橡胶树[Hevea brasiliensis (Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg],又称三叶橡胶树或巴西橡胶树,大戟科橡胶树属落叶乔木,原产于亚马逊河流域。中国植胶区主要分布于海南、云南和广东地区。由于橡胶树合成的天然橡胶综合性能优异,迄今无法被人工合成橡胶完全替代,是重要的战略物资和工业原料[1,2,3]。在天然橡胶的生产过程中,长期使用乙烯作为胶乳增产刺激剂[4]。虽然关于外源乙烯刺激橡胶树胶乳增产的研究较多[5,6,7,8,9],但对于橡胶树树皮内源乙烯生物合成通路中1-氨基环丙烷基-1-羧酸（ACC）氧化酶（ACO）基因的研究却很少,尚未见关于橡胶树ACO酶活方面的研究报道。
乙烯生物合成途径的调控较为复杂,涉及很多因素[7],其中ACO基因家族包含了众多成员,受一定的外界和内在因素影响,从而改变基因表达、蛋白量与酶活性,最终调控乙烯的产生[10,11]。ACO氧化ACC生成乙烯是乙烯合成途径的最后一步[12],近年来许多研究显示,在很多植物生理活动中ACO基因的表达能够被快速地诱导,表明ACO可能是调控乙烯生物合成的一个关键酶[5,6]。在橡胶树中,研究发现在树皮上施用外源乙烯或通过割胶、机械伤害等在树皮中产生的内源乙烯均可刺激胶乳产量[13,14];本课题组前期基于转录组分析发现,橡胶树乳管中的内源乙烯的合成能力很弱,但却存在活跃的乙烯信号传递与应答通路,从源头上回答了外源乙烯显著刺激胶乳产量的机制[15]。基于以上信息,推测橡胶树树皮中的ACO酶可能通过调控树皮中的乙烯生物合成影响橡胶树的产排胶。鉴于此,本研究拟克隆橡胶树树皮中乙烯生物合成关键酶ACO基因（HbACO）,并对其进行组织表达特性、不同割胶月份表达、原核表达及酶活性分析,为今后深入研究橡胶树ACO基因的表达调控与产胶关系提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 采样地 采样地点位于海南省澄迈县的红星农场（19.837°N,110.016°E）。该采样点位于海南岛的北部,属热带海洋性季风气候。降水主要集中在5—10月,其中8月台风季时降水量及相对湿度达到峰值,而11—12月几乎无降雨;5—10月的平均温度浮动不大,维持在30 ℃左右,11月开始下降,12月最低,可低至15 ℃以下。
1.1.2 植物材料 巴西橡胶树品种为‘热研7-33-97’,树龄9 a,第2年割胶,选取5株长势和树围基本一致的橡胶树,分别于2019年5月24日、6月27日、8月6日、8月27日、9月25日、10月25日、11月23日和12月25日上午6：00割胶,进行不同季节的橡胶树树皮样品采集。采样前,撕去割胶口上附着的胶线,切割树皮后立即装入50 mL无RNA酶的离心管中,盖紧瓶盖,液氮中保存待用。记录每次采样时的天气数据,分析发现采样期间的降水量和温度变化情况。
1.1.3 质粒及菌株 原核表达载体pNC-ET28购自海南壹田生物科技有限公司;pEASY®-Blunt克隆载体、Trans1-T1感受态细胞及BL21感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司;pET28a质粒为本实验室保存。
1.1.4 试剂 ACC购自Sigma公司;通用植物总RNA大量提取试剂盒（离心柱型）购自北京百泰克生物技术有限公司;通用型DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;TransStart® FastPfu DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司;反转录试剂盒PrimeScript™ RT reagent Kit购自TaKaRa公司;Nimble Cloning原核表达系统试剂盒购自海南壹田生物科技有限公司;质粒提取试剂盒购自OMEGA公司;FastStart Essential DNA Green Master试剂盒购自Roche公司;镍离子螯合磁珠购自海狸纳米科技（苏州）有限公司;其他常规试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 橡胶树树皮总RNA提取及反转录 根据通用植物总RNA大量提取试剂盒（离心柱型）说明书,提取不同季节采集的橡胶树树皮总RNA,经电泳检测条带完整无降解后,于-80 ℃保存备用。利用反转录试剂盒将总RNA反转录合成cDNA,并置于-80 ℃保存待用。
表1 基于基因组和转录组预测的橡胶树ACO基因家族序列信息Tab. 1 H. brasiliensis ACO gene family predicted by Hevea genome and transcriptome sequences |
| 基因名称 Gene name | Scaffold序列号 Scaffold number | CDS长度 CDS length/bp |
|---|---|---|
| HbACO1 | scaffold0113_1714149 | 939 |
