CO是光周期途径中调控植物开花的重要调控因子,属于B-box基因家族[1]。在光周期途径中CO通过整合生物钟末端输出的信号调节开花基因FLOWERING LOCUS T (FT) 的表达,进而调控开花时间[2]。Putterill等[3]首先在拟南芥中分离出CO基因。CONSTANS家族蛋白的特征是在N-末端存在1个或2个锌指B-box结构域和C-末端含有CCT（CO,CONSTANS-LIKE和TOC1）结构域[3]。系统发育分析将植物中的COL蛋白分为4大类[4]。第1组COL包含2个B-box结构域,1个CCT结构域和1个额外的VP基序（参与和COP1相互作用的缬氨酸-脯氨酸基序。第2组COL仅包含1个B-box结构域和1个CCT结构域。第3组COL有1个完整的B-box结构域,1个结构发生变异的B-box结构域和1个CCT域[4,5,6]。第4组COL不含B-box结构域仅有1个CCT结构域[4]。研究表明,单子叶和双子叶植物中的COL基因家族有许多成员。例如在拟南芥中有17个[4],水稻中有16个[4],大麦中有9个[4],陆地棉中有42个[7],梨中有15个[8],竹子中有15个[9],玉米中有19个[10],葡萄中有12个[11],韭菜中有17个[12],香蕉中有25个[13]。最近研究表明,CO家族基因在不同植物中的功能有所差异。
目前,在拟南芥中对CO基因家族有了深入的研究,但在多年生木本植物中的研究较少。芒果是重要的热带水果,具有重要的经济价值,其开花分子机理研究较少。本研究在该课题组前期研究的基础上,以‘四季蜜芒’为实验材料,克隆得到MiCOL6基因,并进行生物信息学分析以期对进一步研究芒果MiCOL6基因的生物学功能提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试芒果材料种植于广西大学农学院果树标本园,克隆样品为‘四季蜜芒’的嫩叶。不同花发育时期表达分析的材料为2016年11月1日、2016年12月1日、2016年12月30日、2017年2月1日、2017年3月11日的‘四季蜜芒’的叶片,2016年11月1日—12月1日为‘四季蜜芒’的营养生长期,2016年12月1—30日为‘四季蜜芒’的成花诱导期,2016年12月30日—2017年2月1日为‘四季蜜芒’的花芽分化期,2017年2月1日—3月11日‘四季蜜芒’的花序伸长及开花期。样品采集后快速冷冻保存于-80 ℃。
DL2000 Marker购自南宁壹颗松;克隆所用超纯水、dNTP、酶、琼脂糖、氨苄青霉素、酵母粉、胰蛋白胨等药品购自广州擎科;多糖多酚植物RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、实时荧光定量试剂盒SYBR Premix Dimer Eraser购自广西天地杨有限公司;引物合成和测序为广州擎科生物有限公司;其他实验耗材购于大连宝生物公司。
1.2 方法
1.2.1 基因克隆 以提取芒果总RNA反转录得到的cDNA为模板。从芒果转录组测序中获取MiCOL6基因序列并了特异性引物MiCOL6u和MiCOLd（表1）进行扩增。25 µL PCR系统。扩增程序为：95 ℃ 5 min;35个循环95 ℃ 40 s,55 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min;最后在72 ℃延长10 min,用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,根据检测结果用胶回收试剂盒,按照说明回收目标片段,然后将回收到的目标基因片段连接到pMD18-T载体上,转化大肠杆菌DH5α。涂板、挑选和培养单菌落。经筛选的阳性克隆被送往上海生工生物技术有限公司进行测序。
表1 引物序列Tab. 1 Primers sequence |
| 引物名称 Primers ID | 引物序列（5°-3°） Primers sequence (5°-3°) |
|---|---|
| MiCOL6u | AAATGGGGTACCATTCATTGT |
| MiCOL6d | CTAAGCTTCTCAGGAAACTCT |
| qCOL6u | CTTATGGTGAAGAGGCCATGA |
| qCOL6d | CCAGTCCATGAAATCCCAAC |
| qActin1u | CCGAGACATGAAGGAGAAGC |
| qActin1d | GTGGTCTCATGGATACGAGCA |
1.2.2 生物信息学分析 利用MEGA6软件,采用NJ方法构建了COL系统发育树;使用DNAMAN6.0 软件将MiCOL6的氨基酸序列其它物种的氨基酸序列进行比对;采用在线分析工具ExPASy-ProtParam（https://web.expasy.org/pro-tparam/）分析芒果MiCOL6氨基酸序列的理化性质;利用Conserved Domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）工具预测MiCOL6蛋白的保守结构域;使用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在线软件对MiCOL6进行信号肽预测;利用TMHMM Severv. 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/）在线软件分析MiCOL6蛋白跨膜结构域;使用NetPhos 3.1 Serve（http://www. cbs. dtu.dk/services/NetPhos/）在线工具对MiCOL6蛋白序列潜在磷酸化位点预测分析;通过ExPASy（http://web.expasy.org/prot-scale/）在线软件对MiCOL6氨基酸亲疏水性进行分析;使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.htmL）在线软件分析MiCOL6蛋白二级结构;利用PSORT II Prediction在线工具（http://psort.hgc.jp/form2.html）对MiCOL6蛋白进行亚细胞定位预测。
