富含芳香族氨基酸的蛋白质和富含疏水性氨基酸的蛋白质,具有较高的乳化性、降血压活性和抗氧化性;而富含支链氨基酸的蛋白质,对于提高人体免疫力、调节人体神经系统具有较好的作用[1, 6, 14]。
2.3 椰麸组分蛋白的表面疏水性
疏水作用是维系蛋白质三级紧密结构的主要作用力,也是蛋白质在脂质和乳化液等非极性体系中能否发挥功能作用的重要影响因素。表面疏水性与亲水性共同决定了蛋白质的乳化性能,因为乳化就是要把油和水这样互补相溶的两相融合在一起,形成相对稳定的乳化液[1]。椰麸清蛋白、球蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-2的表面疏水性见表2。椰麸谷蛋白-2和球蛋白的表面疏水性最高,其次是谷蛋白-1,而椰麸清蛋白的表面疏水性最小。蛋白质的表面疏水性主要取决于其非极性氨基酸含量和非极性化学键。表2中结果表明,椰麸清蛋白中非极性氨基酸占总氨基酸的比例最低（0.22）,因此表现出最低的表面疏水性,而椰麸谷蛋白-2和球蛋白中非极性氨基酸比例相对较高,所以具有较高的表面疏水性。
2.4 椰麸组分蛋白的乳化性质
2.4.1 不同离子强度下椰麸组分蛋白的乳化性和乳化稳定性 离子强度为0~0.6 mol/L时,椰麸清蛋白、球蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-2的乳化性见图2。
在相同的离子强度下,4种椰麸组分蛋白的乳化性依次为球蛋白>谷蛋白-2>清蛋白>谷蛋白- 1。椰麸球蛋白的乳化性显著高于大豆分离蛋白,在离子强度为0.4 mol/L时可达127.3 m2/g。在离子强度为0~0.2 mol/L时,椰麸谷蛋白-2和清蛋白的乳化性也明显高于大豆分离蛋白。PATIL等[18]研究表明,分子量为53.3、25.2、18.8 kDa的3 个亚基在椰子蛋白的乳化性中有重要作用。从图1和表1中可以看出,椰子球蛋白、清蛋白和谷蛋白-2中这3个亚基的含量均较高,因此表现出较高的乳化性。此外,椰子球蛋白和谷蛋白-2较高的表面疏水性（如表2所示）也是他们较高乳化性的原因之一,因为蛋白质的乳化性取决于其亲水性与疏水性之间的平衡[1]。椰麸谷蛋白-1表现出最低的乳化性能,主要原因可能是其在中性溶液中溶解度较低导致的。
从图2还可以看出,离子强度为0~0.4 mol/L时,随着离子强度的增大,椰麸球蛋白和大豆分离蛋白的乳化性随之增大;而离子强度为0.6 mol/L时,椰麸球蛋白和大豆分离蛋白的乳化性显著降低。大豆分离蛋白的主要成分也是球蛋白[19],在较低浓度时,增加离子强度可以发挥“盐溶”效应,即蛋白质的溶解度增大,意味着更多的椰麸球蛋白和大豆分离蛋白可以溶解在溶液中并参与到乳化液的形成过程,因而表现出较高的乳化性;与之相反,当离子强度过高时会发生“盐析”效应,大量球蛋白会从高离子强度的溶液中析出,导致椰麸球蛋白的乳化性降低。而在离子强度为0~0.6 mol/L时,椰麸清蛋白和谷蛋白-2随着离子强度的增大乳化性反而降低。主要原因是离子强度增大后,椰麸清蛋白（仅溶解于纯水中）和谷蛋白-2（仅溶解在稀碱溶液中）会逐渐从溶液中析出,在溶液中参与乳化作用的有效蛋白质分子变少,最终使乳化性降低。
2.4.2 不同离子强度下椰麸组分蛋白的乳化稳定性 离子强度对椰麸清蛋白等组分蛋白乳化稳定性的影响见图3。
在离子强度为0 mol/L时,椰麸球蛋白、清蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-2的乳化稳定性均显著高于大豆分离蛋白（P<0.05）。PATIL等[18]研究表明,分子量为51.0~53.3 kDa的亚基属于椰子7S球蛋白,其含量越高,则椰子蛋白的乳化性和乳化稳定越好。从图1和表1可以看出,椰麸球蛋白、清蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-2都含有分子量为53.3 kDa的亚基,这是其具有较高乳化稳定性的原因之一。此外,适宜大小的分子量（18.8~ 53.3 kDa）和较高的疏水性也是椰麸组分蛋白具有较高乳化稳定性的重要原因。研究表明,蛋白质的乳化稳定与其亲水性、表面疏水性、分子大小等因素有关[4, 12, 16]。分子量太小时,蛋白质没有足够的力量来维持乳化液的稳定;而分子量太大时,蛋白质的亲水性一般较差,且容易形成积聚,导致乳化液的稳定性较差[7]。此外,当蛋白质的表面疏水性较小时,所形成的乳滴之间由于没有足够的排斥力,容易积聚在一起而使乳化液分层,丧失稳定性[18,19]。值得注意的是,椰子球蛋白的乳化稳定性高于其他椰麸组分蛋白,但未达到显著性差异水平。椰麸球蛋白中分子量为51.0~53.3 kDa的亚基的含量在4种组分蛋白中是最高的（43.4%）,这是其具有较高乳化稳定性的重要原因。
