钙离子（Ca2+）是一种广泛存在于植物中的重要的第二信使,在植物的生长发育和胁迫响应的信号转导中发挥着重要的作用。钙调蛋白（Calmodulin,CaM）作为植物中重要的钙离子（Ca2+）结合蛋白之一,广泛存在于植物当中。CaM在细胞中主要负责感知Ca2+浓度变化,进而达到传递Ca2+信号的目的,从而在诸多生理生化调节过程中扮演重要的角色[1]。Ca2+-CaM信号系统在植物调控抗病抗逆过程中起着重要作用,参与活性氧的产生[2]、过敏性坏死反应[3]、蛋白质磷酸化过程及PR基因表达[4]的调节。
目前,植物中已经鉴定出90多个转录因子为Ca2+/CaM结合蛋白,其中包括CAMTA、MYB、WRKY、NAC、bZIP等基因家族[5,6,7,8,9]。钙调蛋白结合的转录激活子（CaM-binding transcription activator,CAMTA）是一类能够与CaM结合的转录因子[4, 10-11],广泛存在于植物中,在生长发育、生物胁迫和非生物胁迫响应,特别是在冷胁迫方面起重要作用。模式植物拟南芥中研究表明AtCAMTA3具有包括CBF2在内的10个相互作用因子,正调控参与冷应激基因CBF2的表达[12],AtCAMTA1和AtCAMTA3双突变体对冷冻的耐受性明显降低[13]。玉米中研究表明ZmCAMTA4a、ZmCAMTA7a和ZmCAMTA7b通过冷胁迫处理在芽中显著上调表达,只有ZmCAMTA4a在根中受冷胁迫诱导表达[14]。
巴西橡胶树是目前商业天然橡胶的重要来源,在生产过程中受到多种胁迫威胁,其中低温寒害是我国作为非传统植胶区面临的最大危害。低温会引起橡胶树长时间排胶,形成“长流”现象。“长流”易诱发橡胶树发生死皮,不利于天然橡胶的高产、稳产。在模式植物拟南芥中的研究表明,CAMTA基因家族成员参与了低温胁迫的应答过程并调控相关冷应激基因的表达。而在橡胶树中并未见相关研究报道,因而对于橡胶树CAMTA基因研究有助于揭示CAMTA基因在橡胶树低温胁迫响应中的作用,所以了解橡胶树抗寒机制具有重要的意义。本文以橡胶树基因组和转录组数据为基础,全面鉴定了橡胶树8个CAMTA基因家族成员,利用生物信息学方法分析CAMTA家族成员的基因结构、保守结构域、启动子元件、亚细胞定位、蛋白质的理化性质、家族成员的系统进化和表达水平。本研究将为进一步深入解析橡胶树CAMTA基因功能奠定重要的基础。
1 材料与方法
1.1 HbCAMTA基因家族成员全基因组鉴定
参考PlantTFdb提供的CAMTA转录因子家族定义规则（http://planttfdb.gao-lab.org/help_famschema.php）,获得用于该家族成员鉴定的DNA结合域CG1（PF03859）,然后从PFAM数据库（http://pfam.xfam.org/）下载该结合域的隐马尔可夫模型（hidden Markov model, HMM）文件,利用HMMER3.3（http://hmmer.org/）程序搜索橡胶树基因组数据库中所有蛋白序列,从全基因组水平预测橡胶树所有CAMTA基因家族成员。同时,从PlantTFdb数据库下载拟南芥CAMTA蛋白序列 （ AtCAMTA1 ：AT5G09410.1、AT5G09410.2、AT5G09410.3;AtCAMTA2：AT5G64220.1、AT5G64220.2;AtCAMTA3 ：AT2G22300.1、AT2G22300.2;AtCAMTA4：AT1G67310.1;AtCAMTA5 ：AT4G16150.1;AtCAMTA6：AT3G16940.1 ） 作为参考序列,采用blastp程序到HeveaDB数据库（http://hevea.catas.cn/home/index）进行比对检索同源基因。将2种方法得到的基因集进行去冗余后,进一步通过NCBI的Batch Web CD-search Tool （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）进行保守结构域分析,最终将含有该家族典型的结构域的蛋白序列鉴定为橡胶树CAMTA家族成员（HbCAMTA）。
1.2 HbCAMTA基因家族成员基本理化性质预测
利用在线网站Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）预测HbCAMTA的亚细胞定位;利用在线工具ExPASy ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）计算蛋白质的等电点和分子量。
