辣椒（Capsicum annuum L.）是重要的世界性蔬菜,也是海南省冬季瓜菜的第一大蔬菜品种,一直受到国家和省部领导的高度重视和密切关注。2017年,海南省的辣椒种植面积约为4.55万hm2,约占海南省瓜菜生产总面积的15.3%[1]。目前,辣椒产业已发展成海南经济快速发展的热带农业支柱产业之一。
桃蚜[Myzus persicae (sulzer)]是对辣椒生产威胁最大的有害生物之一[2]。桃蚜不仅会严重影响植物的生长,还能传播多种病毒[3]。随着海南省冬季瓜菜生产的快速发展,桃蚜在辣椒上的发生与危害也日趋严重,严重制约了海南辣椒产业的持续健康发展。目前,桃蚜防治仍依赖于化学药剂,但化学防治过程中施药技术落后导致农药有效利用率低、使用频率及剂量不断加大、不合理和违规用药等问题日益突出,不仅加速了抗药性的发生,而且对农产品质量安全、产地生态环境安全构成严重威胁[4,5]。因此,寻求安全高效的桃蚜防治措施成为辣椒产业可持续发展中亟需解决的重要问题。
众所周知,培育抗虫品种是目前防治害虫最经济、有效的手段[6],而阐明作物的抗虫机理能够为选育抗虫品种提供理论依据。作物的诱导性防御机制在作物抗虫性中发挥了重要作用,这些防御机制要经过多个复杂的信号途径的参与才能完成,水杨酸（salicylic acid, SA）和茉莉酸（jasmonic acid, JA）介导的防御信号途径在调节植物对各种昆虫、病原体和非生物胁迫的防御反应中起着主要作用。一般认为,水杨酸信号途径主要参与对病原体的防御反应,而茉莉酸信号主要参与对机械损伤和昆虫取食的防御反应。植物对昆虫取食的防御反应是复杂的,与它们的取食方式和在植物上造成的损害程度密切相关。不同于咀嚼式口器昆虫,蚜虫主要通过刺吸式口器在韧皮部取食,造成的损伤较小,而且唾液会与植物发生一定的相互作用,这导致蚜虫诱导的防御反应更类似于病原体引发的防御反应[7]。水杨酸的植物抗蚜性作用在不同作物上有所不同,Moran等[8]发现在拟南芥和小麦中诱导水杨酸通路后并没有导致其抗性增加,而Morkunas等[9]发现,水杨酸处理显著增加了抗蚜大豆植株对蚜虫的抗性,但并未增加感蚜大豆植株的抗蚜性。茉莉酸信号途径的激活会显著增强植物对蚜虫的抗性[10],外源施用茉莉酸甲酯也会显著降低蚜虫的侵染率[11]。
然而,迄今为止,水杨酸和茉莉酸信号途径与辣椒抗蚜性的相关性研究鲜有报道。为此,本研究系统分析桃蚜为害前后抗、感蚜参照辣椒品种叶组织中水杨酸、茉莉酸含量的差异以及水杨酸、茉莉酸信号途径基因相对表达量的变化,以期为深入探讨水杨酸、茉莉酸信号途径在辣椒抗蚜性中的重要作用,以及为系统开展辣椒抗蚜新种质的创制和分子设计育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试辣椒品种 选用遗传稳定的抗蚜参照辣椒品种‘猪大肠’（ZDC）和感蚜参照辣椒品种‘大羊角椒’（DYJJ）为试验材料,2个辣椒品种皆属于长辣椒变种（Capsicum annuum L. var. longum Bailey）。‘猪大肠’和‘大羊角椒’种子均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所特色热带作物害虫课题组提供。供试的‘猪大肠’和‘大羊角椒’植株均在培养箱中统一种植,每周浇水3次,6周后取生长一致的健康植株用于试验。培养箱中温度24 ℃,光周期L∶D=16∶8,相对湿度70%。
1.1.2 供试桃蚜 供试桃蚜来源于本研究组以感蚜参照辣椒品种DYJJ植株继代饲养超过40代的室内种群,养虫室环境条件为温度24 ℃,光周期L∶D=16∶8,相对湿度70%。
