Effects of Two Polyamines on in Vitro Flowering of Dendrobium officinale Kimura et Migo

LI Ru; LI Zhilin; BAI Jiankun; SHANG Zhengrui; ZHAO Liying; WANG Yuying

doi:10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.011

Chinese Journal of Tropical Crops >

2020 , Vol. 41 >Issue 4: 709 - 714

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.011

Phytophysiology and Biochemistry

Effects of Two Polyamines on in Vitro Flowering of Dendrobium officinale Kimura et Migo

LI Ru ,
LI Zhilin ,
BAI Jiankun ,
SHANG Zhengrui ,
ZHAO Liying ,
WANG Yuying ^,^*

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College of Horticulture and Landscape, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201, China

* WANG Yuying,E-mail： wyysxp@126.com。

Received date: 2019-07-19

Request revised date: 2019-08-30

Online published: 2020-05-09

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Abstract

The effects of different concentrations of exogenous putrescine (Put) and spermine (Spm) on the flowering of Dendrobium officinale Kimura et Migo were studied using the rootless plantlets in vitro. The flowering rate of D. officinale could be increased by adding appropriate amount of Put and Spm in the medium. The flowering rate of D. officinale was the highest (30.47%) when the concentration of Put was 0.4 mg/L, and the flowering rate of D. officinale was 22.26% when the concentration of Spm was 0.2 mg/L. The time to have the first flower bud appeared of D. officinale was the shortest (83.33 d) when the concentration of Put was 0.2 mg/L, and the viewing period of D. officinale could be prolonged by 43.33 days. When the concentration of Put was 0.4 mg/L, the content of soluble sugar and soluble protein was the highest. The content of total N was the highest in CK. When the concentration of Spm was 0.6 mg/L, the C/N ratio of the plant was the highest. The concentration of Put 0.4 mg/L would be beneficial to the accumulation of carbon and nitrogen compounds, which could promote the flowering rate of D. officinale.

Key words： Dendrobium officinale Kimura et Migo; polyamines; in vitro flowering; rate of flowering

Cite this article

LI Ru , LI Zhilin , BAI Jiankun , SHANG Zhengrui , ZHAO Liying , WANG Yuying . Effects of Two Polyamines on in Vitro Flowering of Dendrobium officinale Kimura et Migo[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2020 , 41(4) : 709 -714 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.011

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）又名黑节草,是重要的兰科（Orchidaceae Juss.）植物。因其花姿优雅,且有降血糖抗肿瘤等功效,而具有独特的观赏价值和药用价值^[1]。铁皮石斛花期3—6月,花淡黄色,是石斛属（Dendrobium Sw.）药用植物中最为珍稀名贵的种类,但石斛属植物营养生长期较长,需2~3 a^[2]。石斛属快速繁殖技术现已突破,缩短营养生长期是如今需要解决的关键问题。黄浅等^[3]研究认为,可利用物理和化学方法使具有观赏价值的花卉在组培瓶内提前开花,缩短营养生长期,并将这一技术直接应用于花卉生产和育种。

多胺是普遍存在于植物体内的一类含2个或多个氨基的低分子脂肪族含氮碱,其中的腐胺（Put）、亚精胺（Spd）和精胺（Spm）在促进植物组织生长、花芽分化及性别分化、开花坐果等方面具有重要的生理功能^[4]。因此多胺在植物施设栽培中应用广泛。由于多胺对不同植物生长发育的不同阶段影响各异,外源多胺的运用需要对不同物种进行分析和研究,才能确定有效的多胺配方运用于生产实践^[5]。