1.3 HbCAMTA基因结构、保守结构域和Motif的分析
根据橡胶树基因组的注释信息,利用TBtools（https://github.com/CJ-Chen/TBtools）绘制HbCAMTA基因结构图;利用NCBI Batch CD- search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ bwrpsb/bwrpsb.cgi）搜索序列保守结构域,然后通过IBS （http://ibs.biocuckoo.org/）进行图形化展示;利用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）在线服务预测CAMTA家族基因的保守motif。
1.4 多序列联配和系统进化分析
从PlantTFdb（http://planttfdb.gao-lab.org/index.php）数据库和NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库下载拟南芥、蓖麻、木薯、胡杨、毛果杨、麻风树和亚麻的CAMTA蛋白序列与HbCAMTA组成分析蛋白序列集,先用Cluster软件进行多序列比对,再利用MEGA X软件采用邻接法（neighbor-joining method,NJ）进行系统进化树构建,bootstrap取1 000。
1.5 调控HbCAMTA基因的miRNA预测
通过psRNATarget在线软件（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）对调控橡胶树CAMTA基因家族成员的miRNA进行预测,设定参数Expect值为3.5,UPE值为15。预测可能参与调控HbCAMTA的miRNA。
1.6 HbCAMTA家族成员表达分析
利用本实验室已有的Solexa转录组数据库,对不同组织、乙烯处理不同时间、低温胁迫处理不同时间和叶片不同发育时期的HbCAMTA基因家族成员的表达模式进行分析,并以热图形式对结果进行展示。
1.7 HbCAMTA家族成员启动子顺式作用元件分析
截取HbCAMTA转录起始位点上游2 kb的序列作为启动子序列进行分析,利用在线软件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测启动子序列的顺式作用元件,通过TBtools软件对预测的结果进行可视化展示。
2 结果与分析
2.1 HbCAMTA家族成员鉴定与理化性质分析
用隐马尔可夫模型预测得到8个橡胶树候选CAMTA基因家族成员,利用蛋白序列同源比对获得候选HbCAMTA基因家族成员14个,去冗余后共16个,进一步通过保守结构域分析,最终鉴定获得8个橡胶树CAMTA成员基因,分别命名为HbCAMTA1-8。橡胶树CAMTA编码的蛋白序列长度基本相似,在923~1086个氨基酸之间,HbCAMTA5编码的蛋白序列最长,达到了1086个氨基酸,而HbCAMTA1编码的蛋白序列最短,只有923个氨基酸。利用ExPASy ProtParam在线工具对橡胶树CAMTA基因编码蛋白的理化性质进行分析,结果表明HbCAMTA蛋白的理化特性具有多样性,其分子量在104.34~121.99 kD之间,等电点在5.32~7.83之间,其中7个HbCAMTA蛋白等电点小于7.0,只有HbCAMTA2的等电点大于7,说明多数HbCAMTA基因编码弱酸性蛋白（表1）。亚细胞定位的预测结果显示所有CAMTA蛋白均不含信号肽,定位在细胞核。亲水性平均系数是衡量蛋白亲疏水性的重要指标,预测结果显示8个橡胶树HbCAMTA蛋白的亲水性平均系数在-0.574~-0.384之间,表明橡胶树所有CAMTAs蛋白都是亲水性蛋白。
表1 HbCAMTA基因的理化性质分析Tab. 1 Physicochemical properties of HbCAMTAs |
| 基因名称 Gene name | 基因ID Gene ID | 内含子 数目 Intron number | 蛋白序列长度 Protein length/aa | 分子量 Molecular weigh/kD | 等电点 Isoelectric point | 结构域预测 Predicted pfam domain | 亚细胞定位 Subcellular prediction | 总平均疏水性 Grand average of hydropathicity | 信号肽 预测 Singal petides |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| HbCAMTA1 | scaffold0625_117727 | 12 | 923 | 104.34 | 6.45 | CG-1 domain | Nucleus | ‒0.439 | NA |
