甘薯[Ipomoea batatas (L.) Lam]又名红薯、番薯、地瓜等,为旋花科甘薯属多年生草本植物,原产美洲热带地区,广泛种植于100多个国家,是我国重要的粮食、经济和能源作物。我国约有2000份甘薯种质资源[1],适应于中国不同的地区。海南地区气候独特,甘薯可作为蔬菜或粮食全年种植,尤其以秋冬种植面积最大[2]。
甘薯各品种主要依靠无性繁殖,在长期的栽培过程中常因病毒的感染而退化,导致产量和品质严重受损[3]。甘薯的主要病毒,如羽状斑驳病毒、潜隐病毒、黄矮病毒、明脉病毒和丛枝病毒病,已经成为制约甘薯产业发展的重要因素。利用组织培养技术,快速地生产优质无病毒的种苗是甘薯产业健康可持续发展的重要保障。目前,组培技术已经成熟运用于优质甘薯种苗培育中,但是不同品种的甘薯培养条件、成苗时间、成苗率差异极大,如Dessai等[4]对27种不同基因型甘薯组培,发现部分基因型甘薯组培苗生根时间不超过27 d,其他则需要28~40 d。董芳等[5]提出湘薯系列的最优植物激素添加方案为MS培养基中加入0.67~1.00 mg/L NAA和2.0~3.0 mg/L 6-BA。秦梅等[6]则认为,‘徐薯22薯’适宜的茎尖分化培养基配方中应加入0.2 mg/L NAA和0.5 mg/L 6-BA。张宝红[7]研究发现,不同基因型的甘薯组培时愈伤组织出根率和芽分化率差异极大。
此外,大量研究表明,由于次生代谢产物氧化而引起的褐变,以及微生物造成的污染是甘薯组织培养的2大难题[8,9]。甘薯组培苗生产过程中,轻度褐变会影响甘薯初接种外植体生根发芽效率,严重褐变会直接导致外植体死亡[10]。因此,针对特定地区的环境条件和品种,以及组织培养过程中的外植体褐化及微生物污染等关键问题,建立一套相对完善的甘薯再生体系是生产脱毒苗的重要环节。
本研究以海南甘薯主栽品种‘心香’、‘广薯87薯’、‘川山紫’、‘宁紫薯1号’、‘薯绿一号’、‘高系14系’和‘三角宁’为原材料,从外植体的选择、不同消毒方案、培养基配方和防褐化剂筛选等方面进行研究,建立一套适合热带地区甘薯主栽品种的脱毒快繁优化再生体系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试甘薯品种 ‘心香’、‘广薯87薯’、‘川山紫’、‘宁紫薯1号’、‘薯绿一号’、‘高系14系’和‘三角宁’均为南方地区普遍栽培品种,由海南大学园艺学院甘薯种质资源圃种植保存。
1.1.2 主要仪器 超净台,苏州苏洁净化设备有限公司SW-CJ-2D;接种器械灭菌器,上海农卉生物科技有限公司NH-JZ-330;高压灭菌锅,美国致微高压灭菌锅G154DW;分析天平,型号为赛多利斯科学仪器（北京）有限公司的2-16P。
1.1.3 实验选用的基本培养基及主要试剂 MS培养基（青岛海博生物）：取41.7 g的MS培养基溶于1 L纯水,按各实验需求加入植物激素或防褐化剂,调节pH至(5.7±0.1),倒入洗净的组培瓶中,每个组培瓶装30 mL培养基,121 ℃高温高压灭菌20 min后冷却备用。萘乙酸（NAA）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、赤霉素（GA3）、次氯酸钠（NaClO）和氯化汞（HgCl2）购买自上海生工生物,均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 不同部位外植体组培生长对比 选取‘广薯87薯’、‘川山紫’、‘三角宁’、‘高系14系’、‘薯绿一号’和‘心香’6个甘薯品种生长期约3个月的健康植株带回实验室,剪去多余的叶片,用清水彻底清洗,分别切取每个品种的顶芽、侧芽、茎段作为外植体。茎段切取所选择的部位为茎上靠近顶芽的部位,每段长1 cm,共取60份;侧芽选择切取发育较好,结构完整的侧芽,每份长约0.5 cm,共取60份;顶芽则选取发育好,结构完整的,切取长约0.5 cm,共取60份。将不同部位的60份外植体随机分为3组作为重复,每组20份,每次实验使用其中1组材料。切取完所需材料后,将3份不同的材料分别装入消毒容器中后,在无菌操作台中,先用75%的酒精消毒30 s,接着用无菌蒸馏水清洗1 min,然后用0.1%的HgCl2消毒10 min,最后用无菌蒸馏水清洗3次,每次3 min。消毒完毕将外植体接种于已制备好的MS基本培养基中,做好标记,培养30 d后观察并统计结果。
