Transcriptome Analysis of Flowering Chinese Cabbage (Brassica campestris L. ssp. Chinensis (L.) var. utilis Tsen et Lee) Infected by Soft Rot Disease

ZENG Xiaoling; ZHAO Ruili; ZHONG Kaiqin; ZHU Chaohui; XIE Xinxin; WEN Qingfang

doi:10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.032

2021 , Vol. 42 >Issue 5: 1433 - 1439

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.032

Plant Protection & Bio-safety

Transcriptome Analysis of Flowering Chinese Cabbage (Brassica campestris L. ssp. Chinensis (L.) var. utilis Tsen et Lee) Infected by Soft Rot Disease

ZENG Xiaoling ¹ ,
ZHAO Ruili ¹ ,
ZHONG Kaiqin ¹ ,
ZHU Chaohui ¹ ,
XIE Xinxin ¹ ,
WEN Qingfang ^,²^,^*

Expand

1. Fuzhou Institute of Vegetable Science, Fuzhou, Fujian 350111, China
2. Crops Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou, Fujian 350013, China

* WEN Qingfang,E-mail: fjvrc@163.com。

Received date: 2020-04-20

Request revised date: 2020-07-03

Online published: 2021-05-25

Copyright

Copyright reserved © 2021. Office of Acta Agronomica Sinica All articles published represent the opinions of the authors, and do not reflect the official policy of the Chinese Medical Association or the Editorial Board, unless this is clearly specified.

Fold

Abstract

To explore the functional gene information in flowering Chinese cabbage (Brassica campestris L. ssp. Chinensis (L.) var. utilis Tsen et Lee) inoculated by soft rot disease, the transcriptome of flowering Chinese cabbage was sequenced by BGISEQ-500 high-throughput sequencing technology. The results showed that average obtained 47.27 M clean reads and the Q20 base was more than 95%. A total of 36 760 Unigene transcripts were detected, of which 35 327 were known and 1 433 were predicted. A total of 19 549 new transcripts were detected, the length of which was mainly between 300 and 2000 nt. Functional annotation results showed that 32 047 Unigene were annotated in NR database, among which Unigenes were annotated most on Brassica rapa ssp. Pekinensis. GO function was annotated with 12 588 Unigene. Kegg database was annotated with 18 583 Unigene, involving 137 metabolic pathways. A total of 21 776 differential expression genes (DEGs) were obtained, including 15 007 DEGs, 6 137 up-regulated genes and 8 870 down- regulated genes between the control and premorbid groups. There were 13 118 DEGs, 10 278 up-regulated genes and 2840 down-regulated genes between pre-onset and mid-onset. There were 11 293 DEGs, 1 790 up-regulated genes and 9503 down-regulated genes. Analysis of the DEGs Ven map showed that 5 110 genes were different in each group. Functional analysis of DEGs showed that the differentially expressed genes were involved in various life activities, such as ubiquitin degradation pathway, peroxisome pathway, photosynthetic carbon fixation pathway, glycolytic process pathway and so on. The results of this study would lay a foundation for further studies on the genome and molecular biology of resistance to soft rot of flowering Chinese cabbage.

Key words： flowering Chinese cabbage; soft rot; transcriptome; differentially expressed genes

Cite this article

ZENG Xiaoling , ZHAO Ruili , ZHONG Kaiqin , ZHU Chaohui , XIE Xinxin , WEN Qingfang . Transcriptome Analysis of Flowering Chinese Cabbage (Brassica campestris L. ssp. Chinensis (L.) var. utilis Tsen et Lee) Infected by Soft Rot Disease[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2021 , 42(5) : 1433 -1439 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.032

