1 植物组织培养
从20世纪后半叶开始,植物组织培养技术发展迅速。利用组织培养技术,植物外植体可以产生大量高度一致的无性系植株,用于培育新品种,也可据此构建遗传转化体系,开展基因功能研究。植物组织培养的理论依据是植物“细胞全能性”。无菌条件下,分别在愈伤诱导、体细胞胚胎发生、生根等培养基上进行培养,就可以诱导出愈伤组织、胚状体、不定芽和根等器官,最终形成再生植株。植物组织培养主要涉及脱分化和再分化过程,脱分化涉及染色质水平的动态重构,以此来诱导形成愈伤组织。随后改变培养基中生长调节物,增殖细胞开始再分化,诱导器官发生或形成植株。然而,植物组织培养的时间和难度受物种、外植体类型、培养基成分和环境因素影响,研究表明,DNA甲基化与其存在紧密联系[12]。另外,研究人员希望通过植物体细胞无性繁殖生产出与外植体完全一致的个体,然而实际情况并不是这样,体细胞无性系变异（包括生理生化、生物学特性、染色体数目和结构、DNA分子水平等变异）在植物组织培养过程中非常普遍。在分子水平上,体细胞无性系变异受DNA甲基化等表观遗传变异的影响[8, 10, 13]。
2 DNA甲基化
表观遗传学是目前研究的热点之一,其领域主要集中在DNA甲基化、基因组印记、核仁显性、母本效应、基因沉默、休眠转座子激活以及RNA编辑等几个方面[14]。DNA甲基化是其中重要的形式之一。在植物基因组中,DNA甲基化主要为5甲基胞嘧啶（5mC）,但也有少量的N6甲基腺嘌呤（6mA）和7-甲基鸟嘌呤（7mG）存在。植物基因组中DNA甲基化比例为6%~30%。DNA甲基化是一种被广泛研究的表观遗传修饰方式,在调控植物再生过程中的基因表达和染色质构象等方面发挥重要作用[15]。DNA甲基化通常主要指胞嘧啶的5′C位置的甲基化,主要在基因组序列中的CG、CHG和CHH序列（H指A、C或T）中的胞嘧啶上发生[16]。一般来说,高度DNA甲基化会抑制基因表达,去甲基化可以激活基因表达。拟南芥基因组3种甲基化水平分别约为24%、6.7%和1.7%[15]。高度重复序列、启动子区、编码区域、基因间隔区是甲基化高发区。拟南芥基因启动子区域DNA甲基化比例大于5%,编码区DNA甲基化比例在1/3以上。总体情况是,启动子区甲基化和编码区DNA甲基化与转录水平高度相关。编码区DNA甲基化程度高,则基因转录水平也越高,启动子区甲基化程度高,转录水平则降低。目前研究认为,被子植物中存在至少5类基因甲基化模式：基因未发生甲基化,基因发生甲基化,基因转录起始位点甲基化,基因转录区域较高的CG和CHG甲基化,以及基因转录区域较高的CHH甲基化[16]。
2.1 DNA的从头甲基化和维持
在高等植物中,DNA胞嘧啶甲基化的状态由DNA甲基化转移酶、DNA去甲基化酶、组蛋白修饰酶、核染色质重塑因子以及RNA干扰机制共同维持[16,17,18,19]。在植物中,可能有2种甲基化模式：①从头甲基化,是指原本未甲基化的DNA双链进行甲基化的过程,通过维持甲基化的酶来保持其稳定状态;②DNA甲基化的维持,指甲基化模式在细胞分裂过程中复制的过程,通过维持甲基化酶的作用,以半保留复制方式将亲本的甲基化模式传递给子代。植物的从头甲基化由域重排甲基化转移酶DRM2（domains rearranged methyltransferase 2）催化,而甲基化状态通过3个不同途径维持：①CG甲基化是植物基因组中最普遍的胞嘧啶甲基化类型,在DNA复制过程中主要由甲基转移酶MET1（methyltransferase 1）催化和维持;②CHG甲基化主要由染色质甲基化酶CMT3（chromomethylase 3）和染色质甲基化酶CMT2（chromomethylase 2）催化维持;③CHH序列甲基化主要由DRM2和CMT2共同维持。