Julien Costantin最早进行兰科植物试管开花的研究,其研究发现兰科植物在缺少菌根的条件下可以促进开花^[6]。叶秀仙^[7]对铁皮石斛瓶内开花的研究发现,在培养基中加入合适浓度的PP₃₃₃预培养,能显著提高开花率。王爱华等^[8]对铁皮石斛的离体开花实验结果表明：TDZ显著提高铁皮石斛开花率。王世平等^[9]研究发现,3种外源多胺对苹果的花芽分化有影响。目前,关于PP₃₃₃、TDZ等植物激素对植物离体开花的研究较多,而多胺对植物离体开花的研究较少,利用多胺促进铁皮石斛瓶内开花的研究未见报道。对于营养生长期较长的石斛属植物来说,瓶内开花能够缩短育种年限,便于育种工作者对新种质的筛选。此外,瓶内开花也具有一定的经济价值,可开发出具有观赏价值的试管花卉,应用于微型花卉生产。植物的瓶内开花受许多因素控制,如温度、光照强度及培养基的pH、植物生物调节剂含量、蔗糖含量和外植体大小等^[10,11]。因此,在前人的研究基础上,本研究通过控制铁皮石斛组培苗的大小、环境温度和光照及培养基的成分,添加不同浓度多胺对铁皮石斛进行瓶内开花的研究,探究多胺对铁皮石斛瓶内开花的影响,为兰科花卉及其他花卉的试管开花提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究于2018年6月至2019年2月在云南农业大学花卉研究所组培室内进行。铁皮石斛无菌原球茎均由云南农业大学园林园艺学院花卉研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 铁皮石斛原球茎分化培养铁皮石斛原球茎接种于分化培养基上：1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+ NAA 1.0 mg/L+土豆60 /L+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L+碳0.5 g/L,pH 5.8,获得大量无菌苗。

1.2.2 外源Put和Spm对瓶内开花的影响选择生长健壮、株高约1.5~2.0 cm的幼苗,将根部切除,接种于1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+香蕉150 g/L+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L+活性碳0.5 g/L+不同浓度的Spm或Put培养基上,每瓶接种6棵,两两一丛。每个处理接种10瓶,重复3次。培养150 d时,测定形态和生理指标。培养条件：pH 5.8,RH(75 ± 5)%,温度(22 ± 2) ℃,光照强度1800~2500 Lx,光照周期14 h/d。不同多胺浓度配比组合如表1所示。其中,对照组采用空白对照（CK）。

表1 培养基中采用的多胺种类和浓度

Tab. 1 Types and concentrations of polyamines used in medium

处理编号 Treatment number	多胺种类 Polyamine type	多胺浓度 Polyamine concentration/(mg·L^-1)
P1	Put	0.2
P2	Put	0.4
P3	Put	0.6
S1	Spm	0.2
S2	Spm	0.4
S3	Spm	0.6
CK	-	-

1.2.3 测定指标及方法开花指标主要测定花朵大小、花梗长、开花株数、始花天数、花期、每棵植株的花朵数;生长指标主要测定叶数、叶长、叶宽、根数、根粗、根长、株高、和植株鲜重。可溶性糖采用蒽酮法测定^[12];可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定^[10];植株全N采用硫酸-高氯酸消煮法^[13]。

花朵大小测量花的直径。

开花率=开花株数(株)/接种有效株数(株)× 100%

C/N=可溶性糖含量/植株全N

1.3 数据处理

采用WPS 2016软件进行数据整理,SPSS 23.0软件进行方差分析,采用Duncan’s进行多重比较,P<0.05,n=5,单因素方差分析（one-way ANOVA）和Pearson相关分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度多胺对铁皮石斛瓶内开花的影响

由表2可知,P2处理下铁皮石斛组培苗开花率最高,开花率达到30.47%,显著高于P1、P3、S1、S2、S3和CK处理（P<0.05）,分别高出18.95%、14.00%、8.21%、12.90%、16.24%和30.47%,CK处理下未见开花现象。铁皮石斛瓶内开花的先后顺序为P1、S3、S2、P2、P3、S1;P1和S3处理下始花期均显著提前,与平均始花期（93.46 d）相比,分别提前了10.13、9.13 d。P1处理下的花期与其他处理相比,差异显著,花期最长,达到43.33 d;其次是P3和S3,分别为30.05、28.67 d。如图1所示,P3处理下花朵最大,达到2.43 cm;其他处理差异不显著。5个处理下花朵大小的变化规律为：P3>S1>S2>P1=P2>S3>CK;花梗长短的变化规律为：P1>S1>P2=P3=S2>S3>CK。说明Put处理中浓度为P2和Spm处理中浓度为S1时有利于铁皮石斛瓶内开花,其中P2处理下更有利于铁皮石斛瓶内开花;P1处理下的花朵品质好且观赏期最长。