菜心（Brassica campestris L. ssp. Chinensis (L.) var. utilis Tsen et Lee）为十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种,又名菜薹,是中国南方的特产蔬菜之一。近年来,随着菜心栽培面积的扩大和重茬现象的出现,菜心病害逐年加重,其中细菌性软腐病是危害菜心的主要病害之一。蔬菜细菌性软腐病是由软腐欧文氏菌胡萝卜亚种（Erwinia carotovora ssp. carotovora, Ecc）引起的一种流行性死体营养型细菌病害,其病原菌可存于植物表面和土壤中,通过伤口或自然孔口进入植物体内,主要依靠Types II蛋白分泌系统合成和分泌水解酶降解植物细胞壁,使植物组织呈浸渍状^[1,2],主要侵染大白菜^[3]、魔芋^[4]、西葫芦^[5]等蔬菜。该病害发病较重时可造成蔬菜严重减产,而且在储藏运输过程中易造成腐烂,严重影响品质。目前,现有的蔬菜育种材料中具有抗软腐病的材料较少,且关于该病害的研究主要集中于物理防治^{[3-4, 6]}、转基因^[7,8]和分子标记^[9]等方面,而对于该病害的发病机理尚不清楚。因此,开展与软腐病抗性相关的功能基因的研究,对提高现有育种材料的抗软腐病能力、培育具有抗软腐病蔬菜新品种有重要的意义。

随着测序技术的发展,利用转录组分析植物功能基因的研究成果层出不穷。练冬梅等^[10]分析了冰菜盐胁迫下的转录组数据,筛选出8个与抗盐性相关的差异表达基因;王华等^[11]在转录组分析的基础上研究不同水分条件下杜鹃花转录因子的表达发现,杜鹃花在不同水分胁迫下的转录调控主要是通过3种转录因子（ERF、bHLH和MYB）协同完成的;戎利勤等^[12]完成了小花草玉梅的转录组测序,并从中筛选出12个与花发育紧密相关的MADS基因;张尉欣等^[13]通过对镉胁迫下的菜心进行转录组测序,分析了菜心响应镉胁迫的主要通路及基因;陈静芳^[14]通过分析热胁迫下菜心转录组数据,发现4份菜心材料的42个差异表达基因构成菜心共同热胁迫响应机制,2份强耐热性菜心材料的132个差异表达基因构成了特有的热胁迫响应机制。由此可见,转录组测序技术已经成为功能基因研究的高效手段。而关于软腐病菌侵染菜心的相关研究尚未见报道,其分子调控机制仍不清楚。本研究采用BGISEQ-500平台的测序技术,对软腐病菌侵染下的菜心叶片进行转录组测序,分析菜心软腐病发病过程中基因的表达变化,探究菜心对软腐病应答的分子机理,为菜心抗软腐病基因组学和分子生物学研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以福州市蔬菜科学研究所自主研发的菜心新品种‘绿星’为材料,种子经消毒点播于32孔的穴盘中,置于人工气候箱中培养。待幼苗长至3~4片新叶时,在每株植株上部第2片叶片基部的中脉注射OD值为0.5软腐病菌菌液15 μL,套透明薄袋保湿,观察其发病情况。选取发病前期、中期、后期的叶片作为材料,以未侵染的叶片作为对照,每个处理3次重复,每个重复的叶片混合均匀后置于冷冻管中用液氮速冻,于-80 ℃冰箱保存,样品委托华大基因科技股份有限公司进行转录组测序。

1.2 测序数据分析

将获得的数据用SOAPnuke软件进行过滤分析,采用HISAT软件（Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts）将获得的clean reads与白菜基因组数据进行序列比对,使用Bowtie2将clean reads比对到基因序列,采用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）作为衡量转录本或基因表达水平的指标,用perl脚本对获得的新转录本进行长度统计。

1.3 序列注释和功能分类

采用Blast比对工具,将菜心转录组获得的Unigene与公共数据库进行比对,将E值设置为≤ E^-5,根据基因的相似性进行功能注释,得到与菜心Unigene具有最高序列相似性的蛋白,从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。公共数据库包括非冗余蛋白数据库（non-redundant protein database, Nr）、基因本体论数据库（gene ontology, GO）、东京基因与基金组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）。