2.2 DNA去甲基化
2.3 主要的DNA甲基化基因
2.3.1 甲基转移酶1基因（MET1） 从拟南芥中最先克隆了第1个编码植物DNA甲基转移酶的基因MET1,该基因编码的甲基转移酶和动物中DNA甲基转移酶DNMTl同源性很高,主要是维持CG位点的甲基化[21]。MET1还参与由RNA介导的DNA甲基化过程（RNA-directed DNA methylation,RdDM）。在不存在RNA引物时,RdDM可遗传的甲基化只发生在对称位点的胞嘧啶上,并且需要MET1的维持。MET1与DRM共同作用参与RNA介导的CG位点二核苷酸的重新甲基化。
2.3.2 染色质甲基化酶基因（CMT） 拟南芥中最先鉴定出染色质域甲基转移酶,这是植物特有的DNA甲基化酶,结构与哺乳动物的DNMTl相似,主要维持CHG位点的甲基化[22]此外,CMT还维持其他序列的甲基化。
2.3.3 结构域重排甲基转移酶基因（DRM） 植物中的DRM基因家族与哺乳动物的DNMT3基因家族同源,拟南芥DRM家族有2个成员：DRM1和DRM2,它们的功能是催化植物中非对称位点的从头甲基化,主要依靠RdDM完成[23]。DRM和CMT共同参与非CG位点的甲基化。
2.3.4 沉默抑制因子基因（ROS1） 拟南芥ROS1基因编码有内切酶Ⅲ结构域的核蛋白,其具有对甲基化DNA的糖基化酶和裂解酶的活性[24]。ROS1作为一种DNA修复蛋白,通过对靶基因启动子去甲基化抑制基因沉默。
2.3.6 Demeter DNA糖基化酶2/3基因（DML2/3） 拟南芥DML2和DML3是5-甲基化胞嘧啶DNA糖基化酶,在植物器官中广泛表达[27]。DML2和DML3不仅可以移除部分胞嘧啶的甲基化,还能维持某些位点的高甲基化水平。
2.4 DNA甲基化的主要检测方法
2.4.1 甲基化敏感扩增多态性PCR法 甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）PCR方法分别使用同裂酶MSP I、Hpa II与内切酶EcoR I组合对基因组DNA进行双酶切,从而得到片段大小不同的DNA片段,然后连上相应的内切酶接头,根据接头序列设计相应的引物进行预扩增和选择性扩增。利用聚丙烯凝胶电泳、毛细管电泳或者其他方法检测扩增出的差异片段。MSP I和Hpa II具有相同的识别位点（5′-CCGG-3′）,但是对甲基化的敏感程度不同。Hpa II能识别并切割非甲基化位点与单链甲基化位点,不能切割双链甲基化位点,即不能消化含mCCGG、CmCGG、mCmCGG的位点;MSP I能识别并切割非甲基化位点和双链内侧胞嘧啶甲基化位点,不能切割单链外侧胞嘧啶甲基化位点,即不能切割UmCCGG、mCmCGG的位点。因此,PCR可以选择性扩增出不同的带型,由此可以判断基因组甲基化程度。MSAP已经在油菜、油棕和苹果等植物中得到应用[28,29,30],但是由于其甲基化位点的局限性,不能完全准确反映DNA甲基化水平。
2.4.2 酶联免疫法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA） 针对DNA甲基化的酶联免疫法是对样品中的5mC进行精确定量,其使用与5mC特异结合的单克隆抗体和带有发光基团的二抗对甲基化的胞嘧啶进行定量。该方法准确快速,虽然不能获取序列信息,但是能够对DNA甲基化水平进行初步的定量分析。骆薇[31]用ELISA测定转基因白桦微繁（脱分化和再分化）过程中的DNA甲基化水平,发现其呈现先降低后升高的趋势。
