在高等植物中,脂肪酸合成在细胞的质体脂肪酸合酶复合体（fatty acid synthetases, FAS）中进行,FAS由乙酰CoA-ACP转移酶、丙二酸单酰CoA转移酶、β-酮脂酰ACP合酶、β-酮脂酰ACP还原酶、β-羟脂酰ACP脱水酶、烯脂酰ACP还原酶和1个含巯基的酰基载体蛋白（acyl carrier protein, ACP）组合形成的复杂而松散结构[1]。FAS催化乙酰辅酶A与酰基-ACP缩合成4:0-ACP,进而连续催化酰基碳链以每个循环增加2个碳单位进行延伸[2]。对于多数植物而言,仅有少量的硬脂酸（C18:0）被转运出质体,因此硬脂酸很少在种子中富集[3];FAS虽偏爱合成18:0-ACP,部分16:0-ACP也会提前从FAS中释放出来,从而形成棕榈酸（16:0）,一些植物会合成更短的癸酸（C10:0）或月桂酸（C12:0）[4,5]。18:0-ACP在十八烷酰-ACP去饱和酶（stearoyl-ACP desaturase, SAD）的催化下生成18:1-ACP,进而形成油酸（C18:1）。
酰基-ACP硫酯酶（fatty acyl-ACP thioesterase, FAT）水解酰基和ACP 之间的硫酯键,释放出游离脂肪酸和ACP,终止脂肪酸合成[6,7]。脂肪酸之后被运送到细胞质中进一步酯化形成脂酰-CoA,在甘油-3-磷酸酰基转移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT）和溶血磷脂酸酰基转移酶（lysophosphatidic acid acyltransferase, LPAT）的催化下,分别转移到甘油-3-磷酸（G3P）sn-1和sn-2位置,依次生成溶血磷脂酸（LPA）和磷脂酸（PA）,sn-3位置上的磷酸由磷脂酸磷酸酶（phosphatidic acid phosphatase, PAP）催化脱去,生成二酰甘油（diacylglycerol, DAG）。在二酰甘油酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferase, DGAT）催化下,将酰基CoA的脂肪酸转移到DAG上sn-3位置,生成三酰甘油（TAG）[8,9]。
FAT是由核基因编码,在质体中发挥作用的靶向可溶性酶,根据氨基酸序列和底物偏好性分为FATA和FATB 2个亚族[10]。FATA偏好不饱和酰基-ACP,尤其对18:1-ACP活性最高;而FATB通常对饱和酰基-ACP显示出高活性,对18:1-ACP也有一定的活性[11,12]。FAT的功能在很大程度上决定植物体内脂肪酸链的长度和不饱和度,并影响脂肪酸组分及含量[13,14]。拟南芥AtFATB功能缺失后,不同组织中饱和脂肪酸的总量相比于野生型减少了40%~50%,并且棕榈酸比例明显降低[15]。将麻风树JcFATB1在拟南芥中过表达会导致饱和脂肪酸含量增加,尤其是棕榈酸比例大幅增加,而不饱和脂肪酸比例显著降低[16]。
可可（Theobroma cacao L.）与咖啡、茶并称为世界三大饮料作物,有悠久的栽培历史,被誉为“上帝的食物”。可可属于梧桐科（Sterculiaceae）可可属（Theobroma）,多年生常绿小乔木,茎干上开花结果,果实为纺锤形,成熟呈橙黄色,内含30~50粒种子,种子富含油脂（可可脂）、蛋白、纤维、多酚等成分。可可脂作为最重要的成分,含量占可可豆的50%左右。可可脂具备独特的物理与化学性质,熔点在35~36.5 ℃之间,入口即化,并具有舒缓、保湿功效,是制作巧克力、化妆品、药品等的重要原料[17]。成熟可可种子中棕榈酸（16:0）、硬脂酸（18:0）、油酸（18:1）总量占到可可脂含量的90%以上[18];脂肪酸聚合形成1,3-二棕榈酸-2-油酸甘油酯（1,3-dipalmitoyl-2-oleoylglycerol, POP）、1,3-二硬脂酸-2-油酸甘油酯（1,3-distearoyl-2-oleoylglycerol, SOS）、1(3)-棕榈酸-2-油酸-3(1)-硬脂酸甘油酯（1(3)-palmitoyl-3(1)stearoyl-2-oleoylglycerol, POS）[19]。三者在可可种子中配比稳定,合成的POP、POS、SOS比例趋于22:46:32,归因于三酰甘油结构与配比,可可脂具体独特的理化性质,熔点刚低于人体温度。