1.1.3 仪器与试剂 高速冷冻离心机、Bio-Rad qPCR系统（Bio-Rad, USA）等。配制缓冲液的相关试剂均为国产分析纯试剂,缓冲液按照《分子克隆实验指南（第三版）》配制。RNA提取所用Trizol试剂购自Invitrogen公司（Invitrogen Inc. USA）,DNaseⅠ试剂盒,cDNA合成试剂盒,Master mix,Maxima™ SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒均为Fermentas公司产品（Fermentas, Glen Burnie, MD）,其余相关试剂例如氯仿、异丙醇等均为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 桃蚜接种和取样 在培养箱内种植6周后,选取长势一致的‘猪大肠’和‘大羊角椒’植株,以未接种桃蚜前的辣椒植株相同部位叶片为对照,在辣椒植株的第4片真叶的叶背接种桃蚜雌成虫,每片叶接20头蚜虫,用蚜虫生态盒轻轻夹住叶片,使叶片的正常生理活动不受影响,并且保证桃蚜不迁移。分别在未接种桃蚜前（0 h）、接种桃蚜后6、12、24、48、96 h 6个时间点采集叶片,采样后立即用液氮保存,-80 ℃冰箱保存,用于水杨酸、茉莉酸含量以及水杨酸、茉莉酸信号途径基因表达量测定,每个时间点设置3个重复。
1.2.2 叶组织中水杨酸及茉莉酸含量测定 参照购自上海酶联生物科技有限公司的植物水杨酸ELISA试剂盒、植物茉莉酸ELISA试剂盒的说明书对样品进行水杨酸以及茉莉酸含量测定。
1.2.3 叶组织中水杨酸及茉莉酸途径关键基因表达量测定 （1）总RNA提取以及第一链cDNA的合成。采用TRIzol方法提取辣椒叶片组织的总RNA。利用Nanodrop 2000（Thermo）和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度和完整性。RNA经gDNA Eraser（TaKaRa Biochemicals, Dalian, China）处理去除基因组DNA后,取1.0 μg RNA用于cDNA的合成。
表1 辣椒相关基因表达水平的qPCR引物序列信息Tab. 1 qPCR primers for analysis of transcription of pepper genes |
| 引物名称 Primers | 序列（5'-3'） Sequence (5'-3') | 退火 温度 Tm/℃ | 产物大小 Product size/bp |
|---|---|---|---|
| Actin-F | GCTGTTCTTTCCTTGTATGC | 51.3 | 156 |
| Actin-R | ATCAGTTAGGTCACGTCCAG | 53.8 | |
| PR1-F | GTGCACCAGGAAAAGTATGT | 52.5 | 212 |
| PR1-R | GACGTTGTCCTCTCCAATTA | 51.4 | |
| PAD4-F | TCTTCGTTGTGCCTGGGTG | 53.3 | 174 |
| PAD4-R | CGAGCGTCCTGTTATGACTACTG | 52.4 | |
| EDS5-F | ATTGAACTTGCCGCTTTAGG | 53.1 | 206 |
| EDS5-R | TTGCACGTCATCTTTATCCC | 52.3 | |
| LOX2-F | ATGGCGTTCGCTTACTAATTCA | 54.0 | 185 |
| LOX2-R | CAGGCTTGGAGTTCATCATCTT | 54.7 | |
| COI1-F | TGGGGGACTTACTGATGTAG | 53.1 | 136 |
| COI1-R | CTAGTTTTTGCAGGCTAGGA | 51.7 | |
| AOC-F | ATAACAGCAGGACTCTGCAT | 53.3 | 147 |
| AOC-R | CGAGGTAAGTGTCCTCGTAG | 54.5 |
1.3 数据处理
采用Excel 2010软件进行数据整理。多组数据的显著性差异分析使用SPSS软件Duncan’s新复极差法,两组数据的显著性差异分析采用student’s t-test方法。以蚜虫为害前叶组织中水杨酸、茉莉酸信号途径相关基因表达量为对照,桃蚜为害后水杨酸、茉莉酸信号途径基因相对表达量变化以对照的倍数表示。
2 结果与分析
2.1 桃蚜为害后抗、感参照辣椒品种水杨酸含量的差异