1.2.3 MiCOL6不同花发育时期的表达分析 根据基因序列设计荧光定量PCR引物qCOL6u和qCOL6d（表1）,定量内参基因为芒果的Actin1。Actin的上游和下游引物见表1,实时荧光PCR扩增每个样重复3次,同时设空白对照和阴性对照。荧光定量仪器为ABI7500型PCR仪。扩增反应程序参照试剂盒SYBR Premix Dimer Eraser（TaKaRa）说明书进行。以50 µg/L的cDNA为模板,反应体系20 µL：cDNA 2 µl,上下游引物0.4 µL,SYBRⅡ 10 µL,ROXⅡ 0.4 µL,超纯水6.6 µL。PCR程序如下：95 ℃ 30 s,Ⅱ95 ℃ 5 s和60 ℃ 34 s 40个循环,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。qRT-PCR的数据分析采用2-ΔΔCT法。
2 结果与分析
2.1 MiCOL6基因克隆
以逆转录产物cDNA为模板,用基因特异性引物通过RT-PCR法克隆‘四季蜜芒’MiCOL6基因,电泳检测显示成功获得1条长度约为700 bp的条带（图1）。克隆结果送去测序,获得序列长度为678 bp,序列与转录组获得的序列一致。
2.2 MiCOL6基因生物信息学分析
2.2.1 同源性分析及进化树分析 根据CO基因家族的不同类群,从GenBank下载了拟南芥、毛果杨、可可树部分COL蛋白序列,利用MEGA6软件,采用NJ方法构建了COL系统发育树（图2）,系统发育树表明,这些COL基因可分为4组。第1组有2个保守的B-Box 域和一个CCT域,如AtCOL、AtCOL1和AtCOL2。第2组有1个保守的B-Box域和1个CCT域,比如AtCOL6、AtCOL7和AtCOL16。第3组有1个保守的B-Box域、1个结构发生变异的锌指域和1个CCT域,如AtCOL9、AtCOL10、AtCOL11 和AtCOL13。第4组没有B-Box域,只有1个保守的CCT域,如PtCOL16、TaCOL8和MiCOL6。MiCOL6基因与PtCOL16和TaCOL8基因有密切的遗传关系,可聚集到CO基因家族的第4组。
图2 CO蛋白进化树各基因编码氨基酸的GenBank登录号如下：拟南芥AtCOL (NM_121589),AtCOL1 (NM_121589),At COL2 (NM_111105),AtCOL6 (NM_106047),AtCOL7 (NM_103803),AtCOL9 (AB023039),AtCOL10 (NM_117613),AtCOL11 (NM_113084),AtCOL12 (NM_130356),AtCOL16 (NM_102355);毛果杨PtCOL16 (XP_024449388),可可树TaCOL8 (XP_007016977)。 Fig. 2 Phylogenetic tree of CO proteins The GenBank accession numbers of the amino acids encoding each gene are as follows: Arabidopsis thaliana AtCOL (NM_121589), AtCOL1 (NM_ 121589), AtCOL2 (NM_111105), AtCOL6 (NM_ 106047), AtCOL7 (NM_103803), AtCOL9 (AB023039), AtCOL10 (NM_117613), AtCOL11 (NM_ 113084), AtCOL12 (NM_130356), AtCOL16 (NM_ 102355); Populus trichocarpa PtCOL16 (XP_024449388), Theobroma cacao TaCOL8 (XP_007016977). |
2.2.2 氨基酸的序列比对分析 将芒果中MiCOL6的氨基酸序列在NCBI上进行Blast分析,结果表明MiCOL6蛋白序列与其他植物的COL蛋白序列具有较高的同源性,MiCOL6蛋白与其他COL蛋白的序列相似性如下：与亚洲棉（XP_017641001）,西班牙栓皮栎（XP_023874898）,毛果杨（XP_024449388）的同源性分别为60.34%、59.91%、58.77%。
使用DNAMAN 6.0软件分别将MiCOL6的氨基酸序列与上述物种的氨基酸序列进行对比,结果表明,MiCOL6氨基酸序列与其他植物的COL蛋白序列都具有保守的CCT结构域（图3）。
图3 MiCOL6与其他植物同源蛋白的保守序列比对分析各基因编码氨基酸的GenBank登录号如下：毛果杨PtCOL16（XP_ 024449388）,栓皮槠QsCOL7（XP_023874898）,树棉GaCOL16（XP_017641001）。 Fig. 3 Multiple alignments of MiCOL6 with other species The GenBank accession numbers of the amino acids encoding each gene are as follows: Populus trichocarpa PtCOL16 (XP_024449388), Quercus suber QsCOL7 (XP_023874898), Gossypium arboretum GaCOL16 (XP_017641001). |