| HbCAMTA2 | scaffold0703_610088 | 11 | 991 | 111.30 | 7.83 | CG-1 domain | Nucleus | ‒0.522 | NA |
| HbCAMTA3 | scaffold0010_4040802 | 12 | 1069 | 120.85 | 5.63 | CG-1 domain | Nucleus | ‒0.546 | NA |
| HbCAMTA4 | scaffold0824_240435 | 12 | 983 | 110.41 | 5.32 | CG-1 domain | Nucleus | ‒0.574 | NA |
| HbCAMTA5 | scaffold0444_896392 | 12 | 1086 | 121.99 | 5.92 | CG-1 domain | Nucleus | ‒0.53 | NA |
| HbCAMTA6 | scaffold0711_36887 | 12 | 974 | 109.51 | 5.92 | CG-1 domain | Nucleus | ‒0.533 | NA |
| HbCAMTA7 | scaffold0624_160516 | 12 | 928 | 104.70 | 6.42 | CG-1 domain | Nucleus | ‒0.384 | NA |
| HbCAMTA8 | scaffold0909_393686 | 12 | 1068 | 119.94 | 5.46 | CG-1 domain | Nucleus | ‒0.502 | NA |
2.2 HbCAMTA基因结构和保守结构域分析
根据Tang等[15]发表的基因组结构注释信息,利用TBtools软件分析HbCAMTA家族成员的基因结构并绘制该基因家族的基因结构图（图1）,我们发现鉴定到HbCAMTA成员均含有11~12个内含子不等。HbCAMTA1和HbCAMTA7, HbCAMTA3和HbCAMTA8,HbCAMTA4和HbCAMTA6组成了3个同源基因对,每个同源基因对含有相同的外显子数量和内含子数量,且每个外显子长度相似,而内含子长度差异明显,主要体现在第1个和第3个内含子,同源基因对之间在基因结构上具有较高的相似性,暗示着CAMTA基因结构具有保守性。保守结构域分析表明,HbCAMTA1、HbCAMTA2、HbCAMTA4、HbCAMTA6、HbCAMTA8五个基因均含有保守的CG-1结构域、IQ结构域、Ank_2结构域和TIG结构域,HbCAMTA3含有保守的CG-1结构域、Ank_2结构域和TIG结构域,不含有IQ结构域,HbCAMTA5含有保守的CG-1结构域、IQ结构域和TIG结构域,不含有Ank_2结构域,HbCAMTA7含有保守的CG-1结构域、IQ结构域和ANKYR结构域,不含有TIG结构域（图2）。
2.3 HbCAMTA家族成员的保守基序分析
利用在线工具MEME Suite 5.1.1对HbCAMTA蛋白的保守基序进行分析的结果显示,HbCAMTA蛋白包含了10个保守的基序,分别命名为Motif 1-10。在10个基序中,Motif 6是未知的,Pfam数据库未能找到对应结构域,该基序的功能还有待进一步的实验证明。Motif 1、Motif 4和Motif 10与CG-1结构域相关,而Motif 3与ANK结构域相关。Motif 2和Motif 7与IQ结构域相关,而Motif 5和Motif 8与TIG结构域相关。图3显示了所有已确定的基序的序列标志图。
2.4 HbCAMTA家族成员进化分析
