咖啡曾经作为世界贸易价值仅次于石油的商品[1],与可可、茶叶并称为世界三大饮料。咖啡具有很高的经济价值和营养价值,居世界三大饮料之首[2]。目前,我国咖啡种植区域主要集中于云南省和海南省,西藏、福建、四川、广西、广东等省（区）也有少量种植。据农业农村部统计,2018年我国咖啡总面积12.27万hm2,其中云南占99.22%,海南占0.37%。与此同时,近年来我国也逐渐成为咖啡消费大国,咖啡消费量正以每年超过20%的速度增长[3]。目前,我国咖啡消费市场规模约1000亿元,与美、日等发达国家相比,我国的咖啡消费仍处于初期阶段。2016年,我国咖啡出口创收5.28亿美元[4],可见我国咖啡产业具有良好的发展前景。
然而,随着咖啡种植面积的扩大,以及品种、种苗的不断引进与调运,导致咖啡生产过程中病害频繁发生,严重影响和制约咖啡产业的健康发展[5,6,7,8,9]。咖啡黑果是小粒种咖啡产区普遍出现的一种症状,严重影响小粒种咖啡的产量与质量[10,11]。产生黑果的原因也有多种,既有生理因素引起的枝枯干果,也有虫害、病害所引起的黑果[10,11,12]。而在病害方面,根据对云南省普洱市思茅区咖啡黑果病的调查结果表明,咖啡生尾孢菌、咖啡炭疽病菌以及拟束梗镰刀菌（Fusarium stilboides）均可导致咖啡黑果[10],但该文中未见柯赫氏法则等相关内容。
2018年夏季,云南普洱由于连续降雨,导致大量咖啡果实变黑,严重影响产量,初步判断是由病害引起,但未鉴定其病原菌。为了鉴定该病害的病原及其发生规律,本研究在分离获得病样分离物的基础上,通过致病性测定、形态学观察并结合多基因序列的分子鉴定,以明确引起咖啡黑果的病原菌,并对其生物学特性进行研究,为该病害的预测与防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 从云南普洱南岛河咖啡种植区收集典型病样,通过分离纯化获得单孢菌株CPE5与CPE12,菌株保存于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。
1.1.2 试剂 本研究所用的PCR扩增引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司使用普通脱盐方法合成;Premix Taq购自TaKaRa;真菌DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒为OMEGA公司试剂产品;用于连接转化的大肠杆菌Trans-T1感受态细胞以及pEASY-T1 Cloning Kit均购自北京全式金生物试剂公司。所用其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 病原菌分离与形态观察 从种植地采集的病果经过表面清洗后,将果皮剪成4~6 mm2大小,在超净工作台进行表面消毒,然后转移至PDA培养基。待长出新鲜菌丝后,转入新的PDA培养基。纯化培养7 d后对其菌落形态进行拍照。用无菌铁勺刮去培养基表面气生菌丝,于超净台晾晒2 d后用无菌水冲洗表面,制成孢子悬浮液,并在显微镜（日本Nikon NI/E）40倍镜下对200个分生孢子形态、大小等进行观察、测量与记录。
1.2.2 病原菌致病性测定 采用2种方式进行致病性测定。（1）摘取健康咖啡新鲜嫩叶,通过微刺伤后接种2个菌丝块,并以无菌PDA为对照,各接种3片叶;25 ℃保湿培养,6 d后观察发病情况;（2）取田间健康的咖啡果实洗净,通过微创伤后接种孢子悬浮液（1×107个/mL）,并以接种清水为对照。各接种3个果实。25 ℃保湿培养,定期观察。待发病后进行拍照保存,并对发病部位组织进行再分离。
1.2.3 菌丝体培养、收集以及DNA提取 将病原菌在PDA平板上预培养3 d,在超净工作台挑取3个约0.5 cm2大小的新鲜菌丝块接种到经高温高压灭菌的酵母液体培养基（每升培养基含1%葡萄糖,0.3%酵母粉）。经180 r/min,28 ℃,摇菌培养4~5 d。用纱布过滤,无菌水冲洗3~5次,滤纸吸去多余水分收集菌丝体,经冻干机将菌丝体干燥。利用OMEGA真菌提取试剂盒提取病原菌DNA,-20 ℃冷冻备用。
1.2.4 病原菌分子鉴定 采用ITS1/ITS4（ITS基因）、T1/T22（编码蛋白基因β-微管蛋白,β-tubulin）、EF1H/EF2T（真核生物延伸生长因子基因,TEF）、LROR/LR5（28S rDNA基因）共4对引物对病原菌进行分子鉴定,具体序列见表1。扩增程序为：94 ℃下预变性3 min,然后94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,35个循环后72 ℃延伸10 min,反应结束后置于4 ℃冰箱保存。扩增产物在1%的琼脂糖凝胶检测并回收。回收产物连接pMD18T载体,并于大肠杆菌克隆。挑取单菌落进行分子鉴定,选取3个阳性克隆子于英潍捷基（广州）贸易有限公司测序。