图1结果表明,桃蚜为害后抗、感蚜参照辣椒品种叶组织中的水杨酸含量存在显著差异。桃蚜为害前（0 h）,抗、感蚜辣椒品种的水杨酸含量无显著差异（P>0.05）,而桃蚜为害6、12、24 h后,抗蚜辣椒品种ZDC的水杨酸含量逐渐升高,并在为害后24 h其含量达到峰值,而在为害48、96 h后逐渐降低,并且在整个为害时间内抗蚜辣椒ZDC的水杨酸含量均显著高于为害前的水平（P<0.05）。桃蚜为害后感蚜辣椒品种DYJJ除了12 h的水杨酸含量与为害前无显著差异外,其余时间测得的含量均显著高于为害前水平,并且总体呈现出逐渐升高的趋势,并在为害96 h后水杨酸含量达到最高值。上述结果表明桃蚜为害均能够诱导抗、感蚜辣椒品种水杨酸含量的提高。
图1 桃蚜为害不同时间后抗、感辣椒品种的水杨酸含量不同小写字母表示感蚜辣椒品种受桃蚜为害不同时间后水杨酸含量差异显著,不同大写字母表示抗蚜辣椒品种受蚜虫为害不同时间后水杨酸含量差异显著（One-Way ANOVA,P<0.05）;*表示相同为害时间抗、感蚜辣椒品种水杨酸含量差异显著（t-test）。 Fig. 1 Salicylic acid content of resistant and susceptible pepper cultivars damaged by M. persicae in different time Different lowercase letters indicate significant difference of salicylic acid content in aphid-susceptible pepper cultivar DYJJ while damaged by M. persicae over time, and different uppercase letters indicate significant difference of salicylic acid content in aphid- resistant pepper cultivar ZDC while damaged by M. persicae over time (One-Way ANOVA, P<0.05), * indicates significant difference of salicylic acid content in aphid-resistant and aphid-susceptible pepper cultivars while damaged by M. persicae in the same time (t-test). |
2.2 蚜为害后抗、感辣椒品种桃茉莉酸含量的差异
从图2可看出,桃蚜为害后抗、感蚜参照辣椒品种的茉莉酸含量也有显著差异。桃蚜为害前（0 h）,抗、感蚜辣椒品种的茉莉酸含量无显著差异（P>0.05）。桃蚜为害6、12 h后抗蚜辣椒ZDC的茉莉酸含量与为害前无显著差异,但在为害24 h后其含量显著提高,在为害后48、96 h又降低至为害前的水平。感蚜辣椒品种DYJJ在为害6、12 h后的茉莉酸含量均比为害前显著降低（P<0.05）,而在为害24、48、96 h后又逐渐提高到为害前的水平。此外,在桃蚜为害后12~96 h,抗蚜辣椒ZDC的茉莉酸含量均显著高于感蚜辣椒DYJJ（P<0.05）。上述结果表明桃蚜为害能诱导抗蚜辣椒品种茉莉酸含量的提高,而对感蚜辣椒茉莉酸的合成具有抑制作用。
图2 桃蚜为害不同时间后抗、感辣椒品种的茉莉酸含量不同小写字母表示感蚜辣椒品种受桃蚜为害不同时间后茉莉酸含量差异显著,不同大写字母表示抗蚜辣椒品种受蚜虫为害不同时间后茉莉酸含量差异显著（One-Way ANOVA,P<0.05）;*表示相同为害时间抗、感蚜辣椒品种茉莉酸含量差异显著（t-test）。 