从PlantTFdb和NCBI数据库分别下载木薯（6个）、蓖麻（5个）、胡杨（7个）、毛果杨（7个）、麻风树（4个）、拟南芥（6个）和亚麻（9个）的CAMTA氨基酸序列,结合本研究鉴定到的8个橡胶树CAMTA氨基酸序列,组成共计52个植物CAMTA蛋白的序列集,利用MEGA X构建系统进化树,结果如图4显示,CAMTA基因家族可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4个亚组。HbCAMTA家族成员在4个亚组均有分布,且在同一分枝上与木薯MeCAMTA基因聚在一起,这与物种系统进化上橡胶与木薯亲缘关系最近相一致。Ⅰ亚组主要包括HbCAMTA4、MeCAMTA4、AtCAMTA4等;Ⅱ亚组主要包括HbCAMTA1、HbCAMTA7、MeCAMTA1、AtCAMTA5、AtCAMTA6等;Ⅲ亚组主要包括HbCAMTA2、MeCAMTA2等;Ⅳ亚组主要包括HbCAMTA3、HbCAMTA8、HbCAMTA5、MeCAMTA3、MeCAMTA5、AtCAMTA1、AtCAMTA2、AtCAMTA3等。另外,系统进化显示存在HbCAMTA1和HbCAMTA7,HbCAMTA3和HbCAMTA8,HbCAMTA4和HbCAMTA6三个同源基因对,这与基因结构和序列同源性分析结果一致。
图4 CAMTA家族基因系统进化树拟南芥：AtCAMTA1-6;橡胶树：HbCAMTA1-8;蓖麻：RCOM_0213350、RCOM_0999870、RCOM_1002900、RCOM_1079700、RCOM_1296350;毛果杨：PtCAMTA1-7;胡杨：CCG000518.1、CCG020006.1、CCG020717.1、CCG023491.1、CCG025222.1、CCG025313.1、CCG031532.1;木薯：MeCAMTA1-6;亚麻：LuCAMTA1-9;麻风树：JCGZ_19069、JCGZ_18971、JCGZ_24032、JCGZ_20177。 Fig. 4 Phylogenetic tree of CAMTA family |
2.5 调控HbCAMTA基因的miRNA分析
利用在线软件psRNATarget,以HbCAMTA 基因的cDNA序列作为靶基因,对植物的small RNA数据库进行检索,结果见表2,HbCAMTA基因家族成员均有3个及以上的miRNA的结合位点。HbCAMTA6只有3个miRNA的结合位点,而HbCAMTA2和HbCAMTA8各有10个miRNA的结合位点。HbCAMTA3受到9个miRNA调控,其中最多的是属于miR159家族的成员。结果暗示了miRNA可能在参与调控HbCAMTA的表达方面具有重要作用。
表2 调控HbCAMTA家族成员的miRNA预测Tab. 2 Predicted miRNA of HbCAMTAs |
| 基因名Gene name | miRNA登录号miRNA_Acc. | 期望值Expectation | 抑制性Inhibition | 多样性Multiplicity |
|---|---|---|---|---|
| HbCAMTA1 | gma-miR4347 | 2.5 | Cleavage | 1 |
| hvu-miR6190 | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| ppt-miR1219d | 2.5 | Cleavage | 1 | |
| sly-miR6024 | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| stu-miR6024-3p | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| HbCAMTA2 | ata-miR2275c-3p | 3.0 | Cleavage | 1 |
| ata-miR9674b-3p | 2.5 | Cleavage | 1 | |
| ath-miR2937 | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| bdi-miR2275c | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| mes-miR2275 | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| mes-miR2950 | 2.0 | Cleavage | 1 | |
| osa-miR2275a | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| osa-miR2275b | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| tae-miR2275-3p | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| vvi-miR2950-5p | 2.0 | Cleavage | 1 | |