表1 所用引物及其序列Tab. 1 Sequence of primers used in this study |
| 基因名称 Gene name | 引物 Primer | 引物序列（5°-3°） Primer sequence (5°-3°) | 参考文献 Reference |
|---|---|---|---|
| ITS | ITS1-F | TCCGTAGGTGAACCTGCGG | [13] |
| ITS4-R | TCCTCCGCTTATTGATATGC | ||
| β-tubulin | T1-F | AACATGCGTGAGATTGTAAGT | [14-15] |
| T22-R | TCTGGATGTTGTTGGGAATCC | ||
| TEF | EF1H-F | ATGGGTAAGGAAGACAAGAC | [16] |
| EF2T-R | GGAAGTACCAGTGATCATGTT | ||
| 28S rDNA | LROR-F | ACCCGCTGAACTTAAGC | [17] |
| LR5-R | TCCTGAGGGAAACTTCG |
1.2.5 序列分析 将测序获得菌株的ITS、β-tubulin、TEF和28S rDNA基因片段序列与从GenBank中下载的菌株（部分为模式菌株）序列,使用DNAStar Seqman软件进行对齐,并通过人工校对后,使用MEGA 7.0软件进行比对分析,分别构建基于ITS、β-tubulin、TEF、28S rDNA单个基因序列的系统发育树。其中ITS和TEF基因序列进一步用于构建双基因加合树。用于构建发育树的菌株相关信息见表2。
表2 用于构建发育树的菌株相关信息Tab. 2 Information used to construct phylogenetic tree constructed in this study. |
| 种名 Species | 菌株 Strain | 寄主 Host | Genbank登录号 Genbank accession number | |
|---|---|---|---|---|
| ITS | TEF | |||
| Fusarium biseptatum | CBS 110311* | - | EU926252 | EU926319 |
| F. chlamy- dosporum | F-2 | banana | KY211035 | KY211036 |
| F. commune | NRRL 22903 | tomato | U34567 | HM057341 |
| F. concolor | NRRL 13459* | - | U34580 | MH742681 |
| F. inflexum | NRRL 20433* | banana | U34577 | AF008479 |
| F. napiforme | NRRL 13604* | - | U34570 | AF160266 |
| F. nygamai | NRRL 13448* | - | U34568 | MN101579 |
| F. commune | 9302G | conifer | DQ016197 | DQ016252 |
| F. domesticum | CBS 116517 | - | JQ434584 | EU926286 |
| F. equiseti | HYC1410080201 | cauliflower | KX583609 | KX583610 |
| F. fujikuroi | RUFFWY137b6 | Rheum undulatum | KR047049 | KR108740 |
| F. incarnatm | A50 | homo sapiens | KY776645 | MF034505 |
| F. incarnatm | YN-SD-3 | potato | KT224022 | KT224222 |
| F. lunatum | CBS 632.76 | - | JQ434583 | EU926291 |
| F. mexicanum | NRRL 53147 | neotropical trees | MG838062 | MG838032 |
| F. nelsonii | NRRL 13338 | human | GQ505434 | GQ505402 |