Fig. 2 Jasmonic acid content of resistant and susceptible pepper cultivars damaged by M. persicae in different time Different lowercase letters indicate significant difference of jasmonic acid content in aphid-susceptible pepper cultivar DYJJ while damaged by M. persicae over time, and different uppercase letters indicate significant difference of jasmonic acid content in aphid-resistant pepper cultivar ZDC while damaged by M. persicae over time (One-Way ANOVA, P<0.05), * indicates significant difference of jasmonic acid content in aphid-resistant and aphid-susceptible pepper cultivars while damaged by M. persicae in the same time (t-test). |
2.3 桃蚜为害后抗、感辣椒品种水杨酸信号途径基因表达量的差异
从图3可看出,桃蚜为害前后抗、感辣椒品种水杨酸信号途径基因表达量存在显著差异。桃蚜为害后,抗蚜辣椒品种ZDC和感蚜辣椒品种DYJJ的茉莉酸信号途径基因PR1和EDS5的表达量均比为害前显著升高,并且这2个基因在ZDC中表达量的峰值均出现在为害后12 h,分别达到为害前的6.21倍和2.34倍（图3A）,在DYJJ中表达量的峰值则出现在为害后24 h,分别达到为害前表达量的7.09倍和7.63倍（图3B）,而PAD4基因的表达量在ZDC上无显著变化,在DYJJ中仅在为害后24 h显著高于为害前水平。此外,桃蚜为害前抗、感辣椒品种中PR1、PAD4和EDS5基因的表达量无显著差异,但为害6、12 h后抗蚜辣椒ZDC中PR1的表达量显著高于感蚜辣椒DYJJ,随着为害时间的延长,PR1基因在ZDC中的表达量又显著低于DYJJ的水平,EDS5基因的表达量也表现出相似的变化趋势,只是桃蚜为害12 h后其相对表达量则逐渐降低,而在整个桃蚜为害期内,PAD4基因在抗、感辣椒品种中也表现出显著差异（图3C）。上述结果表明,桃蚜为害后均能诱导抗、感蚜辣椒品种中水杨酸信号途径相关基因的表达,并且有些基因在抗蚜辣椒中的上调表达更为迅速,表达量也显著高于感蚜辣椒。
2.4 桃蚜为害后抗、感辣椒品种茉莉酸信号途径基因表达量的差异
从图4可看出,桃蚜为害前后抗、感蚜辣椒品种叶组织中的茉莉酸信号途径基因表达量存在显著差异。桃蚜为害后,抗蚜辣椒品种ZDC中COI1基因的表达量与为害前相比无显著变化,而LOX2、AOC基因表达量则先逐渐升高,后又逐渐恢复到为害前的水平,其表达量的峰值分别出现在为害后24 h和12 h,分别达到为害前的2.22倍和3.29倍（图4A）。感蚜辣椒品种DYJJ中LOX2基因的表达量在为害6、12 h后与为害前无显著差异,为害24~96 h又显著降低,而LOX2、AOC的表达量均经历了先逐渐降低至显著低于为害前水平,之后又逐渐恢复到为害前水平的过程（图4B）。此外,抗蚜辣椒品种ZDC中LOX2、COI1和AOC基因的表达量分别在桃蚜为害6~12、48、24~48 h后显著高于感蚜辣椒品种DYJJ,其余为害时间则与感蚜品种的表达量无显著差异（图4C）。上述结果表明,桃蚜为害后,感蚜辣椒品种DYJJ中茉莉酸信号途径相关基因的表达量被抑制,而抗蚜辣椒品种ZDC中相关基因的表达量依然能够诱导提高。
3 讨论
