Tissue Culture Technology for Pedicel Shoots of <i>Dendrobium kingianum </i>Bidwill

CHEN Heming; JIANG Nan; LYU Fubing; XIAO Wenfang; LI Zuo; ZHU Genfa

doi:10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.004

Chinese Journal of Tropical Crops >

2020 , Vol. 41 >Issue 8: 1529 - 1534

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.004

Tissue Culture Technology for Pedicel Shoots of Dendrobium kingianum Bidwill

CHEN Heming ¹^,² ,
JIANG Nan ³ ,
LYU Fubing ¹^,² ,
XIAO Wenfang ¹^,² ,
LI Zuo ¹^,² ,
ZHU Genfa ^,¹^,²^,^*

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1. Floricultural Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, Guangdong 510640, China
2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization, Guangzhou, Guangdong 510640, China
3. Dongguan Agricultural Science Research Center, Dongguan, Guangdong 523000, China

Received date: 2019-11-02

Request revised date: 2020-02-28

Online published: 2020-09-17

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Copyright reserved © 2020. Office of Acta Agronomica Sinica All articles published represent the opinions of the authors, and do not reflect the official policy of the Chinese Medical Association or the Editorial Board, unless this is clearly specified.

Fold

Abstract

The induction and proliferation and rooting tests of Dendrobium kingianum Bidwill were studied using pedicel shoots as the explant. The two induction media of MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10% CM and MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+AC 1.0 g/L+10% CM could induce buds. 70.6% pedicels died without lateral buds induced or lateral buds too weak, but it provided an effective way for seedling production and germplasm resources protection. In the proliferation culture, the medium of MS+6-BA 3.0 mg/L+AD 3.0 mg/L+10% CM was beneficial to proliferation culture. In the rooting and growth culture, the medium of 1/2 MS+NAA 0.3-0.5 mg/L+10% CM was suitable for the rooting culture of D. kingianum ‘Jinsika’ (DJ).

Key words： Dendrobium kingianum Bidwill; pedicel; tissue culture; induction; proliferation; rooting

Cite this article

CHEN Heming , JIANG Nan , LYU Fubing , XIAO Wenfang , LI Zuo , ZHU Genfa . Tissue Culture Technology for Pedicel Shoots of Dendrobium kingianum Bidwill[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2020 , 41(8) : 1529 -1534 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.004

澳洲鸽子石斛兰（Dendrobium kingianum Bidwill）是兰科植物石斛属（Dendrobium）澳洲鸽石斛组（Section Dendrocryne）中观赏性较高的原种之一^[1],原产于澳大利亚东部、新加勒多尼亚岛等地^[2,3]。其植株长势好、花小且色彩艳丽,抗性较强。当前,国内外对澳洲鸽子石斛兰的组培研究并不多,莫远琪等^[1]以澳洲鸽子石斛兰幼嫩假鳞茎为外植体进行了组织培养和快速繁殖研究,Prażak等^[4,5,6]利用金属元素和光照等对澳洲鸽子石斛类原球茎的增殖和生长进行了研究,Habiba等^[7,8]研究了不同化学物质、植物生长调节剂及不同光源对澳洲鸽子石斛类原球茎生长的影响等。至今,澳洲鸽子石斛兰主要以幼嫩假鳞茎或类原球茎为外植体进行组培快繁,但利用假鳞茎作为外植体容易造成褐化且污染的发生率较高,而利用类原球茎进行繁殖,后代出现变异的几率较大。因此,本研究利用花梗为外植体,研究澳洲鸽子石斛兰花梗芽的诱导、增殖及生根情况,并减少对外植体的伤害及污染率,以期为澳洲鸽子石斛兰种质资源的保存及种苗生产提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

澳洲鸽子石斛兰（Dendrobium kingianum Bidwill）开花株由东莞市农业科学研究中心从中国台湾引入,种植于东莞市农业科学研究中心和广东省农业科学院环境园艺研究所的试验温室大棚。在开花期,选取生长健壮的花梗作为外植体,品种编号分别为‘澳0’‘澳4’‘澳5’‘澳11’‘澳12’‘澳13’‘金斯卡’。