| HbACO2 | scaffold1057_27974 | 957 |
| HbACO3 | scaffold2408_724 | 957 |
| HbACO4 | scaffold0371_1076732 | 936 |
| HbACO5 | scaffold0611_59152 | 936 |
| HbACO6 | scaffold1057_68935 | 927 |
| HbACO7 | scaffold0894_322678 | 921 |
| HbACO8 | scaffold0075_154737 | 939 |
表2 本研究所用引物及其序列Tab. 2 Primer and sequences used in this study |
| 引物名称 Primer name | 引物序列（5°-3°） Primer sequence (5°-3°) | 用途 Purpose |
|---|---|---|
| HbACO1-F | ACTTCATTTCATACACATCAGAGACA | CDS扩增 |
| HbACO1-R | CTTAGGACAATTATATCCCAAAGGTG | |
| HbACO2-F | GCTGTCACCATGGCAAAGATCAAA | |
| HbACO2-R | CAGAGAACAAACTGATGACAAAGA | |
| HbACO3-F | ATGGAGTTTCCAGTAATTAACCTT | |
| HbACO3-R | TTAAGCTGTTGCAATAGGACCCCA | |
| HbACO4-F | TCTCTCTTAATTGTATTCCTTTCCTA | |
| HbACO4-R | CTTTCAGGATTATTGAGGCAAATCTT | |
| HbACO5-F | ATGGCAATTCCAGTGATTGAT | |
| HbACO5-R | TCACACAGCCCTCACAGCTTG | |
| HbACO6-F | ATGGAGTTCCCGGTCATTAAC | |
| HbACO6-R | AGCTGTAGCAATGGGAACCAA | |
| HbACO7-F | ACAATCTAAACTAGAAAGAAGAGAAGG | |
| HbACO7-R | AAGGAAGAATTATTGGAGCTTGAGAAT | |
| HbACO8-F | AGAAAATGGAGACCTTCCCTGTTA | |
| HbACO8-R | CACCACTAATCAGTAAACTCATCA | |
| M13-F | TGTAAAACGACGGCCAGT | 菌落PCR |
| M13-R | CAGGAAACAGCTATGACC | |
| pNC-ET- HbACO7-F | CCTGGTGCCGCGCGGCAGCATGGAGATACCAGTGATTGATTTTAGTG | 原核表达 |
| pNC-ET- HbACO7-R | GGTCTCAGCAGACCACAAGTTTAGACATAGAGACCGTTGTGCCC | |
| T7 | TAATACGACTCACTATAGGG | 原核表达 检测 |
| T7 ter | GCTAGTTATTGCTCAGCGG | |
| UBC2a-F | CATTTATGCGGATGGAAGCA | qRT-PCR 分析 (内参基因) |
| UBC2a-R | CAGGGGAGTTTGGATTTGGA | |
| HbACO7- qP-F | TGAGAACAGGAGCAAAATGATGG | qRT-PCR 分析 (HbACO7) |
| HbACO7- qP-R | TTCACCAACTGCTTTACTTTCTCC |
1.2.3 qRT-PCR分析 检测8次树皮样品的cDNA模板浓度,按荧光定量分析试剂盒的建议调整各个cDNA样品的使用浓度,尽量保证所有分析样品中包含大致相近的cDNA量。利用Premier 5.0软件,设计橡胶树树皮表达主要HbACO基因的qRT-PCR引物,委托北京六合华大基因科技有限公司合成（表2）。根据FastStart Essential DNA Green Master试剂盒说明书进行树皮主要HbACO基因的qRT-PCR分析,所得数据采用2-ΔΔCT法进行计算。
1.2.4 原核表达载体的构建及蛋白诱导表达 使用海南壹田生物科技有限公司的Nimble Cloning原核表达系统试剂盒,根据说明书将筛选出来的主要HbACO基因克隆到表达载体pNC-ET28上,并对构建好的重组表达载体pNC-ET28- HbACO进行测序鉴定。将pNC-ET28-HbACO和pET28a空载（对照）分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,挑单菌落接种于含有卡那霉素（100 mg/ mL）的LB液体培养基中,37 ℃（220 r/min）培养过夜,按1:100的比例扩大培养菌液至OD600=0.5~0.8。最后用浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达3.5 h后,于4 ℃离心收集菌体[16,17,18,19]。SDS-PAGE和Western Blot实验按照分子克隆实验指南进行[20]。用ddH2O重悬菌体,在超声破碎仪上破碎菌体,离心并取上清。蛋白经SDS-PAGE电泳后,通过半干转的方法将蛋白转移到硝酸基纤维素膜上,加入一抗（HbACO特异性抗体）,孵育2 h后加入二抗（羊抗小鼠IgG）孵育1 h,然后进行显色（或显影）并拍照。HbACO特异性抗体的制备是基于HbACOs基因家族氨基酸序列多重比对结果,选择高保守且预测免疫原性强的肽段（PKPDLIKGLR）,委托艾比玛特（Abmart）生物医药（上海）有限公司进行肽段合成和抗体制备（货号CL027249）。