| HbCAMTA3 | aly-miR4244 | 3.0 | Cleavage | 1 |
| aqc-miR529 | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| cme-miR159b | 2.5 | Cleavage | 1 | |
| gma-miR5371-3p | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| hbr-miR6174 | 2.5 | Translation | 1 | |
| osa-miR159c | 2.5 | Cleavage | 1 | |
| osa-miR159d | 2.5 | Cleavage | 1 | |
| osa-miR159e | 2.5 | Cleavage | 1 | |
| sly-miR9474-5p | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| HbCAMTA4 | aly-miR156g-3p | 2.5 | Cleavage | 1 |
| aly-miR3437-5p | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| bcy-miR529 | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| bgy-miR529 | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| osa-miR2868 | 3.0 | Translation | 1 | |
| zma-miR399e-5p | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| HbCAMTA5 | aly-miR828-5p | 3.0 | Translation | 1 |
| ath-miR828 | 3.0 | Translation | 1 | |
| mdm-miR159c | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| mtr-miR2673a | 3.0 | Translation | 1 | |
| mtr-miR2673b | 3.0 | Translation | 1 | |
| HbCAMTA6 | aly-miR156g-3p | 2.5 | Cleavage | 1 |
| aly-miR4230 | 2.5 | Cleavage | 1 | |
| aly-miR4238 | 3.0 | Cleavage | 2 | |
| HbCAMTA7 | csi-miR3950 | 3.0 | Cleavage | 1 |
| gma-miR4347 | 2.5 | Cleavage | 1 | |
| hme-miR-316 | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| osa-miR169q | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| stu-miR8022 | 2.0 | Cleavage | 1 | |
| HbCAMTA8 | aly-miR774b-5p | 3.0 | Cleavage | 1 |
| gma-miR5371-3p | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| mtr-miR2600b | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| mtr-miR2600c | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| mtr-miR2600d | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| mtr-miR2600e | 3.0 | Cleavage | 1 | |
| stu-miR8024a-3p | 2.5 | Cleavage | 2 | |
| stu-miR8024a-3p | 3.0 | Translation | 2 | |
| stu-miR8024b | 2.5 | Cleavage | 2 | |
