西番莲（Passiflora caerulea L.）是西番莲科西番莲属的多年生常绿藤本植物,原产于巴西,目前在东南亚、澳洲、南美洲及非洲南部等热带、亚热带地区广泛种植,其中巴西是世界上西番莲鲜果和加工品最大的生产国和消费国,主要种植品种为黄果西番莲[1]。西番莲为一年多次成熟植物,果实采收期长,有9个多月,随熟随采随时供应[2]。西番莲果除食用以外,同时具有保健功能,如活血强身、滋阴补肾、生津止渴等[3]。因西番莲果汁的香味中含有165种芳香化合物而被誉为世界上最芳香的水果,是饮料加工的优质原料[4]。所以,研究西番莲果汁香气成分,建立检测方法,对进一步研究选择西番莲的品种、产品加工、香气合成都有极其重要的意义。
固相微萃取（SPME）技术可以灵活应用于富集气体、液体、固体等多种样品中的各类挥发性或半挥发性物质分析[5],具有样品制备方便、快捷,不使用有机溶剂,且样品用量少,能较为真实地反映样品本身的挥发性成分等优点[6],所以固相微萃取在近几年应用研究颇多,但建立的多数是手动进样的方法[7,8,9]。手动进样易导致人为误差,需要的样品量远大于自动进样,自动进样可尽量避人为误差。目前,西番莲果汁中少量成分未见标准品,依靠质谱检索存在不确定性,因不同的GC-MS性能和分离柱柱效有差异,分离效果有所不同[10]。故采用保留指数（retention index,RI）法[11]结合质谱检索可增加定性的可信度,解决定性不够准确的问题。国内研究大多通过挥发性成分总峰面积建立相关检测方法,整体挥发性成分不全代表整体香气成分,忽略其挥发性成分的香气阈值。利用GC-O-MS通过人嗅觉感知选取与西番莲果汁特征香味有关成分,体现香气变化趋势从而建立检测方法,解决以往研究不能覆盖使用以及不够全面的问题。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料 鲜紫果西番莲（广西南宁,2016年9月产）,手工过滤,经4层纱布过滤去籽取汁,于-80 ℃冰箱冷冻待测。
1.1.2 仪器设备 QP2010-Plus气相色谱-质谱联用仪（配有AOC-5000顶空,固相微萃取及液体注射器三合一自动进样器）,日本岛津公司;GC7890A-MS5925C气相色谱-质谱联用仪,美国Aglient公司;嗅闻装置（ODP2）,德国Gerstel公司;SPME萃取头（Divinylbenzene/Carboxen/ Polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS,50/30 μm;Divinylbenzene/Polydimethylsiloxane,DVB/PDMS,65 μm;Carboxen/Polydimethylsiloxane,CAR/PDMS 85 μm;Polydimethylsiloxane,PDMS,100 μm;Pilyacrylate,PA,85 μm）,美国Supelco公司。
1.2 方法
1.2.1 气相色谱-质谱联用条件 色谱柱：VF-wax毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;升温程序：45 ℃保持2 min,以5 ℃/min升至180 ℃,再以20 ℃/min升至240 ℃,保持5 min;载气（He）流速1 mL/min;压力100.0 kPa;不分流;进样口温度250 ℃。电子轰击离子源（EI）：电子能量70 eV;接口温度250 ℃;离子源温度230 ℃;检测器增益电压1.25 kV;质量扫描范围m/z 30~ 350。萃取头萃取条件：取已过滤的西番莲果汁少量,分别移取0.5 mL于20 mL顶空进样瓶中。将进样瓶放置在50 ℃温度控制搅拌器中以250 r/min转速动态平衡15 min;再在上述条件下将萃取头插入进样瓶动态萃取15 min;然后GC-MS进样,解吸温度250 ℃,解吸时间5 min。
1.2.2 气相色谱-嗅闻-质谱联用测定条件 用与1.2.1节相同的分析条件进行分离,流出物在毛细管末端以1∶1的分流比分别流入质谱检测器和ODP嗅闻装置。挑选出经闻香训练的实验人员3名,用时间强度法进行GC-O-MS分析,并记录保留时间和化合物的香气强度和特征,香气强度按1~5共5个等级记录[12]。“1”表示能感受到香气,“2”表示可以闻到强于“1”的香气但气味不明显,“3”表示该气味成分强度适中且气味明显,“4”表示味道强度略大,较强烈,“5”表示气味明显且强烈。每人做3次检测,同1人记录1个成分2次以上且3人共有同1个记录才认作有效记录,香气强度为3人记录的平均值。
