Assessment of Fungicides for in vitro and in vivo Activity Against Xanthomanas campestris pv. mangiferaeindicae

ZHAN Ligang; YE Huochun; ZHANG Jing; YAN Chao; LI Xiaoyu; FENG Gang

doi:10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.016

Chinese Journal of Tropical Crops >

2020 , Vol. 41 >Issue 3: 538 - 543

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.016

Crop Pests, Diseases and Their Control, Environmental Protection

Assessment of Fungicides for in vitro and in vivo Activity Against Xanthomanas campestris pv. mangiferaeindicae

ZHAN Ligang ¹ ,
YE Huochun ² ,
ZHANG Jing ²^,³ ,
YAN Chao ² ,
LI Xiaoyu ¹ ,
FENG Gang ^,²^,³^,^*

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1. School of Life and Pharmaceutical Science, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China
2. Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China
3. Key Laboratory of Pests Comprehensive Governance for Tropical Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Haikou, Hainan 570100, China.

FENG Gang, E-mail： feng8513@sina.com.

Received date: 2019-04-24

Request revised date: 2019-07-03

Online published: 2020-04-16

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Copyright reserved © 2020. Office of CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS All articles published represent the opinions of the authors, and do not reflect the official policy of the Chinese Medical Association or the Editorial Board, unless this is clearly specified.

Fold

Abstract

Mango bacterial black spot (MBBS) caused by Xanthomonas campestris pv. manganiferaeindicae (Xcm) is a risk plant disease in mango orchards. In order to screen an effective fungicide for controlling MBBS, the bacteriostatic activity of 22 fungicides against MBBS were assessed by th turbidimeter test in the laboratory, and the toxicity of the fungicides with good antibacterial activity was tested by the method of plate culture count and the control efficacy were carried out in the field. Laboratory bioassay results showed that the inhibitory effect of tetramycin, octylamine acetate, bromothalonil and benziothiazolinone was strong, with an inhibitory rate 90% treated with 2 mg/L, followed by pothioconazole and zhongsengmycin with an inhibitory rates up to 75% at 10 mg/L. Except for oxine-copper, the bacteriostatic activity of copper fungicides was relatively low. The toxicity of bromothalonil, benziothiazolinone, pothioconazole, kasugamycin and saisentong to Xcm was calculated, with EC₅₀ of 0.048, 0.103, 0.900, 21.970 and 189.347 mg/L, respectively. At 30 days after treatment, the result of the field trial indicated that 20% zinc-thiazole SC 750 times solution (TS) had the highest control efficacy on the disease and its control effect reached 75%, followed by 3% benziothiazolinone ME, 20% pothioconazole SC and 25% bromothalonil EC reached above 70% control efficacy at 1000 TS. Beyond that, 46% copper hydroxide WG showed a better protective effect than other fungicides with lowest diseased leaf rate after treatment. Accordingly, copper hydroxide, zinc-thiazole, benziothiazolinone, pothioconazole and bromothalonil could be used as the chemicals for controlling mango bacterial black spot.

Key words： mango bacterial black spot; fungicides; antibacterial activity; control effect in vitro

Cite this article

ZHAN Ligang , YE Huochun , ZHANG Jing , YAN Chao , LI Xiaoyu , FENG Gang . Assessment of Fungicides for in vitro and in vivo Activity Against Xanthomanas campestris pv. mangiferaeindicae[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2020 , 41(3) : 538 -543 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.016