| F. penzigii | CBS 116508 | - | EU926256 | EU926323. |
| F. phyllophilum | NRRL13617 | - | U34574 | AF160274 |
| F. proliferatum | CBS 131574 | wheat | JX162373 | JX118983 |
| F. proliferatum | NRRL 31071 | Triticum | AF291061 | AF291058 |
| F. pseudocir- cinatum | NRRL 53570 | big-leaf mahogany | MG838049 | GU737398 |
| F. pseudocir- cinatum | NRRL 31631 | big-leaf mahogany | MG838047 | MG838026 |
| F. sacchari | CBS 135144 | - | KR071642 | KR071750 |
| F. sacchari | A98 | homo sapiens | KX496039 | KY178317 |
| F. solani | NRRL 52778 | - | JF740931 | JF740846 |
| F. solani | NRRL 25083 | - | JF740882 | DQ247538 |
| F. subglutinans | CICC2502 | noni seeds | KJ624981 | KJ624982 |
| F. subglutinans | CBS 136481 | - | KR071625 | KR071770 |
| F. thapsinum | FT-1 | tomato roots | KM589050 | KM589048 |
| F. thapsinum | 118 | sorghum | KU856647 | KU856657 |
| F. udum | NRRL 22949 | - | U34575 | AF160275 |
注：-表示寄主不明确;*表示标准菌株。 | |
Note: - indicates that the host is not clear, *indicates that standard strain. |
1.2.6 病原菌生物学特性测定 （1）营养因子测定。分别测定不同培养基、碳源、氮源等对病原菌生长的影响。选用PDA培养基、玉米粉琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、萨氏培养基、Czapek培养基、燕麦粉琼脂培养基为参试培养基;碳源、氮源则采用Czapek培养基作为基础培养基,将该培养基的硝酸钠分别使用等氮当量的牛肉浸膏、半胱氨酸、甘氨酸、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、尿素代替;以及使用等碳当量的麦芽糖、果糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉代替蔗糖;从而配制成不同的碳源、氮源培养基。利用灭菌打孔器（d=5 mm）,在PDA平板预培养7 d的病原菌边缘打取菌块,接种于上述培养基中,于28 ℃培养7 d后测量菌落直径。各处理均重复3次。
（2）非营养因子测定。分别测定温度、pH、光照条件以及病原菌的致死温度等非营养因子。温度试验共设4、13、20、25、28、30、37 ℃等7个梯度,培养7 d;光照试验设24 h光照,12 h/12 h光照/黑暗,24 h全黑暗条件,置于28 ℃恒温培养箱培养7 d;pH试验则设3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0共9个梯度,置于28 ℃培养7 d。采用十字交叉法测量菌落直径。病原菌致死温度测定：通过在2 mL的离心管中加入1 mL的无菌水,在离心管中加入菌饼（d=5 mm）,并分别在35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃温度水浴10 min（预热1 min）后,接种到PDA平板培养基上,置于培养箱中28 ℃培养,7 d后采用十字交叉法测量菌落直径。各处理均重复3次。
1.2.7 病原菌药剂敏感性测定 利用12种供试杀菌药剂（表3）,配制不同浓度的含药剂平板,将培养好的CPE5病原菌菌块（d=5 mm）接于含药剂平板的中心,每个浓度设置5个重复,置于28 ℃恒温培养箱培养7 d,用十字交叉法测量病原菌菌落直径,计算生长抑制率,分析不同杀菌剂对供试病菌菌丝体生长的影响。