表2 多胺不同浓度对铁皮石斛瓶内开花的影响

Tab. 2 Effect of different concentrations of polyamines on in vitro flowering of D. officinale

处理编号 Treatment number	开花率 Flowering percentage/%	始花期 Day to first flower bud/d	花期 Blooming period/d	花朵大小 Flower size/cm	花梗长 Peduncle length/cm
P1	11.52±0.11^e	83.33±3.06^b	43.33±2.52^a	1.33±0.06^b	1.07±0.06^a
P2	30.47±1.66^a	95.67±13.05^a	24.33±9.29^b	1.33±0.81^b	0.64±0.36^b
P3	16.47±0.21^c	98.33±3.06^a	30.05±2.16^b	2.43±0.06^a	0.62±0.07^b
S1	22.26±0.61^b	105.67±1.53^a	27.67±1.53^b	1.47±0.06^b	0.80±0.15^ab
S2	17.54±0.54^d	93.42±1.35^a	24.13±1.17^b	1.34±0.51^b	0.61±0.14^b
S3	14.23±0.45^d	84.33±1.53^b	28.67±1.53^b	1.15±0.82^b	0.53±0.15^b
CK	0±0^f	0±0^c	0±0^c	0±0^c	0±0^c

	Note: Different lowercase letters in the same column represented significant difference (P<0.05).
	注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

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图1 不同浓度多胺下铁皮石斛瓶内开花图片

Fig. 1 Picture of in vitro flowering of D. officinale on media with different concentrations of polyamine

2.2 不同浓度多胺对铁皮石斛组培苗形态指标的影响

由表3可知,S1和S2处理下铁皮石斛组培苗叶片数、叶长、叶宽、根粗和株高与CK差异显著。S2处理下的铁皮石斛组培苗的叶片数、叶长、叶宽、根数、根长、株高和鲜重达到最大值,分别为7.33片、2.17 cm、9.64 mm、18.67条、9.62 mm、6.77 cm和1.45 g;其他处理与CK差异不显著。说明S2处理能促进铁皮石斛组培苗的营养生长、有利于铁皮石斛组培苗株高增长和生根。

表3 不同浓度的多胺处理对铁皮石斛组培苗形态指标的影响

Tab. 3 Effect of different concentrations of polyamines on the morphological indexes of D.officinale

处理 Treatment	叶片数 Number of leaves plant	叶长 Leaf length/ cm	叶宽 Leaf width/ mm	根数（条/株） Number of roots /(root·plant^-1)	根粗 Root diameter/ mm	根长 Root length/mm	株高 Plant height/cm	鲜质重 Fresh weights/g
P1	4.33±0.58^b	1.12±0.28^b	6.24±0.85^c	8.00±1.00^bc	1.37±0.21^ab	6.37±0.91^bc	2.40±0.23^c	0.40±0.01^c
P2	5.00±1.00b	1.57±0.14^ab	6.53±1.57^bc	5.00±1.73^c	1.21±0.07^b	4.21±0.99^de	2.31±0.25^c	0.33±0.13^c
P3	4.33±1.15b	1.46±0.43^ab	6.54±1.26^bc	7.67±2.31^bc	1.31±0.08^ab	4.64±1.56^cd	2.80±0.66^c	0.39±0.11^c
S1	6.33±0.58^a	2.72±0.56^a	9.33±1.17^ab	13.00±7.81^ab	1.65±0.33^a	2.71±0.61^e	4.90±0.51^b	1.06±0.31^b
S2	7.33±0.58^a	2.17±0.29^a	9.64±2.56^a	18.67±4.93^a	1.56±0.16^ab	9.62±0.81^a	6.67±1.15^a	1.45±0.34^a
S3	4.33±0.58^b	1.57±0.52^ab	7.37±2.31^abc	8.00±2.00^bc	1.42±0.22^ab	6.59±0.78^b	2.83±0.57^c	0.63±0.05^c
CK	4.00±0^b	0.93±0.16^b	4.97±0.32^c	4.67±0.58^c	1.41±0.26^ab	4.57±0.99^cd	2.27±0.29^c	0.37±0.12^c