3 组织培养过程中的DNA甲基化
3.1 变化情况
组织培养过程中DNA甲基化水平持续变化,不同物种、不同时期、基因组不同区域的DNA甲基化水平存在差异。另外,激素和DNA甲基化抑制剂等外源添加物对植物组织培养过程中的DNA甲基化水平也有影响。
愈伤组织形成过程中,DNA甲基化水平变化存在以下4种情况：上升,下降,先降低后升高,先下降后上升再下降。Liu等[35]通过甲基化DNA免疫沉淀测序、表达谱和小RNA测序,发现脱分化的玉米胚比正常胚甲基化程度高,在胚性愈伤组织诱导过程中,DNA甲基化水平上升。Rival等[36]使用HPLC（high performance liquid chromatography）分析油棕体细胞胚胎在悬浮培养长期增殖过程中的基因组甲基化水平和体细胞发生能力的变化,发现体外增殖导致DNA甲基化上升,体细胞胚胎发生能力增加。Orłowska等[37]使用HPLC、SSAP（sequence specific amplified polymorphism,特异序列扩增多态性）和MSTD（methyl-sensitive transposon display,甲基化敏感转座子显示）等方法分析大麦花药和未成熟胚组织培养过程中的DNA甲基化变化,发现不同外植体之间没有差异。单株无性系形成过程中甲基化水平提高,转座子在组织培养过程中被激活。组织培养可能会激活一些转座子,而有一些则始终保持沉默。Temel等[38]用甲基化敏感限制性指纹图谱（methylation-sensitive restriction finger- printing,MSRF）技术研究大麦愈伤组织形成过程中的甲基化水平变化,发现胞嘧啶甲基化水平呈上升趋势。韩柏明等[39]用MSAP技术研究草莓组织培养过程DNA甲基化水平变化,发现DNA甲基化水平下降,甲基化模式变异以去甲基化为主。Matthes等[29]使用AFLP（amplified fragment length polymorphism,扩增片段长度多态性）和MSAP标记分析油棕外植体和无性系之间的多态性,发现MSAP标记在样品之间存在多态性而AFLP没有,且DNA甲基化水平降低。Kubis等[40]分析油棕外植体和无性系转座子,发现序列甲基化水平存在差异。使用限制性酶McrBC分析发现,在组织培养过程中,全基因组的DNA甲基化水平降低,HPLC分析也发现无性系的甲基化水平要低于外植体。Machczyńska等[41]利用HPLC分析小黑麦组织培养过程中的DNA甲基化变化,发现组织培养导致DNA甲基化水平降低。DNA甲基化水平降低加快了随后的体细胞胚胎发生。Stelpflug等[13]使用MeDIP-seq评估玉米愈伤组织、无性系等全基因甲基化水平变化,发现组织培养过程中甲基化水平降低的频率更高,在基因上游区域,甲基化变化和启动子DNA甲基化缺失与随后位点的表达变化有关。分析组织培养过程中和自然发生的差异甲基化区域（differentially methylated regions,DMRs）的重叠区域,发现重叠区域比例高于预期,说明引起体细胞克隆变异的基因组压力与自然变异类似,并且某些位点对表观遗传变化特别敏感。吕晓婷[30]研究发现,低浓度的5-氮胞苷对苹果愈伤组织的形成没有显著影响,100 μmol/L的5-氮胞苷处理可以使愈伤组织形成时间比对照提前3 d,结果发现愈伤组织形成过程中,DNA甲基化水平先降低后升高。DNA甲基化可以通过改变相关基因的甲基化模式来参与愈伤组织形成的调控。孟海军[42]以来源于同一单胚系的愈伤、胚状体、叶片以及长期继代的愈伤为材料建立了山金柑MSAP实验体系。结果表明,DNA甲基化水平在新鲜愈伤组织中最低,继代和再生过程中都会上升。丁明丽[43]利用基因芯片、HPLC法和MSAP标记分析小麦成熟胚脱分化过程中的DNA甲基化变化情况,发现DNA甲基化水平在2,4-D诱导下先下降后上升再下降,并发现了一些差异表达基因。