1.2 方法

1.2.1 外植体的处理在开花期,选取粗壮、无病害的花梗（图1A）,截取长2~3 cm带有节间的花梗茎段（图1B）,用自来水冲洗干净,置于超净工作台上用75%的酒精浸泡30 s,然后用0.1% HgCl₂溶液灭菌8~10 min,无菌水冲洗5~8次后,用无菌滤纸吸干残余水分并剖去苞片,将其两端各切取0.5 cm,再把花梗茎段接种在诱导培养基上培养。

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图1 澳洲鸽子石斛兰的花梗及花梗节间

A：花梗;B：花梗节间。

Fig. 1 Pedicels and stalk nodes of D. kingianum

A: Pedicels; B: Stalk nodes.

1.2.2 芽的诱导培养 1号诱导培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10%椰子汁（CM）,2号诱导培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+ AC 1.0 g/L+10% CM。接种50 d后调查出芽的外植体,统计诱导出芽率,诱导出芽率=出芽的外植体数/接种外植体数×100%。

1.2.3 芽的增殖培养 1号增殖培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+AD 2.0 mg/L+10% CM;2号增殖培养基：MS+6-BA 3.0 mg/L+AD 3.0 mg/L+10% CM;3号增殖培养基：MS+6-BA 4.0 mg/L+AD 4.0 mg/L+ 10% CM。将诱导出的芽从芽的基部切下,随机接种到各种增殖培养基中,每处理接种3瓶,每瓶接种4个芽,倘若诱导出的芽数偏少,则增殖时直接接种于2号增殖培养基中进行单株增殖。接种60 d后统计芽的数量,计算芽的增殖倍数。芽的增殖倍数=(培养后的芽数-接种芽数)/接种芽数。

1.2.4 生根壮苗培养 1号生根培养基：1/2 MS+ NAA 0.1 mg/L+10% CM;2号生根培养基：1/2 MS+ NAA 0.3 mg/L+10% CM;3号生根培养基：1/2 MS+ NAA 0.5 mg/L+10% CM。将增殖到一定数量的无根苗切下,随机接种到生根培养基中,每处理接种5瓶,每瓶接种10苗。接种60 d后统计生根率。生根率=生根的组培苗数/接种的组培苗数×100%

1.2.5 培养条件所有培养基均添加3.00%蔗糖和0.70%琼脂,培养基pH 5.8±0.1,培养温度25~28℃,光照强度1500~2000 lx,光照时间12 h/d。

2 结果与分析

2.1 澳洲鸽子石斛兰花梗的诱导培养

从表1可看出,大部分带有节间的花梗茎段因不能诱导出侧芽或侧芽弱小而死亡,占了所有接种数的70.6%,说明澳洲鸽子石斛的花梗节间能诱导出芽的效率低。在实验中仅有‘澳0’（图2）、‘澳4’（图3）和‘金斯卡’（图4）分别在1号和2号诱导培养基中诱导出芽,而‘澳5’‘澳11’‘澳12’‘澳13’在1号和2号诱导培养基中均未诱导出芽（图5、图6）。

表1 澳洲鸽子石斛兰花梗芽诱导培养

Tab. 1 Induction of pedicel shoots in D. kingianum

品种 Varieties	培养基 Culture medium	配方 Formulation	接种数 Number of inoculation	成功数 Number of success	诱导出芽率 Induction rate/%
澳0	1号诱导培养基	MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10% CM	10	3	30.0
澳4			2	0	0.00
澳5			2	0	0.00
澳11			2	0	0.00
澳12			2	0	0.00
澳13			3	0	0.00
金斯卡			50	18	36.0
澳0	2号诱导培养基	MS+BA 2.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L+AC 1.0 g/L+10% CM	10	0	0.00
澳4			2	1	50.0
澳5			2	0	0.00
澳11			4	0	0.00
澳12			1	0	0.00
澳13			3	0	0.00
金斯卡			50	20	40.0