	Note: Different lowercase letters in the same column represented significant difference (P<0.05).
	注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

2.3 不同浓度多胺对铁皮石斛碳氮化合物含量的影响

由图2可知,P2 处理下铁皮石斛组培苗的可溶性糖含量显著高于其他处理;可溶性糖含量的变化规律为：P2>P1>P3>S1>CK>S2>S3。P3、S1、S2和S3处理下的铁皮石斛组培苗的可溶性蛋白含量显著低于CK,但P1和P2与CK差异不显著,变化规律为：CK>P1= P2>S3>P3> S1>S2。植株全氮含量变化规律为：P2>P1>P3> S1>S2>S3。S3处理下的C/N比达到最大,P1、P2、P3和S3处理下的C/N比与CK差异不显著,S2处理下的C/N比最小。与Spm相比,Put更有利于铁皮石斛组培苗碳氮化合物的积累,其中P2处理下含量最高。

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图2 不同浓度的多胺对铁皮石斛生理生化指标的影响

不同小写字母表示不同处理之间差异显著（P<0.05）。

Fig. 2 Effects of different concentrations of polyamines on physiological and biochemical indexes of D. officinale

Different lowercase letters in difference treatments indicate significant difference (P<0.05).

2.4 铁皮石斛碳氮化合物与开花的相关性分析

由表4可知,铁皮石斛植株全N含量与花朵大小、始花期呈负相关,与始花期、花梗长和开花率呈正相关,但未达显著水平;蛋白质含量与花朵大小、开花率、始花期和花期均呈正相关,但未达显著水平;可溶性糖含量与始花期、花期、花梗长和开花率均呈正相关,并达显著水平,与花朵大小呈正相关,但未达显著水平;铁皮石斛的C/N与花朵大小、始花期、花期和开花率呈正相关,但均未达显著水平。

表4 铁皮石斛碳氮化合物与试管内开花的相关性

Tab. 4 Correlation between carbon and nitrogen compounds and in vitro flowering of D. officinale

碳氮化合物 Carbon and nitrogen compounds	花朵大小 Flower size	始花期 Days to first flower bud	花梗长 Peduncle length	花期 Blooming period	开花率 Flowering percentage
C/N	0.245	0.281	0.279	0.429	0.110
全N含量	-0.014	-0.057	0.099	0.058	0.011
蛋白质含量	0.140	0.138	0.220	0.300	0.062
可溶性糖含量	0.250	0.506^*	0.512^*	0.457^*	0.541^*

	Note: ^* indicates a significant correlation at the 0.05 level.
	注：^*表示0.05水平显著相关。

3 讨论

植物进行花芽分化时,花器官是一个争夺养分的代谢库,需要消耗叶片、根和茎中积累的有机和无机营养物质,为花芽生长发育提高碳骨架和能源^[14]。可溶性糖作为植物体内碳源存在的主要形式。糖类是植物呼吸作用的底物,为作物的各种合成过程和生命活动提供了所需的能量^[15]。可溶性蛋白是植物体内氮素存在的主要形式,是花器官形态建成的物质基础,影响花芽分化的多少,是花芽分化过程中重要的生理指标^[16]。多胺影响植物的生长发育,外源Spm可引起铁皮石斛内源游离多胺代谢及比值的变化,促进花芽分化^[17,18]。有研究也表明,多胺能与某些酚类物质结合,这种结合物在植物花发育过程中具有重要的调节作用^[19]。本研究结果表明,在培养基成分相同的前提下,经过不同浓度的多胺处理,铁皮石斛试管苗的开花率、始花期和花期出现明显差异,说明外源多胺对铁皮石斛的成花诱导具有很大的影响作用。