植物被害虫为害后会改变其内源水杨酸、茉莉酸含量,并进一步诱导体内的系列防御反应以抵御害虫取食。大量的研究表明,与水杨酸、乙烯等信号途径相比,茉莉酸途径在植物应对刺吸式害虫为害时所产生的诱导防御反应中起着主导作用[13,14,15],并且因作物类型和品种而异,水杨酸和茉莉酸信号途径同时存在协同和拮抗作用。Agut等[16]研究发现抗螨品种酸橙被二斑叶螨为害后水杨酸含量随为害时间的延长逐渐升高,茉莉酸含量则呈先逐渐升高后逐渐降低的趋势,而感螨柑橘品种Cleopatra mandarin受螨害后水杨酸、茉莉酸含量与为害前相比均无显著变化,茉莉酸含量诱导不足可能是感螨柑橘品种容易被二斑叶螨为害的原因之一。Rodriguez-Saona等[17]发现棉花韧皮部被木薯粉虱取食后,韧皮部诱导的水杨酸能够抑制蛋白酶抑制剂（protease inhibitor, PI）的合成,而PI又是茉莉酸诱导植物产生防御信号的重要物质,因此间接导致了茉莉酸信号途径被抑制。此外,还有研究表明茉莉酸也能抑制昆虫取食后植物体内水杨酸含量的增加,例如Florencio-Ortiz等[18]发现桃蚜取食辣椒8、24、48、96 h后,茉莉酸含量比对照显著提高,整体趋势为先上升后下降,拐点出现在48 h,而水杨酸含量仅在96 h显著提高,表明可能在辣椒体内水杨酸和茉莉酸的合成出现了一定的拮抗现象。这一现象早在Zhu-Salzman等[19]的研究中也有体现,高粱蚜取食高粱作物时,能“操纵”高粱体内的防御反应,具体表现为可通过增强水杨酸的信号途径,来抑制在生物学上可能更有效的茉莉酸信号路径,从而延缓其对高粱蚜虫生长发育的侵害。本研究结果显示,桃蚜为害24 h内,抗、感蚜辣椒被桃蚜为害后均能诱导水杨酸含量的提高,并且抗蚜辣椒ZDC的水杨酸含量显著高于感蚜辣椒DYJJ,而茉莉酸含量在ZDC中显著提高,在DYJJ中则显著被抑制,表明水杨酸、茉莉酸信号途径在抗蚜辣椒上具有协同效应,而在感蚜辣椒上则表现出拮抗作用。这可能是导致ZDC和DYJJ抗性水平显著差异的原因之一,并与前人[11, 13-14]的研究结果具有一致性。
植物被害虫为害后,其内源性水杨酸、茉莉酸含量的变化会诱导这2个信号途径相关基因表达量的变化。PR1（病程相关蛋白）是水杨酸信号途径的标志性基因。PAD4基因编码核质蛋白,在植物受到病原或桃蚜侵染时,可以通过调节水杨酸的积累,增强植物的防御能力,是植物体内水杨酸防御途径重要的调节因子[20]。EDS5基因在调节水杨酸诱导的防御信号转导反应中发挥着重要作用[21]。LOX、AOC以及COI1是茉莉酸防御途径中3个关键基因。LOX是茉莉酸合成的重要限速酶,AOC可催化产生茉莉酸的前体OPDA。COI1是茉莉酸信号途径的关键调控基因[22]。水杨酸、茉莉酸信号途径的协同和拮抗作用,不仅体现在二者的含量水平上,也体现在这2个途径相关基因的表达量上。例如姚新建[23]研究发现抗性小麦品系35-E4和敏感品系35-A20被禾谷缢管蚜取食后,其水杨酸和茉莉酸信号途径中相关基因（PAL、LOX、NPR）的表达量均显著提高,但是表达模式存在差异,抗性品系35-E4中相关基因的表达量高于敏感品系35-A20。桃蚜在取食拟南芥后能够诱导植株体内水杨酸（SA）信号途径上的相关基因PR1和PR2的积累[24],却能造成茉莉酸调控的相关基因（LOX-1、LOX及PDF1.2）在较低水平表达[25]。Studham等[26]发现与感蚜大豆品种相比,抗蚜大豆品种在大豆蚜虫取食后,水杨酸途径基因PR1、PAD4等表达量在6 h就发生了显著提高,而感蚜品种在12 h表达量才显著提高,抗蚜大豆品种茉莉酸途径基因LOX表达量在12 h显著提高,而感蚜品种茉莉酸途径基因表达量基本无显著提高。本研究结果也显示,桃蚜为害后抗、感蚜辣椒品种水杨酸信号途径基因PR1、EDS5的表达量均显著提高,并且抗蚜品种ZDC的表达量在为害24 h内显著高于感蚜品种,抗蚜品种中茉莉酸信号途径基因LOX2、AOC在为害48 h内也比为害前显著提高,但这2个基因在感蚜辣椒品种中却被显著抑制,表明抗蚜辣椒被为害后能够协同水杨酸、茉莉酸信号途径基因的表达,而抗蚜辣椒被为害后这2个途径基因的表达表现出拮抗效应,同时也说明水杨酸、茉莉酸含量的变化趋势在这2个途径的基因表达水平上得到了相互验证。
本研究仅从水杨酸、茉莉酸含量、部分相关基因表达量的差异初步探讨了这2个信号途径与辣椒抗蚜性的相关性,后续研究应挖掘和验证更多与辣椒抗蚜性相关的水杨酸、茉莉酸信号途径相关的基因、生化酶和次生代谢物质,以期全面、深入地阐明辣椒品种的抗蚜性机理,为抗虫辣椒品种的创制和分子设计育种奠定理论基础。