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用种质材料,保存于中国热带农业科学院香料饮料研究所试验基地,为前期鉴定筛选出的性状差异可可种质‘Z216’和‘Z115’;2份种质幼果颜色均为绿色,其中种质‘Z216’鲜果重为653.6 g、果长为153.9 cm、种子厚为6.1 mm、种子可可脂含量为49.1%,种质‘Z115’鲜果重为504.0 g、果长为165.7 cm、种子厚为8.6 mm、种子可可脂含量为42.5%。可可树开花成果时期,挂牌标记,在果实不同发育时期分别剥取种子,立即置于液氮中速冻后,保存于-80 ℃冰箱中备用。试验用RNA提取试剂盒（R6827-01）购自Omega公司,cDNA反转录试剂盒（K1621）购自Fermentas公司,实时荧光定量PCR试剂SYBR® Green Realtime PCR Master Mix（QPK- 201）购自TaKaRa公司,其他生化试剂均为进口或国产分析纯试剂。
1.2 可可FAT基因序列获取及分析
依托可可全基因组序列,利用BLAST工具搜索分析可可FAT基因家族成员序列。具体方法如下,利用油棕已知FAT基因序列在可可全基因组数据库（http://www.cacaogenomedb.org）进行BlastP分析,筛选鉴定可可FAT基因序列。利用GSDS软件分析可可FAT基因的外显子/内含子基因结构。在ExPASy网站（http://expasy.org/tools/）利用在线工具对可可FAT蛋白保守性、等电点、分子量、跨膜结构、亚细胞定位等进行分析预测。
1.3 可可FAT基因进化分析
基于可可FAT蛋白序列,在NCBI GenBank数据库搜索出木本棉（Gossypium arboretum,8条）、辣椒（Capsicum annuum,3条）、巴西橡胶（Hevea brasiliensis,10条）、海岛棉（Gossypium barbadense,14条）、蓖麻（Ricinus communis,5条）、凤梨（Ananas comosus,1条）、金钱橘（Citrus clementine,2条）、猕猴桃（Actinidia chinensis,5条）、中粒种咖啡（Coffea canephora,2条）、海枣（Phoenix dactylifera,2条）、苹果（Malus domestica,8条）、油桐树（Vernicia fordii,2条）、油棕（Elaeis guineensis,1条）、花生（Arachis hypogaea,10条）、陆地棉（Gossypium hirsutum,18条）、谷子（Setaria italic,1条）、芝麻（Sesamum indicum,4条）、芒果（Mangifera indica,1条）、番茄（Solanum lycopersicum,1条）、大豆（Glycine max,7条）、山竹（Garcinia mangostana,1条）、油菜（Brassica napus,2条）、长蒴黄麻（Corchorus olitorius,6条）、藜麦（Chenopodium quinoa,2条）、胡桃（Juglans regia,8条）、甜橙（Citrus sinensis,6条）、莴苣（Lactuca sativa,1条）、亚麻荠（Camelina sativa,1条）、欧洲橄榄（Olea europaea,4条）、拟南芥（Arabidopsis thaliana,1条）、烟草（Nicotiana tabacum,3条）、葡萄（Vitis vinifera,9条）、榴莲（Durio zibethinus,13条）FAT同源序列,结合可可（Theobroma cacao,6条）FAT序列,利用MEGA 5.0软件[23]对以上33种植物169条FAT序列进行分子系统学分析;采用Neighbour-joining聚类方法,进行1000次bootstrap统计学检测。
1.4 可可FAT基因表达模式分析
参照Omega RNA提取试剂盒操作手册,提取各可可种子样品总RNA,并用DNase I处理总RNA后,用1%琼脂糖凝胶检测总RNA质量和浓度。RNA提取之后,用ddH2O将各样品总RNA浓度稀释调整后,及时用Fermentas反转录试剂盒进行反转录,合成cDNA第一条链,并将产物用ddH2O稀释50倍保存于-20 ℃冰箱中备用。