1.2.2 外植体的消毒方法优化 选取健康的‘川山紫’植株若干,剪去多余的叶片及幼嫩分支,取上半部主茎用清水洗净。用手术刀切取长约0.5 cm茎尖作为外植体,以75%酒精消毒时间,2% NaClO消毒时间,HgCl2浓度及HgCl2消毒时间作4因素4水平正交实验（L1643）。由于消毒剂残留会对植物细胞造成伤害,且会影响下一步消毒,因此每次经过消毒试剂处理后,都需要用无菌水漂洗以去除在外植体上的残留消毒剂。酒精每次处理后进行1 min/次的漂洗,漂洗1次; NaClO每次处理后漂洗2 min,漂洗2次;HgCl2每次处理后漂洗3 min,漂洗3次。消毒完毕接种于MS基本培养基中,每天观察1次并记录。
1.2.3 培养基配方的优化实验 选取健康的‘川山紫’茎尖若干,以MS作为基本培养基,选用NAA、6-BA、GA3共3种激素。各激素取4个水平作正交设计组成16组不同配方（L1643）对甘薯外植体进行组织培养。定期观察并记录各组处理生根时间,40 d后观察并测定外植体的茎长及干重,找出适于甘薯组培的激素配比。采用的外植体消毒处理方法为优化后的消毒方案：75%酒精消毒60 s,2% NaClO消毒15 min,0.1% HgCl2消毒15 min。
1.2.4 防褐化剂的筛选 选取健康的‘川山紫’茎尖若干,消毒方法为优化后的消毒方案,培养基配方为优化后的生根培养基,同时加入需筛选的防褐化剂。使用的防褐化剂为抗坏血酸、硫代硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮,活性炭和柠檬酸。
1.2.5 指标测定 生根时间测定：生根的标准为观察到外植体有明显露白,每天观察1次;茎长及干重测定时间：种植于培养基上后40 d,采取瓶外测量;茎长测量：运用游标卡尺对外植体进行测量;干重测量：100 ℃烘12 h后测干重,使用分析天平对外植体进行测量。
出芽率=出芽个数/总接种个数×100%;
污染率=污染数/总接种个数×100%;
褐化率=褐化数/总接种个数×100%;
死亡数=污染数+褐化数+玻璃化数;
死亡率=死亡数/总接种个数×100%;
存活率=(总接种个数-死亡数)/总接种个数×100%。
1.3 数据处理
利用SPSS 22.0统计分析软件对所有实验数据进行多因素方差分析（ANOVA）和极差分析,计算不同品种外植体出芽率、存活率、生根时间、茎长和干重,并进行Duncan’ s多重比较分析,采用Excel 2010软件制图。
2 结果与分析
2.1 不同外植体的选取对组培的影响
图1 各甘薯品种不同外植体的发芽率不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 Fig. 1 Germination rates of different explants for varieties of sweet potato Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). |
2.2 消毒方案对存活率的影响
表1 不同消毒方案污染率、存活率情况Tab. 1 Contamination rates, survival rates of the different disinfection programmes |
| 编号 No. | 酒精处理时间 Alcohol time/s | NaClO处理时间NaClO time/min | HgCl2浓度 HgCl2 concentration/% | HgCl2处理时间HgCl2 time/min | 污染率 Contamination rate/% | 存活率 Survival rate/% |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 15 | 0 | 0.1 | 5 | 56.7±6.7a | 37.8±5.1c |
| 2 | 30 | 5 | 0.2 | 5 | 40.0±6.7b | 50.0±8.8b |
| 3 | 45 | 10 | 0.3 | 5 | 20.0±3.3dc | 34.4±8.4c |
| 4 | 60 | 15 | 0.4 | 5 | 13.3±3.3de | 17.8±8.4d |
| 5 | 30 | 10 | 0.1 | 10 | 40.0±3.3b | 52.2±5.1b |
| 6 | 15 | 15 | 0.2 | 10 | 16.7±6.7cd | 67.8±5.1ab |
| 7 | 60 | 0 | 0.3 | 10 | 26.7±6.7c | 25.6±6.9cd |
| 8 | 45 | 5 | 0.4 | 10 | 3.3±3.3e | 22.2±6.9cd |