1.2.5 ACO酶活测定 用100 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）重悬收集到的菌体,在超声波破碎仪上破碎菌体,离心并取上清,再用海狸公司的镍离子螯合磁珠纯化融合表达蛋白[18]。检测纯化后的融合蛋白浓度,稀释到适当浓度,取200 μL稀释后的溶液注入盛有1.8 mL酶反应液的20 mL进样瓶中。反应液成分：100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）,30 mmol/L抗坏血酸钠,30 mmol/L NaHCO3,1.0 mmol/L ACC,0.1 mmol/L FeSO4,10%甘油（V/V）。30 ℃水浴中密闭保温35 min后,抽取顶空气体（0.2 mL）,用GC-MS测定乙烯生成量[21,22,23,24,25]。
2 结果与分析
2.1 HbACOs基因家族的克隆及鉴定
表3 基因组预测与克隆的HbACOs基因家族的编码序列比对Tab. 3 Coding sequence alignment of the HbACOs family genes predicted by Hevea genome or cloned |
| 基因名称 Gene name | 序列来源 Sequence source | CDS度 CDS length /bp | 序列比对 Sequence alignment | |
|---|---|---|---|---|
| 单个碱基差别 Nucleobase difference | 氨基酸差别 Amino acid difference | |||
| HbACO1 | 本文克隆 | 939 | 5 | 5 |
| 基因组预测 | 939 | |||
| HbACO2 | 本文克隆 | 957 | 无 | 无 |
| 基因组预测 | 957 | |||
| HbACO3 | 本文克隆 | 956 | 1 | 无 |
| 基因组预测 | 956 | |||
| HbACO4 | 本文克隆 | 937 | 2 | 1 |
| 基因组预测 | 937 | |||
| HbACO5 | 本文克隆 | 936 | 2 | 1 |
| 基因组预测 | 936 | |||
| HbACO6 | 本文克隆 | 927 | 1 | 无 |
| 基因组预测 | 927 | |||
| HbACO7 | 本文克隆 | 921 | 无 | 无 |
| 基因组预测 | 921 | |||
| HbACO8 | 本文克隆 | 939 | 1 | 无 |
| 基因组预测 | 939 | |||
2.2 橡胶树树皮主要HbACOs基因的筛选
HbACOs基因在橡胶树不同组织中的表达情况显示（图2）,HbACOs基因家族所有基因在胶乳中都几乎不表达;HbACO1、HbACO5在不同组织中的表达量普遍比较低,一些组织甚至检测不到表达;HbACO3和HbACO8主要在叶片、花中表达;HbACO2在除叶片和胶乳外的其他组织中都有较高的表达;HbACO4在种子中的表达量高,而在其他组织中表达水平都很低,属于种子特异性表达基因;HbACO7在树皮和根中表达量都较高,而在其他组织中都几乎不表达;HbACO6在除胶乳外的6种组织中都有表达,其中树皮中的表达量最高。由图3可知,树皮中HbACO7的表达量最高,其次是HbACO6,最后是HbACO2,而其他4个HbACO基因的表达量很低或未表达。因此,推测HbACO7可能是橡胶树树皮中参与乙烯合成的主效ACO基因。
2.3 HbACO7基因表达的月份变化
为了研究HbACO7的表达量是否受外界环境的影响,以割胶季节5—12月的树皮总RNA的反转录产物为模板,通过qRT-PCR的方法检测HbACO7基因在不同割胶月份间的相对表达量。如图4所示,HbACO7表达量在整个割胶季中随月份呈现先升高后降低再升高的波动变化趋势。HbACO7在8月6日（7月底遇台风天气,导致原定的7月下旬割胶无法实施）的表达量最高,其次为8月27日,再次为12月25日、6月27日、10月25日和9月25日,最低为5月24日和11月23日。
2.4 HbACO7基因的原核表达及酶活测定