1.2.3 保留指数（RI）值的测定 以C7~C30正构烷烃混合标准品配制浓度为0.1%的溶液,采取与1.2.1节相同的分析条件进行分离,通过测定各正烷烃的保留时间来计算各成分的RI。各成分的RI值根据Kovats公式[11]进行计算：
\[RI =100n+ \frac {100{(t_{x}-t_{n})}}{t_{n+1}-t_{n}} \]
式中,RI为被测成分的保留指数;tx为被测成分流出峰的保留时间（min）;tn为碳原子数为n的正构烷烃流出峰的保留时间（min）,tn+1为碳原子数为n+1的正烷烃流出峰的保留时间（min）,且tn<tx<tn+1[12]。
1.2.4 SPME方法建立 （1）萃取头选择。选取5种不同的萃取头,分别为50/30 μm DVB/CAR/ PDMS（DCP）,65 μm的DVB/ PDMS（DP）,85 μm的CAR/PDMS（CP）,100 μm的PDMS,85 μm的PA。新萃取头在使用前预老化1 h。取少量已过滤的西番莲果汁,与1.2.1节相同的分析条件进行分离。
（2）果汁量的选择。取少量已过滤的西番莲果汁,分别移取0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于20 mL顶空进样瓶中。使用DVB/ PDMS萃取头,其他条件同1.2.1节。
（3）氯化钠添加量的选择。取少量已过滤的西番莲果汁,移取0.5 mL于20 mL顶空进样瓶中,分别添加氯化钠0、0.05、0.10、0.15、0.20 g。使用DVB/ PDMS萃取头,其他条件同1.2.1节。
（4）萃取温度的选择。移取0.5 mL西番莲果汁于20 mL顶空进样瓶中,不加入氯化钠,将进样瓶分别放置在40、50、60、70、80 ℃温度控制搅拌器中以250 r/min转速动态平衡15 min;使用DVB/ PDMS萃取头,其他条件同1.2.1节。
（5）萃取时间的选择。取0.5 mL西番莲果汁于20 mL顶空进样瓶中,不加入氯化钠,将进样瓶分别放置在40 ℃温度控制搅拌器中以250 r/min转速动态平衡时间15 min;再在上述条件下将萃取头DVB/PDMS插入进样瓶分别动态萃取5、10、15、20、25 min;GC-MS进样,其他条件同1.2.1节。
2 结果与分析
2.1 GC-O-MS技术结合保留指数为西番莲主要挥发性成分定性
表1 气相色谱-嗅闻-质谱联用结合保留指数测定西番莲果汁主要香气成分Tab. 1 Determination of main aroma components in passion fruit juice by GC-O-MS combined with retention index |
| 序号 No. | 保留时间 Retention time/min | 峰面积百分比Peak area percentage/% | 成分 Constituent | 鉴定方法 Identified methods | CAS | 保留指数 Retention Index | 气味强度Odour intensity | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验值Lab | 参考值Ref | |||||||
| 1 | 3.88 | 5.54 | 丁酸乙酯 Ethyl butyrate | ①、②、③ | 105-54-4 | 1039 | 1044[13] | 4 |
| 2 | 7.75 | 0.69 | β-月桂烯 β-Myrcene | ①、② | 123-35-3 | 1149 | 1150[13] | 1 |
| 3 | 9.56 | 6.85 | 己酸乙酯 Ethyl hexanoate | ①、②、③ | 123-66-0 | 1230 | 1232[14] | 4 |
| 4 | 9.85 | 0.89 | 罗勒烯 Ocimene | ①、② | 13877-91-3 | 1243 | 1249[14] | 1 |
| 5 | 10.49 | 2.79 | 乙酸己酯 Hexyl acetate | ①、②、③ | 142-92-7 | 1270 | 1275[14] | 4 |
| 6 | 11.53 | 2.570 | 乙酸叶醇酯Cis-3-hexenyl acetate | ①、② | 928-96-1 | 1315 | 1313[13] | 3 |