利用实时荧光定量PCR技术对TcFAT基因家族成员进行时空表达模式分析,以ACTIN作为内参基因[24]。扩增TcFAT基因及内参基因的特异引物用Primer Premier 5.0软件进行设计,由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;引物序列见表1。PCR反应体系为10 μL,包含2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix,10 μM的上下游引物各0.5 μL,稀释50倍的cDNA模板4.0 μL,每个反应组合3个重复。PCR反应在ABI QuantStudio 6 Flex荧光定量PCR仪上进行,程序为95 ℃预变性3 min;95 ℃变性10 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,进行40个循环。每个循环采集一次荧光数据,反应之后从58 ℃到95 ℃,以0.1 ℃/s 绘制熔解曲线。运用2-ΔΔCT方法分析实时荧光定量数据。
表1 TcFAT基因荧光定量PCR引物Tab. 1 Primers used in real-time PCR analysis of TcFAT genes |
| 基因Genes | 引物序列Primer sequences |
|---|---|
| TcFATA | F: 5°-GCCCAATGCAGATTCCTCG-3° |
| R: 5°-TCCCACCTCATAACACCTCACA-3° | |
| TcFATB1 | F: 5°-TGTTAGCGGATAATTGAGGTT-3° |
| R: 5°-CTGGGAGGAGGGGAACTA-3° | |
| TcFATB2 | F: 5°-AAAGAATACGGTCTGGCTTAGC-3° |
| R: 5°-ATTGGATTTCCGGCATTCA-3° | |
| TcFATB3 | F: 5°-CCTCTTGCTAATGTCCACGA-3° |
| R: 5°-AATCCATTGCTCAGAAGTCC-3° | |
| TcFATB4 | F: 5°-AAAAAACTAGACAACACCGTAAA-3° |
| R: 5°-TCTGATACCTGTGATTGCTCCT-3° | |
| TcFATB5 | F: 5°-TCTAACTATTATGGCAGCATCT-3° |
| R: 5°-TCCTTCAGGCTTTCTATCA-3° | |
| TcACT | F: 5°-TCCTCTTCCAGCCATCTCTC-3° |
| R: 5°-TCTCCTTGCTCATTCGGTCT-3° |
1.5 可可种子脂肪酸组分分析
将干燥的‘Z216’和‘Z115’可可种子,利用粉碎机粉碎,过40目筛后,利用乙醚-石油醚混合液萃取获得粗脂肪。可可粗脂肪甲酯化,过滤后置于样品瓶,进行GC-MS分析检测。GC-MS程序为:初始温度为100 ℃,以5 ℃/min的速率升至215 ℃,保持5 min;再以1 ℃/min的速率升至224 ℃,保持5 min,检测结束。
2 结果与分析
2.1 可可FAT基因家族成员获取与序列分析
以油棕FAT基因序列为模板,利用BLAST工具搜索可可基因组数据库,比对出6条可可FAT序列;通过序列比对分析并结合可可全基因组序列注释,有1条可可FAT序列归属于FATA亚族,5条FAT序列归属于FATB亚族,将6条序列分别命名为TcFATA、TcFATB1、TcFATB2、TcFATB3、TcFATB4、TcFATB5。其中,TcFATA位于1号染色体上,TcFATB1位于9号染色体上,TcFATB2、TcFATB4位于3号染色体上,TcFATB3位于2号染色体上。