表3 12种供试杀菌药剂相关信息及其使用浓度Tab. 3 Information and concentrations of 12 tested fungicides |
| 杀菌药 Fungicides | 有效成分及剂型 Active ingredient and dosage form | 生产厂家 Manufacturer | 有效浓度 Effective concentration/(μg·mL-1) |
|---|---|---|---|
| 咪鲜胺锰盐 | 50%可湿性粉剂 | 美国富美实公司 | 2、0.5、0.1、0.02、0.01 |
| 苯甲嘧菌酯 | 30%悬浮剂 | 上海沪联生物药业（夏邑）股份有限公司 | 50、25、10、5、1 |
| 苯醚甲环唑 | 10%可湿性粉剂 | 瑞士先正达作物保护有限公司 | 10、5、2、0.5、0.1 |
| 氟菌戊唑醇 | 35%悬浮剂 | 拜耳股份公司 | 20、10、5、1、0.1 |
| 丙环唑 | 50%微乳剂 | 济南绿霸农药有限公司 | 10、5、2、0.5、0.1 |
| 戊唑醇 | 43%悬浮剂 | 拜耳作物有限公司 | 10、5、2、0.5、0.1 |
| 嘧菌酯 | 30%悬浮剂 | 上海禾本药业有限公司 | 10、10、5、1、0.5 |
| 吡唑醚菌酯 | 25%悬浮剂 | 山东东远生物科技有限公司 | 25、10、5、2.5、1 |
| 百菌清 | 40%悬浮剂 | 四川稼得利科技开发有限公司 | 200、100、50、25、5 |
| 氟环唑 | 125 g/L悬浮剂 | 巴斯夫植物保护（江苏）有限公司 | 2、1、0.5、0.1、0.05 |
| 啶氧菌酯 | 22.5%悬浮剂 | 美国杜邦公司 | 200、100、50、25、5 |
| 春雷霉素 | 6%可湿性粉剂 | 华北制药河北华诺有限公司 | 100、50、10、5、1 |
1.3 数据处理
采用SPSS 13.0分析软件和Excel软件进行试验数据的统计分析。
2 结果与分析
2.1 病害症状及病原菌的形态特征
图1 咖啡镰刀菌黑果病症状及病原菌特征A：田间症状;B：PDA培养基上的菌落形态（正面）;C：PDA培养基上的菌落形态（反面）;D：分生孢子形态（40×）。 Fig. 1 Symptoms and pathogenic characteristics of coffee Fusarium sp. black berry disease A: Field symptoms; B: Colony morphology on PDA medium (front); C: Colony morphology on PDA medium (reverse); D: Conidia morphology (40×). |
2.2 致病性测定
图2 致病性测定与再分离病原菌分生孢子形态A：实线框表示接种菌丝块,虚线框表示接种无菌PDA（CK）;B：孢子悬浮液接种咖啡果实;C：清水接种咖啡果实（CK）;D：再分离病原菌分生孢子（40×）。 Fig. 2 Pathogenicity determination and conidia morphology of re-isolated of pathogen A: The solid frame represents the inoculation of mycelium block, and the dotted frame indicates inoculation of sterile PDA (CK); B: Inoculates coffee fruit with conidia suspension; C: Inoculates coffee fruit with water (CK); D: Conidia morphology of re-isolated of pathogen (40×). |
2.3 分子鉴定