1.4 差异基因分析

用DEGseq方法^[15]对差异表达的基因进行检测,以Fold Change≥2且Q-value≤0.001作为显著差异表达基因筛选的标准,同时分析差异基因的表达和功能。

2 结果与分析

2.1 测序产出数据与质量评估

使用BGISEQ-500平台共测12个样品,每个样品平均产出7.09 Gb数据,Q20的值均大于95%,Q30的值均大于86%,说明测序数据质量满足后续要求。将获得的clean reads与白菜基因组进行比对,平均比对率为78.25%,比对到基因的平均比对率为59.66%。共检测到表达的Unigene数为36 760个,其中已知的Unigene有35 327个,预测新Unigene有1 433个;共检测出19 549个新转录本,其中13 279个属于已知蛋白编码基因的新的可变剪接亚型,1 466个属于新的蛋白编码基因的转录本,剩下的4 804个属于长链非编码RNA,其中新转录本长度主要集中在300~2000 nt,占78.58%（图1）。

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图1 新转录本的长度分布

Fig. 1 Length distribution of novel transcript

2.2 基因注释

2.2.1 Nr功能注释将获得的Unigene在Nr数据库中进行比对,共获得32 047条注释,注释到芸薹属的Unigene占93.08%,其中注释到白菜的Unigene最多,占70.77%,其次为油菜（17.71%）,注释到甘蓝的Unigene为4.57%,注释到除此以外的其他科属植物的Unigene占比较小,每种植物均小于3%（表1）。

表1 部分转录组序列的Nr功能注释

Tab. 1 Nr functional annotation of partial transcriptome sequence

物种Species	数量Number	占比Percent/%
大白菜Brassica rapa	22 680	70.77
油菜Brassica napus	5676	17.71
甘蓝Brassica oleracea	1466	4.57
萝卜Raphanus sativus	858	2.68
拟南芥Arabidopsis lyrata	352	1.10
山萮菜Eutrema salsugineum	340	1.06
亚麻芥Camelina sativa	149	0.46
醉碟花Tarenaya hassleriana	85	0.27
小花南芥Arabis alpina	70	0.22
荠菜Capsella rubella	62	0.19
芥菜Brassica juncea	6	0.02
其他Other		0.95

2.2.2 GO功能分类 GO功能共注释到12 588条菜心Unigene,可划分为分子功能、细胞组分和生物学过程3大类,又分为50个亚类。分子功能大类中注释到结合活性（10 031个）和催化活性（8 838个）的Unigene数量最多;细胞组分功能大类中注释到细胞（8 727个）、膜（7 373个）、细胞器（6 457个）、膜部分（6 423个）的Unigene数量较多;生物学过程大类中以细胞过程（7 554个）和代谢过程（6 790个）的Unigene较多（表2）。

表2 菜心Unigene的GO功能分类

Tab. 2 GO functional categories of flowering Chinese cabbage Unigene

GO功能分类 GO functional categories	亚类 Subgroups	数量 Number	GO功能分类 GO functional categories	亚类 Subgroups	数量 Number
分子功能	结合活性	10 031	细胞组分	病毒体部分	16
	催化活性	8838		其他有机体	2
	转运活性	1159		其他有机体部分	2
	转录调节活性	869	生物过程	细胞过程	7554
	结构分子活性	655		代谢过程	6790
	分子功能调节	348		生物学调节	2879
	抗氧化活性	149		应激反应	2424
	信号转导活性	147		定位	1617
	分子转导活性	84		细胞组成部分或生物合成	1460
	营养储存活性	39		发育进程	968
	分子转运活性	7		多细胞进程	930
细胞组分	细胞	8727		信号传导	653
	膜	7373		繁殖	556
	细胞器	6457		繁殖进程	553
	膜部分	6423		有机体进程	491
	细胞器部分	2611		生长	162
	大分子复合体	1966		免疫系统进程	121
	细胞部分	785		节律进程	39
	胞外区域	522		细胞活动	19
	膜封闭内腔	514		细胞增殖	19
	细胞连接	336		解毒作用	17
	共质体	334		碳利用	11
	超分子复合体	118		生物黏附	7
	拟核	22		细胞死亡过程	5
	病毒体	16		氮利用	5