| 9 | 45 | 15 | 0.1 | 15 | 16.7±3.3cd | 72.2±6.9a |
| 10 | 60 | 10 | 0.2 | 15 | 13.3±3.3de | 64.4±10.2ab |
| 11 | 15 | 5 | 0.3 | 15 | 13.3±6.7cd | 22.2±5.1d |
| 12 | 30 | 0 | 0.4 | 15 | 6.7±3.3de | 12.2±5.1e |
| 13 | 60 | 5 | 0.1 | 20 | 26.7±3.3c | 58.9±5.1b |
| 14 | 45 | 0 | 0.2 | 20 | 36.7±6.7b | 38.9±5.1e |
| 15 | 30 | 15 | 0.3 | 20 | 10.0±3.3d | 14.4±5.1e |
| 16 | 15 | 10 | 0.4 | 20 | 0.0±0.0f | 3.3±3.3f |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). | |
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 |
表2 不同消毒因素水平污染率极差分析Tab. 2 Range analysis of the contamination rate of disinfection factors |
| 因素 Factor | 水平1均数K1 Horizontal 1 average K1 | 水平2均数K2 Horizontal 2 average K2 | 水平3均数K3 Horizontal 3 average K3 | 水平4均数K4 Horizontal 4 average K4 | 极差绝对值 Absolute range value | 最优方案 Optimal scheme |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 酒精时间 | 21.7 | 24.2 | 19.2 | 20.0 | 5.0 | 水平3 |
| NaClO时间 | 31.7 | 20.8 | 18.3 | 14.2 | 17.5 | 水平4 |
| HgCl2浓度 | 35.0 | 26.7 | 17.5 | 5.8 | 29.2 | 水平4 |
| HgCl2时间 | 32.5 | 21.7 | 12.5 | 18.3 | 20.0 | 水平3 |
Note: The difference of levels indicates that each significant influence on the experimental results, the larger the extreme difference value, the greater the influence of this factor, and the highest extreme difference is the main factor to be considered. | |
注：各行极差值的差异表明各处理因素对实验结果影响不同,极差越大的说明该因素对实验结果影响大,极差最大的因素为主要考虑因素。 |
综合方差和极差分析,‘川山紫’组织培养过程中污染率最小的最优消毒方案为：依次用75%酒精消毒45 s,2% NaClO消毒15 min,0.4% HgCl2消毒15 min。
表3 不同消毒因素水平存活率极差分析Tab. 3 Range analysis of the survival rate of different disinfection factors |
| 因素 Factor | 水平1均数K1 Horizontal 1 average K1 | 水平2均数K2 Horizontal 2 average K2 | 水平3均数K3 Horizontal 3 average K3 | 水平4均数K4 Horizontal 4 average K4 | 极差绝对值 Absolute range value | 最优方案 Optimal scheme |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 酒精时间 | 33.3 | 30.8 | 40.8 | 42.5 | 11.7 | 水平4 |
| NaClO时间 | 28.3 | 40.0 | 38.3 | 40.8 | 12.5 | 水平4 |