采用ITS1/ITS4、T1/T22、EF1H/EF2T、LROR/LR5共4对引物对病原菌进行分子鉴定,经过琼脂糖凝胶电泳检测分别获得568、1332、743、925 bp的片段。将上述序列分别在GenBank数据库中进行同源性搜索,下载同源性较高的菌株序列,与本研究的菌株CPE5和CPE12的序列构建Neighbor-joining Tree。由于数据库中序列长度存在差异,使用Seqman软件进行比对并手工校正,最终用于构建发育树的目的菌株ITS、β-tubulin、TEF、28S rDNA序列分别为464、1323、614、870 bp。基于不同序列构建的单基因系统发育树存在一定的差异（由于篇幅所限,单基因发育树未在文中列出）。在ITS序列系统发育树中,CPE5、CPE12与Fusarium solani JF740882和F. solani JF740931菌株聚类为一支。在β-tubulin序列系统发育树中,CPE5、CPE12与F. solani KU983876、F. solani KF255996聚类成一个分支;TEF序列系统发育树显示,CPE5、CPE12与F. solani JF740846、F. solani DQ247538菌株聚类为一支;而在28S rDNA序列系统发育树中,CPE5、CPE12则与F. solani MH875874菌株虽然聚类在同一分支,但只有91%的节点支持率。由于上述基因序列的缺失,本研究仅通过将ITS与TEF基因序列拼接,构建双基因加合树。聚类结果显示,CPE5、CPE2与F. solani NRRL52778、NRRL25083菌株聚类成一个分支,且其节点支持率为100%（图3）。综合上述,由ITS、β-tubulin、TEF、28S rDNA四个单基因系统发育树以及ITS和TEF的双基因加合树,可得出CPE5和CPE12属于腐皮镰孢（Fusarium solani）。
2.4 咖啡腐皮镰孢菌生物学特性
2.4.1 营养因子对咖啡腐皮镰孢菌生长的影响 营养因子测定结果表明,菌株CPE5在供试的6种培养基上均能生长,最适宜生长的培养基是PDA和玉米粉琼脂培养基,其菌落平均直径分别为76.17 mm和71.58 mm;牛肉膏蛋白胨培养基、燕麦粉琼脂培养基的效果次之,菌落平均直径分别为66.5 mm和64.17 mm;其余培养基生长效果则较差（篇幅所限,数据未列出。下同）。在供试的7种不同碳源培养基中,以甘露醇的利用率最高,培养7 d后病原菌菌落平均直径为79.17 mm,显著高于其他碳源培养基;其次为果糖,菌落平均直径为74.83 mm;蔗糖和乳糖的碳源利用率最差,无显著差异,平均菌落直径为52.5 mm和51.33 mm。在供试的8种不同含氮培养基上,利用率较高的是牛肉浸膏、甘氨酸、尿素,菌落平均直径依次为77.00、79.17、76.5 mm,三者之间无显著差异;其次为半胱氨酸和氯化铵,平均菌落直径为64.00 mm和65.17 mm;利用率最低的为含硝酸铵的培养基,菌丝极稀薄,不易用肉眼观察。
2.4.2 非营养因子对咖啡腐皮镰孢菌生长的影响 非营养因子测定结果表明,病原菌可在13~30 ℃的环境下生长,在4 ℃以及37 ℃的环境下,病原菌不能生长;适宜生长温度为25~30 ℃,最适生长温度为28 ℃,菌落平均直径显著大于其他处理;温度小于25 ℃的条件下病原菌的生长受到抑制。菌株在中性及偏碱性的环境下生长明显快于偏酸性环境,当pH<3时菌株的生长受到抑制。完全光照有利于病原菌生长,其次为12 h光暗交替,在完全黑暗条件下不利于菌株菌丝的生长。菌饼在70 ℃水浴10 min后,在28 ℃环境下依旧能正常生长,但在75 ℃下水浴后菌落不生长。所以CPE5菌株的致死温度和致死时间分别为75 ℃和10 min。
2.5 病原菌室内毒力测定
室内毒力测定结果显示,咪鲜胺锰盐和戊唑醇2种药剂的EC50值分别为1.8352 μg/mL和1.4826 μg/mL,对CPE5菌株菌丝体生长具有十分显著的抑制效果。而氟菌戊唑醇、嘧菌酯、百菌清等3种药剂对病原菌的抑制效果次之,EC50值分别为4.7226、2.8080、2.7433 μg/mL;此外,丙环唑、氟环唑也有较强的抑制效果,EC50分别为9.0377、6.9998 μg/mL。其中,啶氧菌酯与春雷霉素对该病原菌的抑制效果最差,EC50值分别为7405.9907 、9522.0294 μg/mL,基本无抑制效果。12种不同的杀菌剂对腐皮镰孢菌的抑制效果存在差异（表4）。
表4 12种杀菌剂对腐皮镰孢菌CPE5的毒力Tab. 4 Virulence of 12 fungicides to coffee Fusarium solani isolate CPE5 |
| 杀菌剂 Fungicides | 回归方程 Regression equation | 相关系数r Correlation coefficient | 斜率值a Slope value | 半致死浓度 EC50/(μg·mL-1) |
|---|---|---|---|---|
| 咪鲜胺锰盐 | y=0.6250x+4.8352 | 0.983311** | 0.6250 | 1.8352 |
| 苯甲嘧菌酯 | y=0.3916x+4.1408 | 0.946678* | 0.3916 | 156.3420 |