芒果细菌性角斑病（mango bacterial black spot, MBBS）又称芒果细菌性黑斑病、细菌性溃疡病等,是芒果生产上重要病害之一,可引起芒果叶斑、枝条坏死、落果和果实采后腐烂,严重时造成的损失达50%以上^[1,2]。芒果细菌性角斑病具有潜伏性和爆发性^[3]。一般台风雨过后是该病高发期,严重威胁我国海南、广西、广东、福建等地区芒果产业健康发展^[4,5]。使用化学药剂是防治芒果细菌性角斑病主要方法之一。铜制剂和农用抗生素类杀菌剂常用于细菌性病害防治。杨叶等^[6]对芒果细菌性角斑病菌进行室内药剂筛选,获得农用链霉素、代森锰锌、福美锌等抑菌活性好。蒲金基等^[7]室内筛选农用链霉素和其他抗生素复配药剂,对芒果细菌角斑病菌抑菌活性进行研究。然而,为降低医用抗生素在农业使使用中可能引起的安全风险,农用链霉素现已停止登记使用^[8]。另一方面,铜制剂过多使用,尤其是无机铜杀菌剂,易凸显环境污染、植物药害、金属资源消耗等问题^[9,10]。因此,生产上防治芒果细菌性角斑病亟需高效、低风险药剂。目前生产上出现不少替代农用链霉素防治细菌病害药剂。这些药剂对芒果细菌性角斑病防治效果如何鲜有报道。为此,本研究收集当前防治细菌性病害22种杀菌剂,在室内和田间对芒果细菌性角斑病进行药剂筛选,研究结果将为该病的有效防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株芒果细菌性角斑病病原菌（Xanthomanas campestris pv. mangiferaeindicae,Xcm）由中国热带农业科学院南亚热带作物研究所热带园艺产品采后保鲜研究室馈赠,于20%甘油中,-80 ℃保存;28 ℃条件下,在NA培养基复活供试。

1.1.2 培养基 NB培养基：牛肉浸膏3 g、酵母浸膏1 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、去离子水1 L、pH 6.8~7.0。NB培养基加入1.5%琼脂粉即为固体培养基NA,分装后于121 ℃灭菌20 min备用。

1.1.3 供试药剂供试杀菌剂的名称及生产厂家如表1所示。

表1 供试杀菌剂

Tab. 1 Trial fungicides

序号 Number	杀菌剂名称 Name of fungicides	剂型简称 Abbreviation	生产厂家 Manufacturer
1	20%噻菌铜悬浮液	SC	浙江龙湾化工有限公司
2	30%壬菌铜微乳液	ME	西安近代科技实业有限公司
3	33.5%喹啉铜悬浮液	SC	浙江海正化工股份有限公司
4	20%松脂酸铜水乳剂	EW	青岛中达农业科技有限公司
5	15%咯氨铜水剂	AS	东莞市瑞德丰生物科技有限公司
6	30%琥胶肥酸铜悬浮液	SC	中国农科院植保所廊坊农药中试厂
7	46%氢氧化铜水分散粒剂	WG	美国杜邦公司
8	86.2%氧化亚铜水分散粒剂	WG	挪威-劳道克斯公司
9	70%氧氯化铜可湿性粉剂	WP	陕西上格之路生物科学有限公司
10	90%三乙膦酸铝可溶性粉剂	SP	利民化工股份有限公司
11	20%丙硫唑悬浮剂	SC	贵州道元生物技术有限公司
12	8%宁南霉素水剂	AS	德强生物股份有限公司
13	80%乙蒜素大蒜乳油	EC	开封大地农化生物科技有限公司
14	3%中生菌素可湿性粉剂	WP	福建凯立生物制品有限公司
15	0.3%四霉素水剂	AS	辽宁微科生物工程股份有限公司
16	85%三氯异氰尿酸可溶粉剂	SP	天津博克百胜科技有限公司
17	20%辛菌胺醋酸盐水剂	AS	潍坊万胜生物农药有限公司
18	25%溴菌腈乳油	EC	江苏托球农化股份有限公司
19	3%噻霉酮微乳剂	ME	江苏辉丰农化股份有限公司
20	20%噻森铜悬浮剂	SC	浙江东风化工有限公司
21	4%春雷霉素水剂	AS	陕西麦克罗生物科技有限公司
22	20%噻唑锌悬浮剂	SC	浙江新农化工股份有限公司