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图2 ‘澳0’在1号诱导培养基中诱导出芽

Fig. 2 Induced buds of D. kingianum ‘D0’ in No. 1 of induction medium

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图3 ‘澳4’在2号诱导培养基中诱导出芽

Fig. 3 Induced buds of D. kingianum ‘D4’ in No. 2 of induction medium

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图4 ‘金斯卡’在1号和2号诱导培养基中均诱导出芽

Fig. 4 Non-induced buds of D. kingianum ‘DJ’ in No. 1 and No. 2 of induction medium

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图5 ‘澳5’和‘澳11’在1号和2号诱导培养基中均未诱导出芽

Fig. 5 Non-induced bud of D. kingianum ‘D5’ and ‘D11’ in No. 1 and No. 2 induction medium

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图6 ‘澳12’和‘澳13’在1号和2号诱导培养基中均未诱导出芽

Fig. 6 Non-induced bud of D. kingianum ‘D12’ and ‘D13’ in No. 1 and No. 2 induction medium

2.2 澳洲鸽子石斛兰芽的增殖培养

2.2.1 ‘澳0’‘澳4’的增殖培养由于‘澳0’‘澳4’诱导出的芽数偏少且为了减少污染,均在2号增殖培养基进行单株增殖培养,其增殖结果见表2、图7和图8。从2表可看出,‘澳0’和‘澳4’的增殖倍数均为3.0,这表明6-BA和AD有利于澳洲鸽子石斛芽的增殖。

表2 2号增殖培养基对‘澳0’和‘澳4’芽增殖的影响

Tab. 2 Effects of No. 2 proliferation medium on proliferation of buds in D. kingianum ‘D0’ and ‘D4’

品种 Varieties	培养基 Culture medium	培养基配方 Medium formulation	增殖倍数 Proliferation multiple
澳0	2号增殖培养基	MS+6-BA 3.0 mg/L+AD 3.0 mg/L+10% CM	3.0^a
澳4	2号增殖培养基	MS+6-BA 3.0 mg/L+AD 3.0 mg/L+10% CM	3.0^a

	注：同列数据后相同小写字母表示在0.05水平上差异不显著。
	Note: The same lowercase letters after the same column indicate no significant difference at the 0.05 level.

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图7 ‘澳0’的增殖情况

Fig. 7 Proliferation of D. kingianum ‘D0’

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**图8 ‘澳4’的增殖情况 Fig. 8 Proliferation of D. kingianum ‘D4’**

2.2.2 ‘金斯卡’的增殖培养将诱导出的‘金斯卡’芽分别接种在1号、2号和3号增殖培养基中,结果见表3和图9。从表3可看出,不同增殖配方对‘金斯卡’有显著影响,其中2号和3号培养基之间差异不显著,但2号、3号与1号之间差异显著,说明2号和3号增殖培养基均有利于澳洲鸽子石斛芽的增殖,但高浓度的6-BA和AD对增殖无明显效果。

表3 不同培养基处理对‘金斯卡’芽增殖的影响

Tab. 3 Effects of different treatment on proliferation of buds in D. kingianum ‘DJ’

培养基 Culture medium	培养基配方 Medium formulation	增殖倍数 Proliferation multiple
1号增殖培养基	MS+6-BA 2.0 mg/L+AD 2.0 mg/L+10% CM	2.1^b
2号增殖培养基	MS+6-BA 3.0 mg/L+AD 3.0 mg/L+10% CM	3.2^a
3号增殖培养基	MS+6-BA 4.0 mg/L+AD 4.0 mg/L+10% CM	3.3^a

	注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。
	Note: Different lowercase letters after the same column indicate significant difference at the 0.05 level.