| stu-miR8024b | 3.0 | Translation | 2 |
2.6 HbCAMTA家族成员转录表达分析
为了解橡胶树CAMTA基因的表达特性,我们利用本实验室已有的Solexa转录组测序数据,对不同组织、叶片不同发育时期、低温胁迫处理以及乙烯处理胶乳中的家族成员进行表达分析。结果显示（图5）,HbCAMTA1是橡胶树CAMTA家族主要功能基因,在所检测的7个组织（胶乳、叶片、根、雄花、雌花、树皮、种子）、叶片的4个发育时期（古铜期、变色期、淡绿期、成熟期）、低温胁迫处理3个时间点以及乙烯处理4个时间点均有表达,且整体表达水平较高。特别是在叶片发育过程中和低温胁迫处理下明显上调表达,推测该基因为组成型表达,且在叶片发育过程中和响应低温胁迫起重要作用。HbCAMTA3在种子中表达水平最高,其次是树皮中,其受低温胁迫诱导明显地持续上调表达且最显著。在乙烯处理胶乳中HbCAMTA整体表达水平相对较低,HbCAMTA1呈现下调表达的趋势,HbCAMTA2和HbCAMTA8呈现明显的上调表达。低温胁迫下,HbCAMTA1、HbCAMTA2、HbCAMTA3、HbCAMTA4、HbCAMTA5、HbCAMTA6、HbCAMTA8均受低温诱导上调表达。HbCAMTA7基因在所有检测样品中表达水平均为最低甚至不表达,从该结果可以推测HbCAMTA1和HbCAMTA7在进化过程中出现了功能分化,HbCAMTA1在橡胶树生长发育等方面具有重要功能,而HbCAMTA7出现了去功能化。
图5 HbCAMTA在不同组织、乙烯处理后不同时间点、低温（4 ℃）胁迫处理不同时间点和叶片不同发育时期的表达水平分析Latex：胶乳;Leaf：叶片;Root：根;Bark：树皮;Female flower：雌花;Male flower：雄花;Seed：种子;ET-0h：乙烯处理0 h;ET-3h：乙烯处理3 h;ET-12h：乙烯处理12 h;ET-24h：乙烯处理24 h;Bronzite：古铜期;Changecolor：变色期;Palegreen：淡绿期;Mature：成熟期;4C-0h：低温胁迫(4 ℃)处理0 h;4C-6 h：低温胁迫(4 ℃)处理6 h;4C-12 h：低温胁迫(4 ℃)处理12 h。 Fig. 5 Analysis of expression levels of HbCAMTAs in tissue specific, ethylene treated, low temperature treated and leaves at different developmental stages |
综上结果表明,橡胶树HbCAMTA基因家族成员在组织表达、乙烯处理的响应和叶片不同发育时期的表达方面存在明显差异,反映了橡胶树HbCAMTA基因功能的多样性,而在低温胁迫的表达方面具有一定的一致性。
2.7 HbCAMTA家族成员启动子顺式作用元件的分析
分别截取8个HbCAMTA基因转录起始位点上游2000 bp序列作为启动子区序列,利用PlantCARE在线工具对启动子区上可能存在的顺式作用元件进行预测,得到位于启动子区域的多种顺式作用元件（图6）,包括脱落酸响应元件（14个）、逆境胁迫诱导（2个）、赤霉素诱导（8个）、茉莉酸甲酯响应元件（18个）、光响应元件（58个）、水杨酸响应元件（2个）、干旱响应元件（3个）、厌氧诱导元件（14个）等,表明HbCAMTA参与多种植物激素和环境胁迫应答。HbCAMTA中的6个基因（HbCAMTA1、HbCAMTA2、HbCAMTA3、HbCAMTA4、HbCAMTA7和HbCAMTA8）的启动子区上拥有茉莉酸甲酯响应元件。除了HbCAMTA7之外,HbCAMTA中的7个基因在启动子区上都有厌氧诱导元件。所有的HbCAMTA都拥有光响应元件。HbCAMTA2、HbCAMTA4、HbCAMTA5、HbCAMTA7和HbCAMTA8五个基因拥有脱落酸响应元件;HbCAMTA2和HbCAMTA5拥有干旱响应元件;HbCAMTA6和HbCAMTA7拥有水杨酸响应元件。
3 讨论