多胺生物合成途径的中心产物是Put,Put在亚精胺合成酶（spermidine synthases, SPDS）的催化下生成Spd,Spd又在精胺合成酶（spermine synthases, SPMS）的作用下生成Spm^[20]。多胺是一类脂肪族含氮物质,成花诱导和花的发育过程中鸟氨酸脱羧酶（ornithime decarboxylase, ODC）调节Put的合成,进而影响Spm的生成^[21,22]。因此,Put含有更多的碳氮元素,对花芽分化的影响效果更大。段辉国等^[5]研究表明：单独或混合外施Spm、Spd与Put能够促进苹果花芽形成,增加花芽的数目。桂仁意等^[23]研究结果表明：Put对石竹试管苗成花影响不大,Spm显著提高成花率。王秀红^[24]研究发现,添加外源Spm可促进水培黄瓜幼苗的株高和叶面积的增加,促进幼苗生长。本研究结果表明,Put处理与CK间的生理指标差异不显著,对铁皮石斛的生长影响不大;Spm浓度在0.4 mg/L时,促进铁皮石斛组培苗生长,与王秀红^[24]的研究结果一致。本研究结果表明：Put和Spm处理都能显著提高铁皮石斛组培苗的开花率,其中Put处理下开花率最高、始花期最早和维持花期的时间最长。推测Put和Spm对铁皮石斛花芽分化的影响效果不同,可能与2种多胺的合成代谢途径不同有关,具体原因还有待进一步探讨。

魏明^[25]对霍山石斛原球茎的研究发现,添加Put和Spm能促进多糖的合成。本研究结果表明,Put处理有利于铁皮石斛可溶性糖和蛋白含量的合成,与魏明^[25]的研究结果一致。王双燕^[26]研究表明,可溶性糖含量升高有利于3月竹开花。本研究中,Put浓度为0.2、0.4 mg/L时,可溶性糖和蛋白含量最高;Put浓度为0.4 mg/L时开花率最高,Put浓度为0.2 mg/L时维持的花期最长。相关性分析也表明,可溶性糖含量与开花率和花期的相关性达显著正相关,这说明可溶性糖的积累有利于铁皮石斛瓶内开花和维持花期。因此,碳水化合物的积累与植物的花芽分化密切相关。吴佳^[27]研究结果表明,植株全N含量高有利于春石斛的花芽分化。本研究结果表明,开花率高的全氮含量比CK低,但CK处理下未见开花,全氮含量最高。根据相关性分析可看出,全N含量几乎不影响铁皮石斛的开花率,与吴佳^[27]的研究结果不一致。庞钰洁等^[28]研究结果表明,相对较高的C/N能提早桃树的花芽分化时间。本研究结果表明,C/N与始花期和开花率的相关性较小,均未达显著水平。其结果与庞钰洁等^[28]的结果不一致,可能由于不同植物开花机理不同有关,具体原因还有待探究。

References

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[1]	汪维双 . 铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)对铅、镉胁迫的响应研究[D]. 雅安: 四川农业大学, 2013.

[2]	张新平, 朱根发, 王飞 . 不同日本春石斛兰品种组培繁殖系数的差异[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2008,36(9):118-122, 127.

[3]	黄浅, 赖钟雄, 栾爱业 , 等. 试管花卉的生产与应用[J]. 亚热带农业研究, 2007,3(4):300-304.

[4]	李六林, 张绍铃 . 多胺在植物花发育中的作用[J]. 西北植物学报, 2006,26(6):1282-1289.

[5]	段辉国, 黄作喜, 林宏辉 , 等. 多胺在高等植物个体发育中的作用[J]. 西北农业学报, 2006,15(2):190-194.