可可FAT基因家族的内含子个数、CDS长度、氨基酸数目、分子量差别等理化性质非常相似,而成员间等电点差异较明显（表2）。6个可可FAT基因CDS长度介于1128~1263 bp,氨基酸数目介于375~420 aa,预测蛋白分子量介于42.72~ 46.47 kDa,等电点介于6.57~9.10。序列比对表明,TcFATB4与其他家族成员间氨基酸保守性最高,平均一致性达44.19%,TcFATB5与其他家族成员间氨基酸保守性最低,平均一致性为32.34%;其中,TcFATB3与TcFATB4氨基酸一致性最高达60.36%,TcFATB3与TcFATB5氨基酸一致性最低仅为28.53%（表2）。TMHMM工具分析结果表明,6个TcFATs均不包含跨膜结构,属于胞质可溶性蛋白;利用ProtComp工具分析6个TcFATs亚细胞定位,结果表明6个蛋白均定位于叶绿体中。
表2 TcFAT基因家族成员特征Tab. 2 Characteristics of TcFAT gene family members |
| 基因 Genes | 基因组编号 Locus | 编码区 CDS/bp | 氨基酸数目 Amino acid/aa | 蛋白分子量 Molecular weight/kDa | 等电点 Isoelectric point | FATB1 | FATB2 | FATB3 | FATB4 | FATB5 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| TcFATA | Tc01g022130 | 1128 | 375 | 42.72 | 6.68 | 41.55 | 37.85 | 38.92 | 38.14 | 32.61 |
| TcFATB1 | Tc09g010360 | 1263 | 420 | 46.47 | 6.57 | 46.22 | 43.13 | 47.19 | 40.82 | |
| TcFATB2 | Tc03g015170 | 1188 | 395 | 45.25 | 9.10 | 46.71 | 45.95 | 30.47 | ||
| TcFATB3 | Tc02g017580 | 1188 | 395 | 44.98 | 8.93 | 60.36 | 28.53 | |||
| TcFATB4 | Tc03g003720 | 1176 | 391 | 44.40 | 9.04 | 29.29 | ||||
| TcFATB5 | Tc00g060380 | 1131 | 376 | 42.89 | 8.51 |
2.2 可可FAT基因家族结构及系统进化分析
通过分析TcFAT基因结构外显子/内含子结构发现,TcFAT基因家族成员外显子数目为6~7个（图1）。与拟南芥FAT基因结构作对比,外显子数目相似,表明植物FAT的外显子/内含子组织结构在进化中非常保守;TcFATA、TcFATB1与基因家族其他成员间外显子/内含子长度差异较大。6个基因均含有长度为69、114 bp的外显子。TcFATB2、TcFATB3、TcFATB4基因间CDS序列长度相似,长度为69、114、134 bp外显子位于基因序列中相似位置,除此之外的外显子长度、位置均有差异。6个TcFAT基因大部分内含子长度在80~180 bp之间,最长的内含子为TcFATA的第4个内含子长度为5514 bp。
利用MEGA 5.0,将6条TcFAT蛋白序列与来自其他33个植物共169条FAT蛋白序列进行对比,构建系统进化树,如图2所示。FAT蛋白分为FATA和FATB 2个类群,在FATA类群中,TcFATA与甜橙、金钱橘、长蒴黄麻在同一分支上,表明TcFATA在进化上与芸香科、椴树科亲缘关系较近。FATB类群基因数目较大,可分成3个亚类群,TcFATB1、TcFATB5各归属于一个亚类群,TcFATB2、TcFATB3、TcFATB4同属于一个亚类群;每个亚类群均包含单子叶与双子叶的FATB成员,表明FATB类群的祖先基因在单双子叶分化之前已经发生了分化。对可可而言,TcFATB在各亚类群中与长蒴黄麻、陆地棉、海岛棉、榴莲FATB聚在同一分支中,从一定程度上表明可可在进化上与其分化年代相近。
图2 可可TcFAT与其他植物FAT蛋白聚类分析N-J无根进化树利用MEGA 5.0 软件绘制,TcFATs用黑色方形标注。 Fig. 2 Phylogenetic analysis of the TcFAT proteins and other plant FAT homologs Unrooted phylogenetic tree of plant FAT proteins is constructed using the neighbor-joining method with MEGA 5.0 program. TcFATs, in this study, marked with black square. |