1.2 方法

1.2.1 室内抑菌初筛采用浑浊度法参考NY/T 1156.16-2008试验准则^[11],对各供试药剂进行快速筛选。将各供试药剂用NB培养基配制成100、10、2 mg/L的含药培养基,吸取195 μL含药培养基至96孔板微孔中,加入5 μL的Xcm菌悬液,以未加药剂的NB培养基为对照,各处理设置未接菌液的微孔为背景对照,每个处理重复3次,于28 ℃震荡条件下培养24 h,采用酶标仪检测处理培养液光吸光值OD₆₃₀,根据各处理光吸收增加值计算抑菌率。

光吸收增加值ΔOD=处理OD_630-背景对照OD₆₃₀

_{$P=\frac{A_{0}-A_{1}}{A_{0}}\times 100\%$}

式中,P为抑菌率,A₀为对照OD值增加值,A₁为OD值增加值。

1.2.2 室内毒力试验采用平板菌落计数法^[12],在预试验的基础上,将室内抑菌活性较高的3%噻霉酮ME、25%溴菌腈EC、20%丙硫唑SC、4%春雷霉素AS和20%噻森铜SC用灭菌水稀释成系列浓度,与融化后冷却至50 ℃的NA培养基混合,制成含系列浓度药剂的NA平板,以灭菌水为对照。待平板凝固后,取40 μL的1×10⁴CFU/mL菌悬液涂布于含药平板上,每个处理重复3次。于28 ℃培养72 h,观察统计平板的菌落数计算抑制率。

$抑制率=\frac{对照组菌落数-处理组菌落数}{对照组菌落数}\times 100\%$

1.2.3 田间试验田间药效试验在海南省乐东县黄流镇三曲沟村台农芒果种植园进行,细菌性角斑病初始发生为害。方法参照GB/T 17980.98- 2004试验准则进行^[13],使用背负式电动喷雾器施药。供试药剂选用5种抑菌活性较好药剂和1种保护性无机铜杀菌剂,按药剂推荐浓度设计为46%氢氧化铜WG 1000倍、3%噻霉酮ME 1000倍、20%丙硫唑SC1000倍、4%春雷霉素AS 500倍、20%噻唑锌SC 750倍和25%溴菌腈EC 1000倍,以清水为对照。每个处理小区5株,重复3次,于2018年10月中旬开始施药,间隔7 d施药1次,共施药3次。在末次施药后15和30 d,每小区定点调查3株,每株按照芒果树冠层不同方向选取5条树梢,记录总叶片数及各级病叶数,统计病情指数,计算药剂防治效果。

病情分级如下,0级：无病斑;1级：病斑面积占整个叶片面积的5%以下;3级：病斑面积占整个叶片面积的6%~15%;5级：病斑面积占整个叶片面积的16%~25%;7级：病斑面积占整个叶片面积的26%~50%;9级：病斑面积占整个叶片面积的50%以上。药效计算公式：

（1） $病情指数=\frac{\sum(各级病叶片数\times 相对级数值)}{调查叶片总数\times 9}\times 100$

（2） $防治效果=(1-\frac{药剂处理区施药后病情指数-药剂处理区试验前病情指数}{空白对照区施药后病情指数-空白对照区施药前病情指数})\times 100$

1.3 数据处理

实验相关数据采用Excel 2007软件处理,使用SPSS 22统计软件进行分析。室内毒力数据,以杀菌剂有效成分剂量浓度对数和抑菌率机率值之间进行线性回归关系分析,计算EC₅₀及95%置信限。田间药效数据采用Duncan氏新复极差法进行差异性显著分析,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 药剂室内离体活性初筛

室内抑菌活性结果表明,22种杀菌剂对Xcm均有不同程度抑制作用。其中,辛菌胺醋酸盐、噻霉酮、四霉素、溴菌腈和乙蒜素抑菌活性最强,在2 mg/L浓度作用下,抑菌率均在80%以上,丙硫唑、中生菌素、春雷霉素和三氯异氰尿酸抑菌活性次之;在离体条件下,铜制剂除喹啉铜之外,抑菌活性相对较低（表2）。