2.2.3 KEGG代谢通路分析菜心18 583个Unigene在KEGG数据库获得注释,共注释到137个代谢通路,其中注释到植物激素信号转导（1211个）、RNA转运（1 204个）、植物-病原菌相互作用（1 179个）、MAPK信号转导途径（1 111个）4条代谢通路的Unigene数量较多,其他代谢通路的Unigene相对较少。此结果说明,菜心的代谢活动较为活跃（表3）。

表3 KEGG代谢通路富集

Tab. 3 KEGG pathway enrichment

序号 Code	Ko编号 Pathway ID	通路 Pathway	数量 Number	百分比 Percent/%	序号 Code	Ko编号 Pathway ID	通路 Pathway	数量 Number	百分比 Percent/%
1	ko04075	植物激素信号转导	1211	6.52	11	ko04144	内吞作用	824	4.43
2	ko03013	RNA转运	1204	6.48	12	ko01200	碳代谢	780	4.20
3	ko04626	植物-病原菌相互作用	1179	6.34	13	ko03018	RNA降解	764	4.11
4	ko04016	MAPK信号转导途径	1111	5.98	14	ko03030	DNA复制	745	4.01
5	ko00500	淀粉、蔗糖新陈代谢	975	5.25	15	ko03420	核苷酸切除修复	733	3.94
6	ko00940	苯丙烷生物合成	962	5.18	16	ko03440	同系物重组	704	3.79
7	ko03010	核糖体	900	4.84	17	ko00040	戊糖和葡萄糖醛酸盐的相互转化	696	3.75
8	ko03040	剪接体	886	4.77	18	ko03430	错配修复	674	3.63
9	ko04141	内质网蛋白质加工	856	4.61	19	ko03015	mRNA监测通路	652	3.51
10	ko01230	氨基酸生物合成	848	4.56	20	ko00460	氰氨基酸代谢	551	2.97

2.3 FPKM值分析

对FPKM值统计分析表明,菜心低表达量的单基因簇集中在发病后期,高表达量的单基因簇集中在发病中期。菜心单基因簇FPKM值低于0.1的有2547个,说明能检测到极低水平的基因表达,检测的灵敏度较高;FPKM值大于300的有29个,参与信号转导、氨基酸代谢、光合作用等多种生物途径。

2.4 差异基因分析

通过组间差异表达基因（differential expression genes, DEGs）分析（表4）,共获得21 776个DEGs,其中对照与发病前期组间的DEGs有15 007个,6137个上调表达,8870个下调表达;发病前期与发病中期组间DEGs有13 118个,10 278个上调表达,2840个下调表达;发病中期与发病后期组间DEGs有11 293个,1790个上调表达,9503个下调表达。将DEGs作Ven图分析发现,有5110个基因在每组间均存在差异（图2）。

表4 DEGs表达分析

Tab. 4 Expression analysis of DEGs

编号 No.	组间比较 Compare Group	上调 Up	下调 Down	总计 Total
1	CK-vs-SE	6 137	8 870	15 007
2	SE-vs-SM	10 278	2 840	13 118
3	SM-vs-SL	1 790	9 503	11 293

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图2 DEGs的Ven图分析

Fig. 2 Ven analysis of DEGs

经基因的相似度和同源性分析,从菜心4个不同感病时期转录组数据中发掘大量与软腐病病程相关的基因。其中泛素蛋白降解途径相关基因有E1、E2、E3和UCH-L等,过氧化物酶体途径有CAT、XDH和SOD等,光合碳固定途径相关基因有PEPCK、ALDO和RubisCO等,糖酵解途径相关基因有PGK、ALDH3I1、PFK和PDH E1等,以及其他抗病相关基因WRKY、NBS-LRR、NSP和AP2等。