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图9 不同培养基处理对‘金斯卡’芽增殖的情况

Fig. 9 The effect of different medium treatment on the bud proliferation of D. kingianum ‘DJ’

2.3 澳洲鸽子石斛兰‘金斯卡’的生根培养

澳洲鸽子石斛兰‘金斯卡’生根情况见表4,培养60 d后不同生根培养基对‘金斯卡’的生根有影响,其中2号生根培养基和3号生根培养基差异不显著,生根率分别为92.6%和93.2%,说明2号和3号生根培养基有利于澳洲鸽子石斛兰‘金斯卡’生根培养。同时,组培苗‘金斯卡’出瓶移栽种植1 a后见图10。

表4 不同配方处理对‘金斯卡’生根壮苗的影响

Tab. 4 Effects of different treatment on rooting and growth of D. kingianum ‘DJ’

培养基 Culture medium	培养基配方 Medium formulation	生根率 Rooting rate/%
1号生根培养基	1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+10% CM	81.2^b
2号生根培养基	1/2 MS+NAA 0.3 mg/L+10% CM	92.6^a
3号生根培养基	1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+10% CM	93.2^a

	注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。
	Note: Different lowercase letters after the same column indicate significant difference at the 0.05 level.

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图10 ‘金斯卡’出瓶移栽1 a后的生长情况

Fig. 10 The growth of ‘DJ’ after transplanting for one year

3 讨论

在已报道的兰花组织培养中,利用花梗进行组织培养是蝴蝶兰快速繁殖最有效的方法^[9,10,11],同时在文心兰^[12,13]、树兰^[14]和万代兰^[15]等方面也有报道,而石斛兰主要采用假鳞茎^{[1, 4-6, 16-22]}和幼嫩叶片^[23]为外植体进行组织培养和快速繁殖,但利用花梗进行组培研究的报道较少^[24]。本研究采用澳洲鸽子石斛兰花梗侧芽作为外植体进行组培试验,其中有70.6%的花梗茎段因不能诱导出侧芽,或侧芽过于弱小而死亡,仅有‘澳0’‘澳4’‘金斯卡’的花梗侧芽分别在诱导培养基1号和2中诱导出芽,说明澳洲鸽子石斛兰在合适的培养基上能诱导出芽,但效率较低。

在澳洲鸽子石斛兰芽的诱导过程中,6-BA浓度为2.0 mg/L并添加NAA 0.5 mg/L,均能诱导出芽,这与华海霞^[25]、李金雨等^[26]在蝴蝶兰花梗芽的诱导和李杰等^[15]在万代兰花梗芽的诱导方面的研究结果一致,即当6-BA浓度为2.0~3.0 mg/L时,添加少量NAA,芽的诱导效果较好。同时,诱导培养基添加或不添加活性炭对试验影响不大,主要是与花梗分泌酚类化合物较少有关^[27]。

从花梗诱导出的芽在增殖培养基中,6-BA和AD均能有效地促进苗的增殖,并获得大量的丛生芽,这与陆顺教等^[20]和Martin等^[28]在秋石斛新生侧芽增殖,以及杨录军等^[29]在蝴蝶兰新品种‘郑农火凤凰’的组培快繁的研究结果一致,即影响丛生芽增殖最大的因素是6-BA,其次是AD;莫远琪等^[1]也认为6-BA的浓度在2.0~3.0 mg/L时有利于澳洲鸽子石斛兰丛生芽的增殖。但Jonojit等^[21]、Sujjaritthurakarn等^[22]、Chung等^[24]认为不同浓度的TDZ能有效地诱导出类原球茎,同时能进行丛生芽增殖。因此,澳洲鸽子石斛兰芽的增殖还需进一步研究。

生根壮苗在组织培养过程中直接影响组培苗的移栽成活率,NAA对生根具有重要作用。本研究中,0.3~0.5 mg/L NAA有利于澳洲鸽子石斛兰‘金斯卡’生根培养,与陆顺教等^[20]和张晓申等^[30]的研究结果一致。