| 7 | 13.17 | 2.27 | 1-甲基丁酸己酯 1-Methyl butanoic acid hexyl ester | ① | 10632-13-0 | 1394 | — | 3 |
| 8 | 13.55 | 5.38 | 丁酸己酯 Hexyl butyrate | ①、② | 2639-63-6 | 1413 | 1410[14] | 4 |
| 9 | 14.55 | 2.29 | 丁酸叶醇酯Cis-3-Hexenyl butyrate | ①、② | 16491-36-4 | 1460 | 1459[14] | 4 |
| 10 | 16.27 | 2.83 | 芳樟醇 Linalool | ①、②、③ | 78-70-6 | 1547 | 1546[14] | 4 |
| 11 | 16.96 | 7.62 | 己酸异丁酯Isobutyl Hexanoate | ① | 105-79-3 | 1586 | — | 4 |
| 12 | 17.47 | 15.84 | 己酸己酯 Hexyl hexanoate | ①、③ | 6378-65-0 | 1610 | — | 4 |
| 13 | 18.29 | 2.50 | 己酸叶醇酯Cis-3-Hexenyl caproate | ①、② | 31501-11-8 | 1657 | 1665[14] | 3 |
| 14 | 23.11 | 1.71 | β-紫罗兰酮 β-ionone | ①、② | 79-77-6 | 1944 | 1942[14] | 5 |
Note: ① indicates the MS library; ② indicates RI; ③ indicates standard (STD). — indicates that the reference value of the RI was not found. | |
注：①表示MS谱库,②表示RI,③表示standard（STD）。—表示未找到RI的参考值。 |
2.2 萃取头的选择
据报道,β-紫罗兰酮的含量对西番莲果汁的香气有很大影响[15],两者呈正相关;芳樟醇香味较为明显,是一味持久清新的香气[16];罗勒烯有清新花香,易高温分解,需关注其变化。由图1可知,在罗勒烯、芳樟醇、β-紫罗兰酮这几种成分富集上DP较高于其他萃取头。而DP好于DCP的原因可能有2个,其一是DP萃取头为双极性偏非极性,而本研究选取的这14种主要挥发性成分中非极性的成分稍多,所以萃取头DP较优;其二可能是由于萃取头DCP比DP增加1种涂层,虽然可以吸附更多成分,但同时也使得目标主要挥发性成分的峰面积总百分比降低。综上所述,在西番莲果汁的萃取头选取实验中萃取头DVB/ PDMS（DP）较优于其他萃取头。
图1 不同萃取头富集西番莲果汁主要挥发性成分的对比Fig. 1 Comparison of main volatile components of passion fruit juice enriched with different extraction heads |
表2 不同萃取头富集西番莲果汁主要挥发性成分的总峰面积百分比Tab. 2 Percentage of total peak area of main volatile components of passion fruit juice enriched by different extraction heads |
| 萃取头 | DCP | DP | PDMS | CP | PA |
|---|---|---|---|---|---|
| 主要挥发性成分总峰面积百分比/% | 67.15 | 68.54 | 63.30 | 63.24 | 35.38 |
2.3 果汁量的选择
由于固相微萃取需要较长时间才可达到真正意义上的分配平衡,所以确定果汁量可以无须达到分配平衡,只需保证其他萃取条件相同,萃取成分与原始成分呈正比即可[17]。随着果汁量增加,使得分子量小的成分峰面积出现上升后下降的趋势（图2）,分子量大的成分峰面积呈上升趋势,对月桂烯、乙酸己酯、乙酸叶醇酯、丁酸叶醇酯、β-紫罗兰酮等成分影响较小,主要挥发性成分峰面积百分比差异不大（表3）,0.5 mL果汁量的主要挥发性成分峰面积百分比相对于其他果汁量要高,不同果汁量下的峰面积无显著差异,证明自动进样对果汁量的影响没有手动萃取因顶空气体空间限制而导致样品体积与顶空体积存在的显著相互关系,但样品量过大容易造成质谱检测器饱和,引起定性错误,综合以上考虑,确立自动进样条件下采用0.5 mL的果汁量。