基因组不同区域的DNA甲基化水平变化不一致。Zakrzewski等[44]分析甜菜叶片和其诱导形成的愈伤组织的全基因组DNA甲基化,发现反转录转座子和基因的CG和CHG位点甲基化水平上升,DNA转座子CHH位点的甲基化水平下降,说明叶片和愈伤组织在基因组不同区域呈现不同的甲基化水平。
植物组织培养过程中,DNA甲基化形式会发生变化。张剑锋等[45]利用RAPD分子标记研究渐渗系的水稻亲本——粳稻品种“松前”在组织培养过程中发生的表观遗传变异。结果表明,松前在组织培养过程中发生的变异主要为DNA甲基化变异：一类变异是将未甲基化的CCGG位点的外侧胞嘧啶半甲基化,此类变异基本上不能传递给再生苗;另一类变异是在CCGG位点内侧胞嘧啶甲基化的基础上,发生了外侧胞嘧啶的甲基化,大多数的外侧胞嘧啶甲基化在再生苗中发生了去甲基化。
组织培养过程中,添加外源物质会导致植物DNA甲基化水平发生变化。Temel等[46]用MSRF分析大麦愈伤组织在0.5 μmol/L油菜素内酯处理下的DNA甲基化水平,发现与对照组相比有少量变化。刘鹏飞等[47]利用MSAP分子标记分析GA（赤霉素）对火龙果DNA甲基化的影响,发现火龙果组培苗DNA甲基化对低浓度GA敏感,对高浓度GA敏感性降低。聂丽娟等[48]使用MSAP分子标记对菊花组织培养继代过程中的DNA甲基化进行分析,发现组培苗和添加材料之间有DNA甲基化差异,继代材料与母体之间也有甲基化差异。Ghosh等[49]使用MSAP标记分析蓝莓叶片外植体和愈伤组织DNA甲基化水平,发现存在较大差异。Bardini等[50]同时采用免疫标记和MSAP标记分析非生物胁迫（卡那霉素处理）对拟南芥叶片愈伤组织形成的DNA甲基化影响,发现全基因组的DNA甲基化水平降低。
3.2 分子机制
植物组织培养过程伴随着DNA甲基化水平的变化,愈伤组织和体细胞胚胎发生等与DNA甲基化密切相关。Ho等[53]使用焦磷酸测序分析甲基化敏感限制性内切酶差异产物,定量PCR分析表明,油棕EgNB3的甲基化状态与叶片体细胞胚胎发生率有关。Xu等[33]以柑橘愈伤组织为材料,设置不添加、添加5-氮胞苷和处理恢复组,通过甲基化组、转录组和代谢物含量分析,发现DNA甲基化抑制剂5-氮胞苷能通过激活CpCCD1促进类胡萝卜素的降解,同时造成全基因组的去甲基化效应。Gao等[54]使用HPLC技术分析甘蓝型油菜组织培养过程中的DNA甲基化水平,发现在含有0.1 mg/L 2,4-D和1.0 mg/L 6-BA的培养基上愈伤组织诱导率最高（91.0%）,甲基化水平最低。外植体在培养后6、21、30 d的甲基化比例分别为4.33%、8.07%和38.7%,表明激素的作用和愈伤组织分化与甲基化水平有关。Santos等[55]利用甲基化敏感酶分析5-氮胞苷对蒺藜苜蓿体细胞胚胎发生和DNA甲基化水平的影响,发现100 μmol/L的5-氮胞苷能抑制体细胞胚胎发生,说明体细胞胚胎发生需要维持一定水平的DNA甲基化,否则会丧失再生能力。Vining等[32]使用MeDIP-seq技术比较节间茎段、脱分化的愈伤组织和再生植株节间的甲基化差异,发现3种组织在56%基因组区域存在甲基化差异。然而,组织之间的基因启动子甲基化差异较小。45%的差异甲基化基因是短暂的甲基化,其在愈伤组织中被甲基化,在再生植株中又发生去甲基化。