4 结论

在澳洲鸽子石斛兰芽的诱导过程中,6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L有利于花梗芽的诱导;在增殖过程中,6-BA 3.0 mg/L+AD 3.0 mg/L适合于澳洲鸽子石斛兰芽的增殖,其中由于‘澳0’‘澳4’‘澳5’‘澳11’‘澳12’‘澳13’的外植体数量较少,导致在增殖过程中诱导出的芽数偏少而无法做增殖梯度试验,在接下来的研究中应增加外植体及在获得少量无菌不定芽的基础上,再进行多次继代培养,然后进行更多增殖培养基的筛选和生根实验;而培养基1/2 MS+NAA 0.3~ 0.5 mg/L+10% CM适宜澳洲鸽子石斛兰‘金斯卡’的生根培养。

References

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[1]	莫远琪, 郑枫, 房林, 等. 澳洲鸽子石斛组织培养快速繁殖研究[J]. 植物生理学报, 2018,54(4):677-685.

[2]	王雁, 周进昌, 郑宝强, 等. 石斛兰[M]. 北京: 中国林业出版社, 2015: 95-99

[3]	江南, 陆晓珊, 莫晓茹, 等. 澳洲鸽石斛组植物的育种情况分析[J]. 中国园艺文摘, 2018,34(6):10-16.

[4]	Prażak R. Influence of aluminium from AlCl₃ on differentiation and growth of Dendrobium kingianum Bidwill in in vitro conditions[J]. Plant Nutrition, 2001(92):178-179.

[5]	Prażak R. Inﬂuence of cobalt concentration on the growth and development of Dendrobium kingianum Bidwill orchid in an in vitro culture[J]. Journal of Elementology, 2014,19(2):495-506.

[6]	Prażak R, Molas J. Effect of copper concentration on micropropagation and accumulation of some metals in the Dendrobium kingianum Bidwill orchid[J]. Journal of Elementology, 2015,20(3):693-703.

[7]	Habiba S U, Shimasaki K, Ahasan M M, et al. 5-Aminolevulinicacid regulates growth and development of protocorm-like bodies (PLBs) in Dendrobium kingianum cultured in vitro[J]. Middle-East Journal of Scientific Research, 2014,22:279-283.

[8]	Habiba S U, Shimasaki K, Ahasan M M, et al. Effectsof different light quality on growth and development of protocorm-like bodies (PLBs) in Dendrobium kingianum cultured in vitro[J]. Bangl Research Publish Journal, 2014,10(2):223-227.

[9]	张彦妮, 边红琳, 陈立新. 蝴蝶兰幼嫩花梗组织培养和快速繁殖[J]. 草业科学, 2011,28(4):590-596.

[10]	曾德华, 郁培义, 陈伟玉, 等. "满天红"蝴蝶兰花梗组培快繁技术研究[J]. 热带林业, 2014,42(1):46-49, 32.

[11]	黄丹, 陈和明, 吕复兵. 蝴蝶兰丛生芽组织培养研究进展[J]. 广东农业科学, 2017,44(10):19-24, 2.

[12]	孔庆彪, 满若君, 卜朝阳. 文心兰组织培养初步研究[J]. 广西农业科学, 2009,40(1):11-14.

[13]	王安石, 韩松, 陈施明, 等. 切花文心兰花梗芽组培快繁技术研究[J]. 广东农业科学, 2015,42(4):23-27.

[14]	易双双, 陆顺教, 尹俊梅, 等. 树兰组织培养外植体消毒方法初探[J]. 基因组学与应用生物学, 2014,33(4):897-901.

[15]	李杰, 匡萍, 张银洁. ‘卓锦’万代兰花梗诱导植株再生的研究[J]. 中国农学通报, 2014,30(7):126-129.

[16]	贺佳, 彭峰, 江玉梅, 等. 石斛兰组织培养和快速繁殖体系的建立与优化[J]. 江苏农业科学, 2010(6):70-72.

[17]	王伟, 卢珊, 葛冰, 等. 大苞鞘石斛组织培养快繁研究[J]. 热带作物学报, 2017,38(4):652-658.