| HgCl2浓度 | 57.5 | 56.7 | 22.5 | 10.8 | 46.7 | 水平1 |
| HgCl2时间 | 36.7 | 40.8 | 41.7 | 28.3 | 13.4 | 水平3 |
Note: The difference of levels indicates that each significant influence on the experimental results. The larger the extreme difference value, the greater the influence of this factor, and the highest extreme difference is the main factor to be considered. | |
注：各行极差值的差异表明各处理因素对实验结果影响不同,极差越大的说明该因素对实验结果影响大,极差最大的因素为主要考虑因素。 |
综合方差和极差分析,‘川山紫’组织培养过程中污染率较小且存活率最高的最优消毒方案为：75%酒精消毒60 s,2% NaClO消毒15 min,0.1% HgCl2消毒15 min。
2.3 培养基激素配方对外植体生长的影响
对NAA、6-BA、GA3激素各取4个水平做正交设计,组成16组不同配方（L1643）,对‘川山紫’茎尖外植体进行组织培养的生根时间、培养40 d后茎长及干重的方差分析结果如表4所示,NAA对生根时间有显著影响（P=0.001）。
表4 不同激素处理对外植体的影响Tab. 4 Effects of different hormone treatments on explants |
| 实验组No. | NAA**/ (mg·L-1) | 6-BA/ (mg·L-1) | GA3*/ (mg·L-1) | 生根时间 Rooting time/d | 茎长 Stem height/mm | 干重增加 Dry weight increase/mg |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 0.00 | 0.0 | 0.0 | 48±3c | 8.8±0.3g | 3.3±0.1h |
| 2 | 0.00 | 1.5 | 0.1 | 35±1d | 14.5±1.3cd | 15.3±0.2a |
| 3 | 0.00 | 1.0 | 0.3 | 55±4b | 17.8±2.1c | 7.6±0.2de |
| 4 | 0.00 | 1.5 | 0.5 | 53±2b | 23.6±0.5a | 11.0±0.4c |
| 5 | 0.01 | 0.0 | 0.1 | 58±3b | 11.9±0.3f | 4.7±0.1g |
| 6 | 0.01 | 0.5 | 0.0 | 66±6ab | 11.6±0.4f | 4.4±0.2g |
| 7 | 0.01 | 1.0 | 0.5 | 70±5a | 14.4±1.6cd | 8.3±0.4d |
| 8 | 0.01 | 1.5 | 0.3 | 63±4ab | 16.2±0.4c | 7.7±0.2d |
| 9 | 0.05 | 0.0 | 0.3 | 16±2f | 14.2±0.3d | 5.9±0.2f |
| 10 | 0.05 | 0.5 | 0.5 | 25±2e | 12.3±0.2e | 3.6±0.1h |
| 11 | 0.05 | 1.0 | 0.0 | 20±2e | 16.3±0.5c | 11.6±0.4c |
| 12 | 0.05 | 1.5 | 0.1 | 19±3ef | 14.0±0.3d | 7.0±0.2e |
| 13 | 0.10 | 0.0 | 0.5 | 14±3f | 23.2±0.6a | 13.7±0.8b |
| 14 | 0.10 | 0.5 | 0.3 | 40±4d | 21.3±0.6b | 11.1±0.4c |
| 15 | 0.10 | 1.0 | 0.1 | 37±1d | 17.0±0.5c | 8.2±0.4d |
| 16 | 0.10 | 1.5 | 0.0 | 35±4d | 12.2±0.6ef | 15.9±0.5a |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). | |
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 |