[6]	Teixeira da Silva J A, Kerbauy G B, Zeng S J , et al. In vitro flowering of orchids[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2014,34(1):56-76. DOI

[7]	叶秀仙, 黄敏玲, 罗远华 , 等. 铁皮石斛试管开花研究[C]//中国园艺学会观赏园艺专业委员会、国家花卉工程技术研究中心.中国观赏园艺研究进展(2013). 郑州: 中国林业出版社, 2013: 369-373.

[8]	王爱华, 黎静, 曾宋君 , 等. 铁皮石斛离体开花结实研究初报[J]. 贵州农业科学, 2014,42(3):34-37.

[9]	王世平, 宋长冰, 李连朝 , 等. 三种多胺在苹果开花及坐果初期的生理作用[J]. 园艺学报, 1996(4):319-325.

[10]	Lin C S, Liang C J, Hsaio H W . In vitro flowering of green and albino Dendrocalamus latiflorus[J]. New Forests, 2007,34(2):177-186. DOI

[11]	Taylor N J, Light M E, Staden J V . In vitro flowering of Kniphofia leucocephala: influence of cytokinins[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2005,83(3):327-333. DOI

[12]	李合生 . 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京: 高等教育出版社, 2000.

[13]	南京农学院. 土壤农化分析[M]. 北京: 农业出版社, 1980

[14]	刘桂茹 . 国槐开花过程中的营养生理研究[J]. 天津农业科学, 2016,22(2):140-143.

[15]	董章慧, 张立军, 崔震海 , 等. 糖对植物成花的调节[J]. 安徽农业科学, 2009,37(25):11965-11966, 11969.

[16]	张荻 . 百子莲花芽分化及开花机理研究[D]. 哈尔滨: 东北林业大学, 2011.

[17]	李婷婷, 唐旭, 曾桢迦 , 等. 外源精胺对离体铁皮石斛花芽分化过程中游离多胺含量的影响[J]. 内江师范学院学报, 2013,28(2):36-38.

[18]	蔡秋华, 张积森, 郭春芳 , 等. 高等植物体内多胺的生理功能及其分子生物学研究进展[J]. 福建教育学院学报, 2006(10):118-124.

[19]	陈学好 . 黄瓜花性别分化的生理学研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2001.

[20]	沈永娟, 张辉, 王倩 , 等. 植物中多胺的合成代谢及其分子生物学水平研究进展[J]. 保鲜与加工, 2018,18(6):157-161.

[21]	马瑛, 刘静 . 植物体中多胺代谢及其功能研究进展[J]. 陕西理工学院学报(自然科学版), 2010,26(2):47-54.

[22]	陈咨余, 马容, 康波 , 等. 鸟氨酸脱羧酶结构、功能及表达调控研究进展[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2014,42(8):40-44.

[23]	桂仁意, 曹福亮, 沈惠娟 , 等. 多胺代谢对石竹试管苗成花中内源激素含量的影响[J]. 南京林业大学学报(自然科学版), 2003,27(4):27-30.

[24]	王秀红 . 外源多胺对NO₃-胁迫下黄瓜幼苗生长及生理生化特性的影响[D]. 泰安: 山东农业大学, 2011.

[25]	魏明 . 霍山石斛类原球茎悬浮培养细胞生长和多糖合成的动力学研究[D]. 合肥: 合肥工业大学, 2007.

[26]	王双燕 . 开花与未开花三月竹几种重要代谢物差异研究[D]. 雅安: 四川农业大学, 2015.

[27]	吴佳 . 石斛属花卉引种评价及亚精胺对春石斛花期调控的效果[D]. 武汉: 华中农业大学, 2013.

[28]	庞钰洁, 陶宁颖, 竺啸恒 , 等. 根域限制栽培对桃花芽分化进程中碳氮比及ABA含量的影响[J]. 果树学报, 2018,35(11):1363-1373.

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