进一步分析与抗氧化相关的DEGs,发现参与到过氧物酶体途径的DEGs有112个,其中2-羟基酸氧化酶有8个,超氧化物歧化酶有6个,长链酰基辅酶A合成酶和脂肪酰辅酶A还原酶均有5个;参与到抗坏血酸代谢途径的DEGs有87个,其中醛脱氢酶有7个,肌醇磷酸酶有6个,UDP-糖基转移酶有5个（表5）。

表5 抗氧化相关酶分析

Tab. 5 Enzymes analysis of antioxidant related

酶名称 Enzyme name	酶缩写 Enzyme abbreviation	单基因簇数量 Unigene number
2,4-二烯酰基-CoA还原酶 2,4-dienoyl-CoA reductase	DECR	3
2-羟基酸氧化酶2-hydroxy-acid oxidase	HAO	8
2-羟烷基-CoA裂解酶 2-hydroxyacyl-CoA lyase	HACL	1
Nudix水解酶nudix hydrolase	ND	4
超氧化物歧化酶superoxide dismutase	SOD	6
过氧化氢酶catalase	CAT	2
黄嘌呤脱氢酶xanthine dehydrogenase	XDH	1
甲羟戊酸激酶mevalonate kinase	MVK	1
短链脱氢酶/还原酶short-chain dehydrogenase/reductase SDRA-like	DHRS	1
类枯草杆菌蛋白酶 SBT subtilisin-like protease SBT	QK	4
类异柠檬酸脱氢酶cytosolic isocitrate dehydrogenase [NADP]-like	IDH	2
双功能环氧化物水解酶bifunctional epoxide hydrolase	sEHI	3
丝氨酸乙醛酸转氨酶serine--glyoxylate aminotransferase	SGA	2
酰基辅酶a氧化酶acyl-CoA oxidase	ACO	3
硝酸单加氧酶nitronate monooxygenase	NMO	1
长链酰基辅酶a合成酶 long chain acyl-CoA synthetase	ACSL	5
长链脂肪酸连接酶 long-chain-fatty-acid ligase	ACSBG	1
脂肪酰辅酶a还原酶 fatty acyl-CoA reductase	FAR	5
醛脱氢酶aldehyde dehydrogenase	ALDH	7
醛-酮还原酶aldo-keto reductase	AKR	4
尿苷二磷酸-葡萄糖6-脱氢酶UDP-glucose 6-dehydrogenase	UGDH/ UDPGDH	3
UDP-糖基转移酶UDP-glycosyltransferase	UGT	5
肌醇磷酸酶 inositol-phosphate phosphatase	SHIP	6
谷胱甘肽S-转移酶 glutathione S-transferase	GST	3
谷胱甘肽-l-半乳糖磷酸化酶GDP-L-galactose phosphorylase	GGPase	3
单脱氢抗坏血酸还原酶monodehydroascorbate reductase	MDHAR	3
L-古洛糖酸-内酯氧化酶L-gulonolactone oxidase	GLO	1
L-抗坏血酸氧化酶L-ascorbate oxidase	ASO	3
L-抗坏血酸过氧化物酶 L-ascorbate peroxidase	APX	4
L-半乳糖脱氢酶 L-galactose dehydrogenase	GalDH	2
GDP-甘露糖3,5差向异构酶GDP-mannose 3,5-epimerase	GME	2

3 讨论

利用高通量测序技术分析植物转录组数据,挖掘植物代谢途径、调控机制等信息已成为研究热点。利用该技术,紫背天葵^[16]、党参^[17]、青篱柴^[18]、黄秋葵^[19]、番茄^[20]等物种已完成了转录组测序和功能注释,并从中发掘出一些重要功能基因加以利用。本研究利用高通量测序技术构建了软腐病菌侵染下菜心叶片的转录组数据库,对获得的序列在相关数据库进行比对和功能注释,发现植物激素信号转导、蛋白代谢、糖代谢和能量代谢等多种途径相关基因的表达均发生改变。