[18]	彭智华, 罗绍强. 铁皮石斛组培培养研究[J]. 林业与环境科学, 2017,33(6):80-83.

[19]	陈齐明, 鲍晓红, 高小坤, 等. 秋石斛丛生芽诱导增殖技术研究[J]. 福建林业, 2017(6):33-37.

[20]	陆顺教, 易双双, 任羽, 等. 秋石斛新生侧芽中部茎段组培快繁体系的建立[J]. 南方农业学报, 2015,46(8):1436-1441.

[21]	Jonojit R, Soumi N, Madhumita M, et al. Direct and callus-mediated protocorm-like body induction from shoot-tips of Dendrobium chrysotoxumLindl[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2007,90(1):31-39. DOI

[22]	Sujjaritthurakarn P, Kanchanapoom K. Efficient direct protocorm-like bodies induction of dwarf Dendrobium using thidiazuron[J]. Notulae Scientia Biologicae, 2011,3(4):88-92. DOI

[23]	Teixeira da Silva J A, Cardoso J C, Dobránszki J, et al. Dendrobium micropropagation: a review[J]. Plant Cell Reports, 2015,34(5):671-704. DOI PMID

[24]	Chung H H, Chen J T, Chang W C. Plant regeneration through direct somatic embryogenesis from leaf explants of Dendrobium[J]. Biologia Plantarum, 2007,51(2):346-350. DOI

[25]	华海霞蝴蝶兰丛生芽组织培养的研究[J]. 安徽农业科学, 2014,42,(34):12 059-12 060, 12 064.

[26]	李金雨, 洪丽萍. 蝴蝶兰丛生芽途径的组织培养技术[J]. 热带作物学报, 2010,31(4):610-613.

[27]	朱文祥, 王金荣, 李珺, 等植物组织培养中外植体褐变研究进展[J]. 安徽农业科学, 2010, 38(31):17 399- 17 401, 17 415.

[28]	Martin K P, Geevarghese J, Joseph D, et al. In vitro propagation of Dendrobium hybrids using flower stalk node explants[J]. Indian Journal of Experimental Biology, 2005,43(3):280-285. PMID

[29]	杨录军, 王俊, 杨书才, 等. 蝴蝶兰新品种"郑农火凤凰"的组培快繁技术研究[J]. 陕西农业科学, 2015,61(11):52-54.

[30]	张晓申, 王慧瑜, 李晓青. 蝴蝶石斛的组培快繁技术研究[J]. 北方园艺, 2007(9):193-194.

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1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

图1 澳洲鸽子石斛兰的花梗及花梗节间

2 结果与分析

2.1 澳洲鸽子石斛兰花梗的诱导培养

表1 澳洲鸽子石斛兰花梗芽诱导培养

图2 ‘澳0’在1号诱导培养基中诱导出芽

图3 ‘澳4’在2号诱导培养基中诱导出芽

图4 ‘金斯卡’在1号和2号诱导培养基中均诱导出芽

图5 ‘澳5’和‘澳11’在1号和2号诱导培养基中均未诱导出芽

图6 ‘澳12’和‘澳13’在1号和2号诱导培养基中均未诱导出芽

2.2 澳洲鸽子石斛兰芽的增殖培养

表2 2号增殖培养基对‘澳0’和‘澳4’芽增殖的影响

图7 ‘澳0’的增殖情况

图8 ‘澳4’的增殖情况 Fig. 8 Proliferation of D. kingianum ‘D4’

表3 不同培养基处理对‘金斯卡’芽增殖的影响

图9 不同培养基处理对‘金斯卡’芽增殖的情况

2.3 澳洲鸽子石斛兰‘金斯卡’的生根培养

表4 不同配方处理对‘金斯卡’生根壮苗的影响

图10 ‘金斯卡’出瓶移栽1 a后的生长情况

3 讨论

4 结论

References

**图8 ‘澳4’的增殖情况 Fig. 8 Proliferation of D. kingianum ‘D4’**