2.2.3 一级结构及理化性质分析 通过在线ProtParam程序（https://web.expasy.org/protparam/）对MiCOL6基因进行一级结构分析。结果显示该基因编码的蛋白由226个氨基酸组成（不含色氨酸和半光氨酸残基）。谷氨酰胺含量最高,共计35个,占氨基酸总数的15.5%。负电荷残基（Asp+ Glu）50个,占22.1%,正电荷残基（Arg+Lys）36个,占15.9%,分子量为26.89 kDa,等电点（pI）为4.85,分子式为 C1184H1835N323O377S8,总原子量为3727,不稳定指数为 63.279（不稳定系数<40 时稳定）,被归类为不稳定蛋白,GRAVY系数为-1.077,为亲水性蛋白,脂肪族氨基酸指数为61.68。
2.2.4 氨基酸保守结构域分析 利用Conserved Domai（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具预测MiCOL6蛋白的保守结构域（图4）,结果显示MiCOL6基因含有CC保守结构域,利用ScanProsit（http://prosite.expasy.org/）工具对MiCOL6蛋白进行分析,结果显示,MiCOL6氨基酸的第182~224位区域为CCT保守结构域。
2.2.6 磷酸化位点及疏水性分析 使用在线工具NetPhos 3.1 Serve (http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos/)对MiCOL6基因的蛋白序列潜在磷酸化位点预测分析（图7）。分析结果显示,此蛋白含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3种氨基酸的磷酸化位点,共18个,其中丝氨酸（Serine）的磷酸化位点11个,苏氨酸（Threonine）的磷酸化位点4个,酪氨酸（P-hydroxyphenylalanine）的磷酸化位点3个,其中最有可能是潜在磷酸化位点的是第60位丝氨酸,其值已经达到0.992,远远超过标准值0.5。
通过在线氨基酸疏水性分析工具（http://web. expasy.org/protscale/）对芒果MiCOL6蛋白氨基酸序列进行分析（图8）。预测结果显示,该蛋白为亲水性蛋白,大部分氨基酸表现为亲水性,其中第43个氨基酸表现出最大疏水性,为0.667,第93个氨基酸表现出最大亲水性,为-3.611。
2.2.7 MiCOL6蛋白的二级结构及亚细胞定位预测 使用SOPMA在线软件预测MiCOL6蛋白二级结构。预测结果显示,该蛋白无规卷曲占43%,α-螺旋占52%,TM螺旋占14%。
利用PSORT II Prediction在线工具对MiCOL6蛋白进行亚细胞定位预测。结果表明,该蛋白在质膜上的概率为69.6%,在细胞核上的概率为26.1%,在细胞骨架上的概率为4.3%。
2.3 MiCOL6不同花发育时期的表达分析
3 讨论
近10年来,CO基因得到了广泛的研究。据报道,其参与了许多分子和遗传过程,包括控制光周期反应、开花时间和调节昼夜节律[14]、光转导[15]等。一些COL家族成员的功能在拟南芥中得到了验证。对现有拟南芥数据库的检查显示,AtCOL在调节开花时间,光形态发生,生物钟、根发育、生长素信号传导和花青素积累方面发挥作用[6, 16-19]。在其他植物中,COL家族成员具有不同的特征功能。CO或COL基因在土豆中也可以参与块茎的形成[20],梨中PbCOL8通过抑制开花信号因子FT和SOC1的表达进而达到延迟开花[8],竹子中的PvCO1是其开花的负调控因子[9],水稻中CONSTANS-Like 9（OsCOL9）与活化C-激酶1（OsRACK1）的受体相互作用,通过水杨酸和乙烯信号通路调节抗稻瘟病性[21]。但关于芒果中CO家族基因的研究,鲜有报道。
本研究首次克隆得到了芒果的MiCOL6基因,通过生物信息学方法预测分析,MiCOL6基因含有有CO家族成员的CCT保守结构域（图3）,系统进化树分析表明,MiCOL6与PtCOL16和TaCOL8聚到一类,仅含有CCT保守结构域,这与Robson等[22]报道的CO家族结构特点不同,与徐趁等[23]报道的芒果MiCO基因的结构也不相同,但与Liu等[12]报道的韭菜的部分CO家族基因相同,与小麦中CO-like基因TaCO9[24]基因结构相同,说明芒果中CO家族基因在进化的过程中发生了进化,属于CO家族的第4类;氨基酸信号肽和跨膜结构域结果表明,MiCOL6蛋白没有信号肽和跨膜域,说明其不属于分泌蛋白;磷酸化位点分析结果显示,该蛋白共存在18个潜在的磷酸化位点,鉴于磷酸化是调控蛋白质活力与功能的重要途径[25],说明MiCOL6蛋白可能通过相应氨基酸位点的磷酸化来实现其功能的调控;亚细胞定位预测结果显示,该蛋白定位在质膜上的概率最大,与Wang等[8]报道梨的PbCOL8蛋白定位于细胞核的结果有所差异。不同花发育时期表达模式结果表明,MiCOL6基因在芒果的花芽分化期表达量最高,说明该基因可能在芒果花芽分化过程中发挥着重要作用。本研究有助于后续开展研究MiCOL6基因在芒果中的功能。