图2 不同西番莲果汁量的主要挥发性成分对比Fig. 2 Comparison of main volatile components in different amount of passion fruit juice |
表3 不同西番莲果汁量的主要挥发性成分的总峰面积百分比Tab. 3 Percentage of total peak area of main volatile components of different passion fruit juice contents |
| 果汁量/mL | 0.4 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 |
|---|---|---|---|---|---|
| 主要挥发性成分总 峰面积百分比/% | 65.18 | 69.21 | 67.32 | 67.68 | 65.53 |
2.4 氯化钠的选择
氯化钠的加入可产生盐析效应,降低挥发物在水中的溶解性,使得挥发物更易挥发,进入顶空空间,被萃取头吸附[18,19,20]。综合图3和表4可知,增加氯化钠添加量使得分子量小的成分先上升后下降,而相对而言,则呈明显递减的趋势,己酸己酯尤为明显;罗勒烯呈递减趋势,而芳樟醇在添加0.1 g时增加明显,这可能是因为氯化钠增大了溶液的离子强度,使得基质降低了对挥发性成分的束缚[21],使得芳樟醇从西番莲中大量挥发出来,增强了萃取的效果。虽然,增加氯化钠使得西番莲果汁香气整体种类和总峰面积有所增加,但是主要挥发性成分总峰面积减少,总峰面积百分比减少,这可能是由于萃取头可吸附的挥发性成分是有限的,萃取成分增加会导致原有主要挥发性成分比例相应减弱。挥发性成分种类增加的同时也造成了主要挥发性成分物质的峰面积百分比下降,综合考虑,选择不添加氯化钠的原汁作为测试样品。
图3 不同氯化钠添加量的西番莲果汁的主要挥发性成分对比Fig. 3 Comparison of main volatile components of passion fruit juice juice with different sodium chloride contents |
表4 不同氯化钠添加量的西番莲果汁的主要挥发性成分的总峰面积百分比Tab. 4 Percentage of total peak area of main volatile components of passion fruit juice with different sodium chloride contents |
| 氯化钠添加量/g | 0 | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 |
|---|---|---|---|---|---|
| 主要挥发性成分总峰面积百分比/% | 70.21 | 63.81 | 58.08 | 46.41 | 44.21 |
2.5 萃取温度的选择
温度对西番莲果汁的主要挥发性成分有较大影响（图4）。随着温度的增加,分子量较小的酯类随着萃取温度的升高逐渐减少,在60 ℃以上,其他成分也有相同的趋势。从组成成分来看,40 ℃对分子量较小的成分有较好的吸附效果,60 ℃对分子量较大的成分有较好的吸附效果,这可能是因为香气物质与萃取头之间存在着吸附与解吸的动态平衡,升高温度加速分子运动,加快香气物质的传质速率,使香气物质易于挥发到顶空气体中被萃取头吸附[21,22]。低温使得分子量较小的成分先挥发到顶空被萃取头吸附,分子量较大的成分挥发较少,适当的高温使得分子量大的成分开始大量挥发至顶空,顶空气体成分比例发生改变,分子量小的成分萃取头吸附随之减少,吸附分子量大的成分则增加,但温度继续升高导致主要挥发性成分在顶空气体所占比例下降,在萃取头涂层和顶空气体中的分配系数下降,使得吸附能力下降,这印证了表5中主要挥发性成分总峰面积百分比减少的趋势。考虑到温度过高可能使挥发性成分发生一系列的化学变化,不能较好地反映样品真实的香气特征,且部分主要挥发性成分在60 ℃时萃取到的含量过小,不利于分析,所以选取40 ℃作为萃取温度。若只对其中几种含量较高的成分进行分析萃取,则温度为60 ℃更佳。
图4 不同萃取温度的西番莲果汁主要挥发性成分对比A：分子量较小的酯类成分峰面积;B：分子量较大的酯类成分峰面积;C：其他成分峰面积。 Fig. 4 Comparison of main volatile components of passion fruit juice at different extraction temperatures A: Peak area of low molecular weight esters; B: Peak area of high molecular weight esters; C: Peak area of other components. |