表达芯片数据显示,启动子和基因区域发生甲基化的基因表达量比未发生甲基化或只有启动子发生甲基化的基因表达量更低。4种转座子丰度显示,再生植株节间组织有最高水平的甲基化。Stroud等[11]研究发现,水稻再生植株的DNA甲基化水平降低。启动子去甲基化与蛋白编码基因的下调表达有关。组织培养阶段发生去甲基化。Wang等[56]使用MSAP分子标记和基因荧光定量分析水稻组织培养形成的愈伤组织和再生苗的DNA甲基化差异,发现了一些差异表达的DNA甲基化基因[如CMT3、DRM2、DDM1（DECREASED DNA METHYLATION 1）、MET1、DME1和DME2等]。Han等[34]使用亚硫酸盐测序法分析玉米组织培养过程中的DNA甲基化变化,发现在多个独立材料中的一些位点同时发生高比例的DNA甲基化变化,说明这些位点是组织培养过程中表观遗传变异的靶位点或者热点。
植物组织培养再生能力受WUS、LEC、BBM和WOX等基因的调控,这些基因又受DNA甲基化调控。WUS的表达是植物体细胞胚胎发生所必需的,其受到DNA甲基化调控,从而进一步调控下游转录因子和功能基因,最终调控体细胞胚胎发生[52]。Su等[57]研究表明,生长素梯度和PIN1介导的生长素极性运输对于WUS诱导体细胞胚胎发生是必要的。拟南芥茎的再生需要生长素介导的WUS基因表达的诱导,WUS基因编码转录因子WUSCHEL,其启动子发生去甲基化。DNA甲基转移酶CMT3或者MET1的功能缺失引起的去甲基化会诱导WUS表达,加快茎的再生。因此,DNA去甲基化可以促进或加快组织培养过程,这对于许多很难进行组织培养和再生的植物来说非常重要[18]。DNA甲基化和组蛋白修饰通过调控WUS的表达和生长素信号来调控拟南芥茎的再生[58]。Mahdavi等[59]认为,WUS和LEC1基因受到DNA甲基化调控,从而调控体细胞胚胎发生。Shemer等[60]研究发现,cmt3突变体表现出CHG甲基化的显著降低,同时在富含细胞分裂素的茎诱导培养基上具有高的再生能力。在野生型中,WUS的启动子高度甲基化,然而在cmt3中WUS被富含细胞分裂素的茎诱导培养基诱导表达,说明WUS基因启动子的去甲基化可能是导致其获得较高再生能力的因素。Liu等[61]分析拟南芥茎再生过程中MET1表达的上游信号,发现在茎再生过程中MET1表达模式和WUS的启动存在动态变化。细胞循环调节因子E2FA是直接促进MET1表达的上游因子。细胞分裂素通过增强CYCD3的表达部分提升了MET1的表达量。结果表明,MET1介导的茎再生受到细胞分裂素诱导的细胞循环调控。DNA甲基化抑制剂5-氮胞苷通过降低DNA甲基化水平,以及LEC1和 BBM1的表达强烈抑制体细胞胚胎发生。DNA甲基化和组蛋白修饰共同调控咖啡体细胞胚胎发生,LEC1和BBM1在体细胞胚胎诱导阶段表达,而WOX4在胚胎成熟时期表达量降低[62]。
Ongabdullah等[10]利用表观基因组关联分析鉴定到油棕MANTLED基因,mantled变异使油棕组培后产生果实畸形,影响产量。结果表明,mantled变异是由于油棕EgDEF1基因内含子中的LINE反转录转座子Karma的DNA甲基化水平降低,导致转录的可变剪接和提前终止,从而造成果实畸形。
4 研究趋势和新思路