CaM是一种重要的Ca2+结合蛋白,通过生物化学、细胞生物学和分子生物学手段证明具有明确的生物学作用,是一种与多种靶蛋白结合的调节因子[11, 16-17]。CAMTA、WRKY、MYB和bZIP等转录因子已经被证明通过与CaMs/CMLs相互作用来响应不同的生物和非生物胁迫[18,19,20]。CAMTA转录因子在钙/钙调素转导信号通路和CAMTA介导的基因转录调控中发挥关键作用,这是植物对外源激素和非生物胁迫做出反应的关键过程[21,22,23,24]。橡胶树发育具有明显的特异性（乳管）,生产过程受到多种生物及非生物胁迫以及激素刺激,推测CAMTA可能发挥重要生物学功能。2016年Tang等[15]完成橡胶树基因组测序,使得我们能够对HbCAMTA进行全面地分析。在本研究中,我们对橡胶树的CAMTA基因进行了全基因组水平的鉴定,并从理化性质、基因结构、系统进化、调控因子以及转录表达模式等方面进行分析。
橡胶树中鉴定到8个CAMTA基因,略多于拟南芥（6个）[25]、木薯（6个）[26]和毛果杨（7个）[27]的,而比同属金虎尾目下的亚麻（9个）[28]少一个。我们采用基于隐马尔可夫模型的HMMER软件和blastp程序从全基因组水平进行鉴定橡胶树的CAMTA成员,并取二者输出的结果交集进一步进行保守结构域分析,最终将含有CG-1结构域的确认橡胶树的CAMTA成员。HMMER软件是基于隐马尔可夫模型构建的HMM文件,利用概率推理方法和隐马尔可夫模型（HMM）进行同源搜索,常用于同源蛋白的识别。同源过度扩展[29]和收敛进化[30]是序列比对程序错误地识别蛋白质同源关系的重要因素,Mistry等[31]使用Bateman等[32]收集的配置文件-HMMs测试HMMER3分配蛋白质序列到同源家族的准确性,结果表明假阳性率在1%~2%之间。同时,我们用拟南芥的CAMTA家族成员蛋白序列进行blastp,然后取HMMER和blastp输出结果的交集,可有效避免因为程序算法引起的假阳性结果和假阴性结果,并通过保守结构域分析再次验证了鉴定结果的可靠性。
基因结构分析发现橡胶树CAMTA同源基因对具有较高的相似性,暗示着橡胶树同拟南芥、毛果杨、玉米和木薯等物种一样表现为基因结构具有较高的保守性[14, 25-27]。内含子相对位置在同一分支中也具有保守性,而不同分支中则存在差异。系统进化分析显示CAMTA可以分为4个亚组,其他物种一般分为4个或3个亚组,例如亚麻（3个）[28]、玉米（4个）[14]、毛果杨（3个）[27]、小麦（3个）[33],拟南芥CAMTA在其他的物种系统进化分组中的分布与在本次系统进化分组中的分布是一致的,因此橡胶树CAMTA分为4个亚组具有合理性。橡胶树和木薯的CAMTA高度同源具有较近的亲缘关系,这与二者同属大戟科植物,进化距离较近相一致。HbCAMTA3和MeCAMTA3处在同一分枝上并与HbCAMTA5、HbCAMTA8、AtCAMTA1、AtCAMTA2和AtCAMTA3处在同一个亚组。该分支中的拟南芥CAMTA成员生物学功能已经进行了充分研究,AtCAMTA3是一个响应低温胁迫的转录因子,在低温胁迫下通过正调控在植物低温胁迫发挥重要作用的CBF2基因[21]和调控水杨酸（salicylic acid, SA）合成[13]发挥作用,而橡胶树中HbCAMTA3受低温胁迫诱导显著持续上调表达,推测HbCAMTA3可能通过类似AtCAMTA3的生化反应在橡胶树的低温胁迫中发挥作用。同时AtCAMTA3还是一个盐胁迫[34]响应因子,暗示了HbCAMTA3可能也具有功能多样性。Galon等[10]通过基因芯片进行研究发现, AtCAMTA1突变体中有17个与生长素相关的基因表达上调,AtCAMTA1突变体和RNAi介导的CAMTA1抑制型转基因株系的下胚轴伸长都表现出对生长素超敏的表型,认为拟南芥AtCAMTA1参与生长素信号传导途径并调节植物的生长发育。Yang等[35]在番茄中发现7个CAMTA基因在果实发育和成熟过程中差异表达,可能参与番茄果实的发育和成熟过程的调控,推测橡胶树中CAMTA同源基因参与了组织和器官的生长发育过程。拟南芥中的研究表明AtCAMTA2是 AtALMT1（铝激活的苹果酸转运蛋白1）的激活转录因子[36],AtCAMTA3在SA介导的植物防卫反应中发挥负向调节作用[23, 37-38],AtCAMTA1、AtCAMTA2和AtCAMTA3 丧失阻遏作用能诱导植物防御基因和系统抗性的启动[39],木薯中MeCAMTA3通过调控木薯-黄单胞菌相互作用过程中的多种免疫反应调节木薯细菌性枯萎病的抗性[26]。因此,我们推测橡胶树HbCAMTA3、HbCAMTA5和HbCAMTA8基因具有功能多样性,可能参与激素信号转导、生长发育调节、低温胁迫响应、盐胁迫和防卫反应等过程,而其中HbCAMTA3基因是我们进一步研究橡胶树响应低温胁迫分子机制的重要候选基因之一。本研究首次对橡胶树中CAMTA基因进行系统分析,将为后续进一步研究HbCAMTA基因在橡胶树中的功能奠定基础。