表2 杀菌剂对芒果细菌性角斑病菌的室内抑菌活性

Tab. 2 Fungicides for in vivo activity against mango bacterial spot pathogen

供试药剂 Trial fungicides	浓度 Concentration/(mg·L^-1)	抑制率 Inhibition rate/%	供试药剂 Trial fungicides	浓度 Concentration/(mg·L^-1)	抑制率 Inhibition rate/%
20%噻菌铜SC	2	0.44	8%宁南霉素AS	2	5.51
	10	5.19		10	10.34
	100	40.63		100	11.19
30%壬菌铜ME	2	5.53	80%乙蒜素EC	2	97.64
	10	39.43		10	98.37
	100	51.69		100	100.00
33.5%喹啉铜SC	2	3.43	3%中生菌素WP	2	38.48
	10	29.48		10	78.34
	100	87.54		100	97.46
20%松脂酸铜EW	2	2.44	0.3%四霉素AS	2	100.00
	10	6.27		10	100.00
	100	17.13		100	100.00
15%咯氨铜AS	2	9.05	85%三氯异氰尿酸SP	2	10.82
	10	12.07		10	32.75
	100	29.05		100	100.00
30%琥胶肥酸铜SC	2	1.41	20%辛菌胺醋酸盐AS	2	90.93
	10	51.17		10	99.54
	100	53.09		100	100.00
46%氢氧化铜WP	2	6.18	25%溴菌腈EC	2	98.76
	10	15.94		10	99.59
	100	17.50		100	100.00
86.2%氧化亚铜WP	2	14.05	3%噻霉酮ME	2	82.22
	10	18.27		10	98.55
	100	23.16		100	99.04
70%氧氯化铜WP	2	1.99	20%噻森铜SC	2	3.20
	10	7.77		10	9.01
	100	10.05		100	15.46
90%三乙膦酸铝SP	2	3.51	4%春雷霉素AS	2	21.01
	10	5.97		10	35.53
	100	12.09		100	100.00
20%丙硫唑SC	2	64.31	20%噻唑锌SC	2	4.15
	10	83.36		10	11.22
	100	96.88		100	38.56

2.2 室内毒力测定

室内毒力结果显示,5种杀菌剂对芒果细菌性角斑病菌的毒力具有明显差异。溴菌腈和噻霉酮的毒力最高,EC₅₀分别为0.048、0.103 mg/L;丙硫唑次之,EC₅₀为0.900 mg/L,20%而噻森铜的活性最差,其EC₅₀高于180 mg/L（表3）

表3 5种杀菌剂对芒果细菌性角斑病菌的室内毒力

Tab. 3 In vivo virulence of five fungicides for mango bacterial spot pathogen

药剂 Fungicides	毒力方程 Virulence equation	r	EC₅₀/(mg·L^-1)	95%置信限 95% confidence interval/(mg·L^-1)
20%丙硫唑SC	y=0.097+2.124x	0.9935	0.900	(0.777~1.032)
20%噻森铜SC	y=-3.681+1.616x	0.9793	189.347	(157.836~235.008)
25%溴菌腈EC	y=3.026+2.568x	0.9869	0.048	(0.042~0.055)
3%噻霉酮ME	y=1.712+1.737x	0.9492	0.103	(0.065~0.177)
4%春雷霉素AS	y=2.210x-2.965	0.9843	21.970	(18.872~25.241)

2.3 对芒果细菌性角斑病的田间防效

结果显示,6种药剂在施药后30 d对芒果细菌性角斑病均有一定的防治效果。其中,20%噻唑锌SC在750倍相对防效最好,防效为77.13%;其次为3%噻霉酮ME 1000倍、20%丙硫唑SC1000倍和25%溴菌腈EC 1000倍,防效分别为72.83%、73.54%和70.70%。4%春雷霉素AS 500倍防效最低,仅为41.88%。46%氢氧化铜WG处理的病叶率显著低于其他药剂处理,施药前后病叶率只提高了5.33%,而4%春雷霉素AS处理后病叶率最高,提高了13.3%（表4）。