2.4.1 原核表达载体的构建及诱导表达 HbACO7基因cDNA编码序列长度为921 bp,编码306个氨基酸,预测蛋白分子量为34.8 kDa。将HbACO7基因的编码区连接到pNC-ET28载体上构建原核表达载体,将构建好并经测序比对验证的重组载体pNC-ET28-HbACO7转化大肠杆菌BL21感受态细胞。SDS-PAGE电泳结果表明（图5）,经IPTG诱导表达出一条略大于35 kDa的特异性蛋白条带,其大小与预测的HbACO7融合蛋白的大小（约为34.8 kDa）一致。Ni柱纯化获得的HbACO7融合蛋白与未纯化的目标蛋白大小一致。Western blot实验也显示诱导表达获得了HbACO7的融合表达蛋白（图6）。
图5 原核表达产物的SDS-PAGE分析M：预染蛋白质分子量标准;1：纯化的融合蛋白;2：大肠杆菌（pNC-ET28-HbACO7,IPTG诱导）;3：大肠杆菌（pNC-ET28,IPTG诱导）;4：大肠杆菌（pNC-ET28,未诱导）。 Fig. 5 Prokaryotic expression of HbACO7 fusion protein detected by SDS-PAGE M: Prestained protein molecular weight marker; 1: HbACO7 fusion protein purified by Beaver BeadsTM Nickel; 2: E. coli (pNC- ET28-HbACO7, IPTG induced); 3: E. coli (pNC-ET28, IPTG induced; 4: E. coli (pNC-ET28, un-induced). |
图6 HbACO7融合蛋白的Western Blot分析1：阴性对照（IPTG诱导的空载）;2：未纯化的融合蛋白;3：纯化的融合蛋白。 Fig. 6 Analysis of HbACO7 fusion protein by Western Blot 1: Negative control (IPTG-induced E. coli harboring the blank vector); 2: HbACO7 fusion protein without purification; 3: HbACO7 fusion protein purified by Beaver BeadsTM Nickel. |
3 讨论
乙烯能提高橡胶树的胶乳产量,因而对乙烯的生物合成途径的研究显得尤为关键。植物乙烯生物合成途径主要包括了3个反应：首先是甲硫氨酸在S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）催化下变成S-腺苷甲硫氨酸（SAM）,紧接着生成的SAM在ACC合成酶（ACS）的催化下生成乙烯的前体物质氨基环丙烷羧酸（ACC）,最后ACC被ACO氧化产生乙烯。乙烯生物合成途径的2个关键酶ACS和ACO在成熟的果实和衰老的花器官中均受诱导表达,参与调控乙烯的生物合成[12],有关ACS和ACO基因的研究对探索乙烯生物合成途径中的分子调控具有重要意义。在生化分子水平上,对ACS基因的研究取得比较大的进展,而在ACO基因的研究上相对较少,进展缓慢[6]。对橡胶树中ACO基因功能和其在乙烯生物合成途径中作用的研究,不仅有助于了解乙烯刺激刺激胶乳产量的机制,也有助于深入了解乙烯对植物的生理效应及调控机理,对乙烯响应外界刺激反应的分子机理研究也有借鉴意义。
基于上述文献报道,推测胶乳产量可能与乙烯生物合成途径的关键ACO基因家族的表达量相关。植物ACO基因具有明显的组织特异性表达模式[30]。收集天然橡胶的主要方式是通过割胶方式切断树皮乳管,让胶乳从乳管中流出,这个过程引致机械伤害,可在树皮组织中检测到乙烯的产生[4]。结合HbACOs基因家族在胶乳中几乎不表达的结果,推测橡胶树树皮组织是产生机械伤乙烯的重要场所,生成的乙烯又能扩散到树皮乳管中促进胶乳的产生和排出。由此,我们在研究HbACOs基因时,重点关注其在树皮中的表达量。本研究发现HbACO7基因在与产胶密切相关的橡胶树茎干树皮中的表达量最高,可能为树皮中参与乙烯生物合成的HbACOs家族的主效基因,而具体在树皮何种组织中表达有待于进一步的实验研究。进一步的研究发现,HbACO7基因的表达量在割胶季节的7个月份中变化幅度较大。分析7个月中的气象数据,发现5~10月份的平均温度变化不大,而降水量变化较大,特别是8月份的台风使降水量达到最大值,而这时的HbACO7基因表达量也处于一年中的最大值。因此,推测气象条件中的降水量是影响HbACO7基因表达量高低和内源乙烯产量的重要因子。另一方面,鉴于机械伤害可以明显诱导橡胶树树皮产生伤乙烯[13,14],推测台风天气造成的橡胶树机械损伤也可能也是HbACO7基因在8月份表达量高的另一个重要因素。此外,也可能是由于台风降水等天气导致胶农减少割胶次数,而影响HbACO7基因的表达。
为了验证HbACO7基因是否编码具有生理活性的ACO酶,本研究构建了该基因的原核表达重组载体pNC-ET28-HbACO7,并成功实现了其HbACO7融合蛋白的原核表达和纯化,并对该蛋白进行了酶活测定。结果显示,HbACO7融合蛋白具有明显的ACO酶催化活性,能体外催化ACC产生乙烯。因此,我们认为橡胶树树皮中表达的主要HbACO基因HbACO7具有体内催化乙烯生物合成的生理功能。