表5 激素NAA、6-BA、GA3极差分析Tab. 5 Range analysis of NAA, 6-BA, GA3 |
| 因素 Factor | 生根时间Rooting time/d | 茎长Stem height/mm | 干重增加Dry weight increase/mg | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| K1 | K2 | K3 | K4 | K1 | K2 | K3 | K4 | K1 | K2 | K3 | K4 | |
| NAA | 47.8 | 64.3 | 20.0 | 31.5 | 16.2 | 13.5 | 14.2 | 18.4 | 9.3 | 6.2 | 7.0 | 12.2 |
| 6-BA | 34.0 | 43.7 | 45.5 | 41.0 | 14.6 | 15.1 | 16.4 | 16.1 | 6.9 | 6.3 | 8.9 | 11.3 |
| GA3 | 42.3 | 37.3 | 43.5 | 40.5 | 12.2 | 14.3 | 17.4 | 18.3 | 8.8 | 8.8 | 8.0 | 9.1 |
Note: The difference of levels indicates that each significant influence on the experimental results, the larger the extreme difference value, the greater the influence of this factor, and the highest extreme difference is the main factor to be considered. | |
注：各行极差值的差异表明各处理因素对实验结果影响不同,极差越大的说明该因素对实验结果影响大,极差最大的因素为主要考虑因素。 |
综合方差和极差分析结果,生根时间最短的培养基配方为：MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3。茎长增长最快的培养基配方为：MS+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3。干重增长最快的培养基配方为：MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L 6- BA+0.5 mg/L GA3。
2.4 不同防褐化剂的效果
表6 不同处理抑制剂种类及用量Tab. 6 Types and amounts of different treatment inhibitors |
| 处理编号 Treatment No. | 褐化抑制剂 Anti-browning agent | 用量 Concentations | 接种数 Number of inoculum |
|---|---|---|---|
| CK | 对照 | 0.00 | 75 |
| A1 | 抗坏血酸/(mg·L-1) | 4.00 | 75 |
| A2 | 6.00 | 75 | |
| A3 | 8.00 | 75 | |
| B1 | 硫代硫酸钠/ (g·L-1) | 4.00 | 75 |
| B2 | 5.00 | 75 | |
| B3 | 6.00 | 75 | |
| C1 | 聚乙烯吡咯烷酮/ (g·L-1) | 0.75 | 75 |
| C2 | 1.00 | 75 | |
| C3 | 1.25 | 75 | |
| D1 | 活性炭/(g·L-1) | 0.50 | 75 |
| D2 | 0.75 | 75 | |
| D3 | 1.00 | 75 | |
| E1 | 柠檬酸/(g·L-1) | 4.00 | 75 |
| E2 | 5.00 | 75 | |
| E3 | 6.00 | 75 |
Note: Letters represent the type of anti-browning agent, numbers re resent the level of treatment, 1, 2, 3 represent low, medium, and high levels of treatment, respectively. | |
注：字母代表防褐化剂种类,数字代表处理水平,1、2、3分别代表低、中、高水平处理。 |