2.3 可可FAT基因家族表达模式分析
利用Real-time PCR技术分析TcFAT基因家族在不同果实发育阶段表达模式,6个TcFAT基因中,TcFATB2、TcFATB3、TcFATB4、TcFATB5的运行Ct值在35以上,而内参ACTIN的Ct值为20左右,TcFATB2-5的基因表达量可以忽略不计,因此本研究着重分析TcFATA和TcFATB1的表达模式。TcFATA和TcFATB1在可可果实不同发育时期均有表达,在幼果中表达量最高,伴随果实发育成熟,表达量呈下降趋势（图3）。在不同果实发育时期,‘Z115’种质中TcFATA表达量均高于‘Z216’种质,果实发育到147 d时,TcFATA基因在‘Z115’中表达量达‘Z216’的4.7倍;而对于TcFATB1基因,‘Z216’种质在不同果实发育时期的表达量高于‘Z115’种质,果实发育到126 d时,TcFATA基因在‘Z216’中表达量达‘Z115’的5.9倍。
2.4 可可FAT基因表达量与脂肪酸组分关系
GC-MS生成的可可脂肪酸质谱数据,经数据库检索分析和面积归一化计算,结果表明棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）和亚油酸（C18:2）是可可脂的主要组分,4种主要脂肪酸占比达可可脂的98%以上。在‘Z115’种质中,棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸比例分别是29.16%、30.30%、35.78%、3.01%;在‘Z216’种质中,棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸比例分别是38.76%、29.56%、28.58%、2.14%。‘Z115’种质的油酸比例比‘Z216’种质高7.20%,而棕榈酸比例低9.6%,与TcFATA和TcFATB1表达趋势一致（图4）。
3 讨论
可可是世界重要的饮料作物,也是一种油料作物,可可脂中主要的组分是棕榈酸、硬脂酸和油酸,因其脂肪酸组分的特定比例,表现出特定的理化性质,熔点35~37 ℃,是制作巧克力等主要原料。克里奥洛（Criollo）和弗拉斯特洛（Forastero）可可全基因组已经测序完成,为可可基因家族的克隆提供了便利,本研究从可可基因组中获得6条FAT序列;然而,已测得的可可基因组序列分别占到克里奥洛和弗拉斯特洛可可的76%和92%,在未测得的可可基因组序列中仍可能存在未知的可可FAT基因。获得的6条FAT基因序列,TcFATB3和TcFATB4含有5个内含子,其余4条序列均含有6条内含子,基因的内含子数目保守;6个预测蛋白平均含有392个氨基酸,平均分子量为44.5 kDa,与植物中其他FAT成员类似[21, 25]。
在本研究中,TcFATA和TcFATB1伴随种子发育成熟,表达量呈下降趋势,表明在种子发育前中期基因大量表达,决定着可可脂肪酸组分。然而,不同可可种质的脂肪酸组分比例存在一定差异,‘Z216’可可种质棕榈酸（C16:0）比例较高,‘Z115’可可种质油酸（C18:1）比例较高,这与TcFATA和TcFATB1表达模式相同。FAT是调控脂肪组分的关键酶,FATA对油酯-ACP（C18:1-ACP）有较高活性,决定C18:1转运到质体外的水平,对C18:0-ACP和C16:0-ACP活性较低;而FATB对饱和油酯-ACP活性较高,偏向于水解C18:0的脂酰-ACP[29,30]。在种子发育的不同时期,TcFATA在‘Z115’种质中的表达量均高于‘Z216’,而TcFATB1在‘Z216’种质中的表达量均高于‘Z115’,从一定程度印证了FATA和FATB对底物的偏向性。
本研究对可可FAT基因家族成员的基因组织结构、进化关系、基因表达模式及与脂肪酸组分间关系进行了系统的分析,结果可为分析FAT基因家族成员理化功能提供研究基础,为解析可可脂特定理化性质提供参考。