表4 6种杀菌剂对芒果细菌性角斑病田间防治效果

Tab. 4 In vitro assessmentof six fungicides for mango bacterial spot pathogen

药剂 Fungicides	稀释倍数 Dilution factor	药前基数Pre-medicine base		施药后30 d 30 d after application
药剂 Fungicides	稀释倍数 Dilution factor	病叶率 Diseased leaf rate/%	病情指数 Conditin index/%	病叶率 Diseased leaf rate/%	病情指数 Condition index/%	防效 Control effect/%
清水对照	—	6.86±0.79^ab	1.57±0.11	24.22±1.04^a	9.15±0.39	—
46%氢氧化铜WG	1000	7.52±0.33^a	1.43±0.05	12.85±0.44^e	5.06±0.17	52.34±1.87^c
3%噻霉酮ME	1000	7.63±0.24^a	1.41±0.05	17.78±0.71^c	3.49±0.14	72.83±1.48^b
20%丙硫唑SC	1000	6.22±0.39^c	1.48±0.15	16.52±1.21^c	3.51±0.17	73.54±1.45^b
4%春雷霉素AS	500	7.26±0.05^b	1.62±0.01	20.56±1.09^b	6.05±0.10	41.88±1.43^d
20%噻唑锌SC	750	6.62±1.11^abc	1.64±0.16	14.80±0.33^d	3.39±0.17	77.13±2.34^a
25%溴菌腈EC	1000	5.68±0.60^c	1.58±0.17	17.36±3.62^c	4.02±0.20	70.70±2.64^b

	Note: Different lowercase letters in the same column represent significant difference (P<0.05).
	注：同列数据不同小写字母代表差异显著（P<0.05）。

3 讨论

随着我国芒果种植规模扩大,芒果细菌性角斑病的危害越发频繁和严重,尤其是遭受台风威胁的沿海种植区。除无毒苗培育和农艺措施之外,使用化学药剂防治是预防和阻止病害为害和蔓延的重要手段之一。防治芒果细菌性角斑病侧重于预防病害发生,在暴风雨或者台风雨过后,及时多次用药,能够在一定程度上控制病害爆发流行。铜制剂这类多作用位点杀菌剂,病原菌不易产生抗药性,保护作用效果好,在防控芒果细菌性角斑病常用于预防病害的流行蔓延。在研究中发现,铜制剂氢氧化铜离体活性低,而田间试验则表现出明显的防效,其原因可能是铜制剂杀菌剂为了减少高浓度游离铜离子对植物毒性,一般加工成难溶性的铜盐,喷施到植物表面后,在植物体和环境作用下,缓慢释放铜离子从而发挥杀菌作用^[14]。噻唑锌田间防效高,与陈金雄等报道一致,但离体抑菌活性低,原因亦可能是如此,需进一步研究验证。本研究中,噻霉酮、溴菌腈、丙硫唑和春雷霉素等药剂对芒果细菌性角斑病菌的离体和田间活体均具有良好防治作用,可考虑在作物发病初期将铜制剂、噻唑锌、噻霉酮、丙硫唑、溴菌腈和作为供选药剂,轮换使用,以减少铜制剂的频繁使用和抗药性的产生。

有效成分、使用浓度和次数,是影响杀菌剂达到防控病害为目标的重要因子^[15]。在田间试验中,各药剂在推荐一个浓度下,施药3次,获得了噻唑锌等5种杀菌剂较好防治效果。在室内活性测定中,辛菌胺醋酸盐、乙蒜素、四霉素和中生菌素抑菌活性较高,但未开展田间药效。因此,在后续研究中,在农药残留不超标和作物未出现药害的前提下,探索噻唑锌等5种药剂防治芒果细菌性角斑病的最佳使用浓度和次数,并继续开展辛菌胺醋酸盐等其他药剂田间药效试验,进一步探讨各药剂间复配增效作用,以期获得高效、安全防治药剂。

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