近年来,结合DNA甲基化组和转录组等组学研究植物响应外界刺激的DNA甲基化机制成为趋势,为研究植物组织培养过程中的表观遗传机制提供了思路。Zakrzewski等[44]利用亚硫酸氢盐测序法测定甜菜叶片和诱导形成的愈伤组织的DNA甲基化水平,发现在愈伤组织形成过程中,反转录转座子和基因的CG和CHG类甲基化水平降低,而转座子的CHH类甲基化水平上升。Xu等[33]结合转录组和DNA甲基化组测序,分析发现5-氮胞苷处理后柑橘愈伤组织的类胡萝卜素降解、ABA含量上升,是由于某些转录因子被激活,从而促进了CpCCD1基因的表达。Liu等[35]利用MeDIP-seq和表达谱分析玉米未成熟胚和愈伤组织的甲基化和基因表达水平,发现甲基化水平上升,而功能基因表达量下降。Yaish等[63]通过全基因组亚硫酸氢盐测序法分析蒺藜苜蓿根响应盐处理（NaCl）的DNA甲基化变化,对差异甲基化基因筛选后进行表达分析,发现钾离子通道蛋白KAT3基因和ERF类转录因子是潜在的盐响应基因。Feng等[64]结合全基因组DNA甲基化测序和转录组分析研究水稻响应镉的分子机制,发现差异甲基化和表达的基因主要涉及抗逆、金属离子转运和转录因子等基因,并发现5-氮胞苷可以降低DNA甲基化水平,促进水稻幼苗生长和镉的积累。因此,利用DNA甲基化组和转录组（或表达谱）测序技术来研究DNA甲基化机制是可行的。
随着基因编辑技术的发展,目前已经有结合基因编辑技术来开展靶向去甲基化的报道,为研究植物组织培养过程中相关基因的表观遗传修饰提供了有效途径。Gallego等[65]开发了拟南芥基因组中特定位点靶向去除DNA甲基化的2个新工具,这些工具具有高特异性和低脱靶效应等优点。利用人源去甲基化酶TET1和人工锌指蛋白ZF融合蛋白ZF-TET1cd靶向开花基因FWA,可以高效去甲基化,引起FWA基因的上调,并形成可遗传的晚花表型。ZF-TET1cd也可以靶向转座子CACTA1的甲基化区域,引起去甲基化,改变基因表达。同时,该研究也开发了基于CRISPR/ dCas9的去甲基化系统SunTag-TET1cd,和ZF- TET1cd类似,SunTag-TET1cd系统可以靶向FWA或CACTA1,引起去甲基化,促进基因表达。这些工具为开发优良性状的表观等位基因,为重新激活沉默的基因、转基因或转座子提供了新的方法。Ji等[66]开发了“表观突变”（epimutagenesis）技术,可以通过对拟南芥基因组的随机去甲基化快速产生DNA的甲基化变异。该技术通过在拟南芥中表达人类TET酶,产生可遗传给后代的基因组低甲基化,以此来模拟植物中DNA甲基转移酶MET1的突变体,将表观突变技术应用于农业上的重要作物,可导致先前由于DNA甲基化而沉默的等位基因的差异表达,从而揭示隐藏的表型变异。因此,未来可以借鉴靶向去DNA甲基化的思路,对组织培养过程中的重要转录因子或功能基因进行靶向表观修饰,加快组织培养进程,提高组织培养效率。
5 展望
目前,植物组织培养过程中的DNA甲基化研究主要在拟南芥、水稻、玉米和柑橘等模式植物和重要农作物中开展,研究层面主要包括DNA甲基化水平变化规律、愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生过程中的DNA甲基化分子机制。虽然许多植物的组织培养技术已经非常成熟,但组培再生的分子机制特别是受DNA甲基化调控的机制还知之甚少。另外,许多木本植物,特别是油棕和椰子等棕榈科植物组织培养过程长,效率低,组织培养困难。因此未来的研究方向,一是借鉴其他植物中添加DNA甲基化抑制剂来促进组织培养的经验;二是在模式植物中继续开展组织培养过程的DNA甲基化调控机制研究,理解愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生等重要过程中受什么基因控制,这些基因受DNA甲基化调控的机制是什么;三是结合基因编辑技术在模式植物和重要农作物中开展靶向DNA甲基化修饰,定点调控启动组培再生的关键基因表达,加快组织培养进程,提高组织再生效率。