WRKY转录因子编码的蛋白能够与目标元件发生特异性结合,抑制或激活目标基因的表达,从而参与植物的胁迫应答、衰亡等一系列生理活动,在植物防卫反应机制中具有重要的调控作用^[21]。赵雪等^[22]、范荣伟等^[23]研究大白菜BrWRKY33基因上游调控序列功能及其在软腐病抗性方面的作用,认为BrWRKY33在拟南芥抗软腐病SA/ET介导的防御过程中正调控下游基因的表达。菜心中WRKY基因序列BraA03g006670.3C、BraA07g 030410.3C在软腐病发病过程中均差异上调表达,正调控下游基因的表达,从而调控植株抗病能力;BraA09g035200.3C序列在软腐病发病前期差异上调表达,发病中期和后期下调表达;BraA02g 019440.3C和BraA06g041930.3C序列在软腐病发病前期和中期差异上调表达,发病后期下调表达;BraA01g006320.3C、BraA07g042700.3C和BraA09g029190.3C序列在软腐病发病过程中差异下调表达,负调控下游基因的表达,改善植株抗病能力。由此可见,菜心WRKY基因在软腐病发病过程中调控功能的复杂性。

油菜素类固醇（brassinosteroids, BRs）是一种新型植物生长激素,在调节细胞增殖、形态建成、顶端优势、叶片和叶绿体衰老、基因表达中起关键作用,其中油菜素内酯（brassinolide, BL）是生物活性最强的一种BRs^[24],外源施用可提高植株对根腐病、病毒病、白粉病的抗性^[25,26]。BR合成基因编码的蛋白大多属于细胞色素P450超级家族,如CYP90B1/DWF4、CPD和DWF1等^[27]。菜心细胞色素P450 85A2家族的不同基因调控软腐病的方式不同,序列BraA02g039080.3C在软腐病发病前期和中期差异上调表达,发病后期差异下调表达,序列BraA06g036240.3C在软腐病发病中期差异上调表达,前期和发病后期差异下调表达;P450 90A1（BraA10g028480.3C）在软腐病发病前期差异上调表达,发病中期和后期差异下调表达。BRI1是位于质膜上的富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat repeat, LRR）的受体样蛋白激酶,是BR信号转导起始的受体^[28]。BR信号通路打开的第一步是BRI1与BR类物质（如BL）特异性结合,此时BRI1的负调控蛋白BRI1 associated kinase1（BAK1）从细胞膜上解离而解除对BRI1的抑制,使BR信号向下传递^[29]。菜心BAK1（BraA10g010250.3C）和BRI1（BraA06g 044360.3C）在软腐病发病中期均差异上调表达,前期和发病后期均差异下调表达。

泛素-蛋白酶体途径是由泛素、泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme, E1s）、泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzymes, E2s)、泛素-蛋白连接酶（ubiquitin-protein ligases, E3s）等一系列蛋白组成,能够有选择性地降解细胞内产生的异常蛋白以及各种调节蛋白等,因而在细胞周期的控制、免疫应答、胁迫反应和细胞程序性死亡等生理过程中起重要作用^{[30,31,32,33]}。菜心中有2条E1 1-like同源序列,14条E2同源序列,24条E3同源序列,E1 1-like同源序列BraA04g021420.3C在软腐病发病过程中均差异上调表达,响应异常蛋白,调控下游E2同原序列BraA05g020820.3C和E3同原序列BraA04g002920.3C在发病前期和中期差异上调表达,促进更多异常蛋白的降解,发病后期BraA05g020820.3C和BraA04g002920.3C表达受到抑制。

响应软腐病菌侵染过程是由一系列基因相互协调共同发挥作用来完成的,菜心共发现21 776个响应软腐病菌侵染的差异表达基因,参与信号转导、蛋白降解等多种途径,在这些基因的共同作用下调节各种生理活动,从而提高抗病能力。本研究筛选出的菜心响应软腐病侵染的差异基因,为后期菜心抗软腐病关键基因及其功能研究提供重要依据。

References

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