| 苯醚甲环唑 | y=0.6323x+3.8284 | 0.991010** | 0.6323 | 71.2718 |
| 氟菌戊唑醇 | y=0.7053x+4.5245 | 0.989394** | 0.7053 | 4.7226 |
| 丙环唑 | y=0.6850x+4.3451 | 0.996795** | 0.6850 | 9.0377 |
| 戊唑醇 | y=0.5935x+4.8985 | 0.998596** | 0.5935 | 1.4826 |
| 嘧菌酯 | y=2.1104x+4.0537 | 0.952260* | 2.1104 | 2.8080 |
| 吡唑醚菌酯 | y=0.2601x+4.4372 | 0.994535** | 0.2601 | 145.8086 |
| 百菌清 | y=0.2754x+4.8793 | 0.988231** | 0.2574 | 2.7433 |
| 氟环唑 | y=0.4041x+4.6585 | 0.997547** | 0.4041 | 6.9998 |
| 啶氧菌酯 | y=0.2423x+4.0624 | 0.899667* | 0.2423 | 7405.9907 |
| 春雷霉素 | y=0.3479x+3.6158 | 0.904489* | 0.3479 | 9522.0294 |
注：*表示差异显著（P<0.05）,**表示差异极显著（P<0.01）。 | |
Note: * indicates significant difference (P<0.05), ** indicates extremely significant difference (P<0.01). |
3 讨论
镰刀菌属（Fusarium ssp.）是世界上分布范围很广的一类真菌,可侵染多种作物,引起根腐病、茎腐病等症状。镰刀菌属种类繁多,部分镰刀菌存在多个专化型,以及种间差异,加上多种形态,给鉴定分类带来很大的困难。仅依靠形态学鉴定无法很好地区分种类。目前应用于鉴定镰刀菌的基因位点主要有ITS、TEF、β-tubulin、28S rDNA,以及线粒体小亚基核糖体（mtSSU）、组蛋白（H3）、钙调蛋白（calmodulin）等[18]。如林珊宇等[19]使用rDNA-ITS序列鉴定出引起火龙果软腐病的病原菌是木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）;杨波等[20]利用引物对EF1H/EF2T扩增目的片段,结合形态学鉴定出引起新疆马铃薯根腐病的病原菌为锐顶镰刀菌等5种不同的镰刀菌。张曼等[21]使用ITS基因序列和EF1-α基因序列相结合确定引起葫芦砧木萎蔫病的病原菌是腐皮镰孢菌（Fusarium solani）;张贞明等[22]使用引物对Fu3/Fu4确定引起甘肃省武威市苜蓿根腐病的病原菌是半裸镰孢菌、厚垣镰孢菌、层出镰孢菌3种致病菌。
本研究通过采用ITS、TEF、β-tubulin、28S rDNA四个单基因对从咖啡黑果病样上分离获得的病原菌进行分子鉴定,并且构建ITS与TEF基因的加合树,综合分析确定该病原菌为腐皮镰孢菌（Fusarium solani）。尽管,目前已有报道多种危害咖啡浆果的病害,如由卡哈瓦刺盘孢（Colletotrichum kahawae）引起的咖啡果疫病[23];由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloesporioides）引起的褐疫病[24];以及咖啡生尾孢（Cercospora coffeicola）危害咖啡浆果发病[25],引起暗红褐色、疱状病斑引起的疱斑病等。经过查询文献资料,目前国内尚无腐皮镰孢菌危害咖啡果实的报道,本研究为首次报道。
对于一种新病害,明确其生物特性,是开展监测预警及其防治的前提条件。生物学特性研究结果显示,病原菌可在13~30 ℃的环境下生长,在4 ℃以及37 ℃的环境下,病原菌不能生长;最适生长温度为28 ℃。完全光照有利于病原菌生长。最适宜CPE5生长的培养基是PDA、玉米粉琼脂培养基;病原菌对碳源甘露醇利用率最高,蔗糖和乳糖利用率最差;对氮源利用率最高的是牛肉浸膏、甘氨酸、尿素,最差的是硝酸钠和硝酸铵,但在含硝酸铵的平板上菌丝极稀薄;CPE5菌株的致死温度和致死时间分别为75 ℃和10 min。与杨静美等[26]在番木瓜上分离到的F. solani生物学特性相似。咪鲜胺锰盐、戊唑醇2种药剂对病原菌的抑制效果最好。需要注意的是,咖啡黑果可由生理、病理、虫害等多方面原因引起,本研究所鉴定的腐皮镰孢菌（F. solani）只是其中病原之一。故在生产中,首先需要明确其病因,才能有的放矢地对其进行防治。