当离子强度增加时,椰麸球蛋白和大豆分离蛋白的乳化稳定性略有升高,并在0.4 mol/L时达到最高;在离子强度为0.6 mol/L时,椰麸球蛋白和大豆分离蛋白的乳化稳定性均略有下降。原因是低浓度下,离子强度的增加引发“盐溶”效应,使球蛋白的溶解性增加,有更多的蛋白质分子参与维持乳化液的稳定;而高离子强度下,蛋白质发生“盐析”,溶解度下降,乳化稳定性降低。而清蛋白和谷蛋白-2的乳化稳定性随着离子强度的增加直接下降,主要原因是随着大量氯化钠的加入,这两种组分蛋白的溶解性被显著降低,从而使乳化稳定性降低。
3 讨论
传统的蛋白质制备方法由于提取溶剂单一,不仅提取率较低,所制备的蛋白质产品的溶解范围也有限,无法应用于特定的食品体系中。而依据溶解性对植物组分蛋白的分离纯化和性质研究,可以使蛋白质开发利用的理论基础更加清晰、目的更加明确,利于实现蛋白质的精深加工与精准应用。本试验分别利用蒸馏水、0.2 mol/L NaCl、50%冰乙酸和0.1 mol/L NaOH从脱脂椰麸中提取出清蛋白、球蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-2。营养价值分析表明,四种椰麸组分蛋白的营养价值都较高,其中谷蛋白-1的必需氨基酸含量最高（40.86%）,而椰麸清蛋白的生物效价最高（58.63）,这表明椰麸清蛋白与谷蛋白-1是较好的营养强化剂。SDS-PAGE分析表明,4种组分蛋白的亚基构成差异显著（p<0.05）,其中椰麸谷蛋白-1主要由6条亚基构成,分子量范围为20.6~ 50.6 kDa;而椰麸谷蛋白-2则由10条亚基构成,分子量范围为18.8~119.2 kDa。KWON等[15]曾分析椰子球蛋白与清蛋白的亚基构成,表明清蛋白和球蛋白主要由中、小分子量亚基组成;郑亚军等[17]对不同品种椰子贮藏蛋白（主要是球蛋白和清蛋白）的亚基构成进行分析,也表明不同品种间椰子清蛋白和球蛋白的差异不大,但是同一品种的清蛋白和球蛋白的亚基组成和含量有显著性差异,这些报道与本研究结果一致。目前关于椰麸谷蛋白-1和谷蛋白-2的研究报道较少。本研究表明,谷蛋白-2的亚基组成更复杂,分子量分布范围也更广。亚基构成的差异是蛋白质四级结构差异的突出表现,根本原因是蛋白质一级结构即肽链上氨基酸组成和空间结构（蛋白质中多肽链的螺旋、折叠和链接方式）的差异所导致的。亚基构成不同,会导致蛋白质呈现不同的理化性质和功能特性,并最终影响其在食品工业中的应用。虽然KWON等[15]研究了椰子球蛋白和清蛋白的亚基构成与分子量;而本试验结果填补了关于椰麸谷蛋白-1和谷蛋白-2亚基结构方面的研究空白。分子量和氨基酸组成上的差异是导致蛋白质营养价值与功能特性差异的重要原因[16]。
在乳化性方面,椰麸球蛋白和谷蛋白-2由于具有较高的表面疏水性,表现出较高的乳化性和乳化稳定性;而谷蛋白-1表现出最低的乳化性。离子强度为0~0.4 mol/L时,增加离子强度可以提高椰麸球蛋白的乳化性和乳化稳定性;但椰麸清蛋白和谷蛋白-2的乳化性和乳化稳定性均随离子强度的升高而降低。在相同的离子强度变化趋势之下,椰麸清蛋白、谷蛋白-2与椰麸球蛋白之所以表现出不同的变化规律,主要原因是这3种组分蛋白差异显著的溶解性。本研究结果表明,虽然改变离子强度可以使蛋白质整体上呈现出“盐溶”或“盐析”现象,进而影响它们的乳化性能[14, 16, 18];然而与分离蛋白与浓缩蛋白相比,即使在相同的溶液体系中,不同组分蛋白也会表现出各自迥异的溶解性与疏水性,进而表现出差异显著的乳化性能。此外,椰麸清蛋白、球蛋白和谷蛋白-2的乳化性和乳化稳定性均显著高于大豆分离蛋白,表明这3种椰麸组分蛋白可以作为天然乳化剂应用于食品工业中。由于椰麸醇溶蛋白的含量很低（1.1 g/100 g）[1],开发为改善食品功能特性产品时会收到来源的限制,因此在本试验中没有研究。同时,亚基组成与椰麸各组分蛋白功能特性的具体关系,以及离子强度与蛋白质乳化稳定性之间的关系,还需要更加细致深入的研究。