表5 不同温度下西番莲果汁的主要挥发性成分的总峰面积百分比Tab. 5 Total peak area percentage of the main components of passion fruit juice at different temperatures |
| 温度/℃ | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 |
|---|---|---|---|---|---|
| 主要挥发性成分总峰面积百分比/% | 72.43 | 69.57 | 69.74 | 58.08 | 54.47 |
2.6 萃取时间的选择
固相微萃取的萃取时间与主要挥发性成分在萃取头涂层分配平衡吸附的时间有关,萃取头在接近平衡时延长时间无意义,需找寻合适的萃取时间,使得各主要挥发性成分在萃取头涂层的分配最合适。从图5可知,随着萃取时间增长,各主要挥发性成分大致都是增长的趋势。由于萃取时间短,分子量较大的挥发性成分未大量进入顶空气体,则分子量较小的物质被萃取头大量吸附,随时间延长,分子量较大的物质进入顶空层,主要挥发性成分的总峰面积也随之增长,再延长时间,导致其他挥发性成分增多,使得主要挥发性成分的总峰面积百分比开始递减。在20 min后主要挥发性成分的总峰面积开始有所下降（表6）。本着节约时间和能源的原则考虑,20 min的总峰面积较高,且各主要挥发性成分分布均匀较适于其他萃取时间,以20 min作为萃取时间。
图5 不同萃取时间的西番莲果汁主要挥发性成分对比Fig. 5 Comparison of main volatile components of passion fruit juice with different extraction times |
表6 不同萃取时间下西番莲果汁的主要挥发性成分的峰面积百分比Tab. 6 Peak area percentage of the main volatile components of passion fruit juice under different extraction times |
| 萃取时间/min | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 |
|---|---|---|---|---|---|
| 主要挥发性成分峰面积百分比% | 65.38 | 67.81 | 70.85 | 72.69 | 71.50 |
2.7 HS-SMPE-GC-MS分析西番莲的风味成分
采用固相微萃取法,取0.5 mL西番莲果汁,不加入氯化钠,使用65 μm的DVB/PDMS萃取头,在40 ℃下萃取20 min的条件下结合GC-MS,得到总离子流图（图6）。
通过HS-SPME-GC-MS分析得到西番莲的挥发性成分62种,种类由多到少分别为酯类29种（71.58%）、醇类11种（12.51%）、醛类8种（3.13%）、酮类6种（5.34%）、烯烃类5种（5.37%）、酸类2种（0.47%）。其中西番莲挥发成分中酯类物质为主要成分,其次是醇类,酮类、烯烃类虽种类偏少但是也有一定的贡献。西番莲中检测可鉴定的挥发性成分总峰面积为98.40%,质谱成分中14种主要挥发性成分占总峰面积的72.69%。表明此分析方法可以较为全面地表示出西番莲挥发性成分。
3 讨论
使用自动进样,可以在减少样品使用量的同时避免人为误差,获得较稳定的实验数据,可能是由于有效的搅拌可加速分析物的扩散速度降低静态水膜的干扰[26],所以样品少量的挥发成分量便足够被吸附检测。
本研究发现在不同温度某些主要挥发性成分有不同的萃取效果,在今后的研究中可针对不同的挥发性成分的最适挥发温度,采用不同温度测定。随着科技的发展有望出现固相微萃取温度可分段式处理,根据所需对萃取温度进行分段增加温度的方法,使得不同的挥发性成分能较好地被吸附到萃取头上,从而实现固相微萃取的更优结果。
此检测方法能快速、有效地反映西番莲的真实挥发性成分,优于对主要挥发性成分进行检测研究,有利于探究不同品种/产地西番莲之间的香气区别、其香气成分在加工中的变化及西番莲果汁香气保持的方法等,也可进一步深入研究其香气与其他化合物之间的联系。