综合来说,硫代硫酸钠的防褐化效果较好,聚乙烯吡咯烷酮的抑制效果比较均匀,柠檬酸和活性炭的整体效果差异不明显,抗坏血酸的效果在几组中表现较差。在甘薯组织培养中,5~6 g/L硫代硫酸钠和1.25 g/L聚乙烯吡咯烷酮能有效地抑制外植体的褐变。
3 讨论
外植体部位、消毒方案、培养基配方以及防褐化剂的选择是热带地区甘薯主栽品种的再生体系构建的关健技术环节。本研究表明,比较不同部位外植体存活率,应优先选择侧芽和顶芽,最后为茎段。芽作为生长点含有大量生长素等激素类物质,出芽率会明显高于茎段。类似的结果在菊花组织培养中也有体现,带芽茎段作外植体优于其他部位[11]。本研究中,甘薯芽的成苗率明显高于茎段,且侧芽要优于顶芽,推测是顶芽的生长素过高,抑制生长导致。此外,本研究结果表明,甘薯茎段作外植体时存活率波动较大,可能是不同品种甘薯茎段中所含微生物种类不同,其导致消毒效、污染率的不同,最终导致了存活率的较大波动。
在消毒方式的影响实验中,本研究发现,成苗率与消毒剂的浓度及处理时间密切相关。高浓度消毒剂污染程度虽低,但成苗率也不高。过高的消毒剂浓度和过长的消毒时间可损伤植物材料,导致随后的组培过程中的玻璃化或褐化死亡的情况,宜选用较低浓度的HgCl2与NaClO联合进行消毒。李鸿雁[12]在研究紫色甘薯组培快繁体系时认为0.2% HgCl2的溶液消毒6 min,可达到理想的消毒效果。赵雨佳等[13]在高淀粉甘薯茎尖脱毒与组培技术研究中提出外植体用0.1%升汞溶液消毒7~8 min消毒效果理想。李怀情等[14]在研究‘紫云’甘薯快繁技术时发现,浓度高的消毒剂虽然灭菌效果较好,但对外植体的伤害也较大,严重的会导致褐化死亡。本研究的实验结果与以上学者的结论基本一致。
在植物激素的影响实验中,激素的配比对成苗速度有显著影响。其中NAA为生长素,具有促进植物伸长生长、促进插枝生根的作用。6-BA为细胞分裂素,具有促进细胞分裂和扩大,诱导芽的分化,延缓叶片衰老的作用。GA3为赤霉素,具有促进细胞伸长,从而引起茎秆伸长和增高的作用。顾淼[15]在‘商薯19薯’的组培中认为在培养基中加入适量的6-BA和NAA有利于芽的诱导分化,且浓度过高或过低都会抑制外植体的生长。王颖[16]在‘商薯19薯’的组培结果中发现6-BA可有效诱导苗的增殖,但较低浓度的效果不佳,且6-BA与NAA的组合不利于叶的生长。张军云等[17]认为紫甘薯的最适培养基分别为：初代培养基MS+2.0 mg/L 6-BA,增殖培养基MS+ 1.0 mg/L 6-BA+0.1~0.2 mg/L NAA,生根培养基1/2 MS+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IAA。本研究同样选用了6-BA与NAA作为培养基添加激素,且最终确定的最优浓度与以上结果类似,并未存在较大范围偏差,可认为本研究确定的激素浓度水平适宜所选定甘薯品种的再生培养。
对于组织培养中的褐化现象,周俊辉等[18]认为,对母株和外植体的预处理、创造适宜的培养条件、或在培养基中加入抑制剂等措施均可减少褐化现象的发生。张赟彬等[19]对各褐变抑制剂的效果强度排序为：亚硫酸钠>抗坏血酸>柠檬酸。在单一抑制剂浸泡实验中,柠檬酸效果最好,抗坏血酸效果最差,而亚硫酸钠对浸泡时间长短的作用表现不明显。陈吉裕等[20]在研究延龄草无菌培养体系的建立及防褐变措施时得出结论,抗坏血酸、活性炭和聚乙烯吡咯烷酮均可明显降低延龄草根茎组培种的褐变率,3种添加成分抑制褐变的效果没有明显差异,但活性炭防褐变效果相对最好,抗坏血酸次之,聚乙烯吡咯烷酮效果最差。本研究在设计时同时考虑了5种防褐化剂的效果,发现硫代硫酸钠效果最好。当比较抗坏血酸和柠檬酸时,发现两者差别不大,这与张赟彬等[19]研究结论略有出入。当比较抗坏血酸、活性炭和聚乙烯吡咯烷酮时,其研究结论与陈吉裕等[20]完全一致,即防褐化剂对不同植物材料的组培作用效果相似。因此,可将本研究结论推广至其他植物组培中。
综上,本研究结果表明,不同部位外植体中侧芽增殖率与存活率最高。在不同的外植体消毒处理中,依次用75%酒精消毒60 s,2% NaClO消毒15 min,以及0.1% HgCl2消毒15 min的污染率最低。最佳的生根培养基配方为：MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3;茎长生长最快的培养基配方为MS+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3;干重增长最快的培养基配方为：MS+0.1 mg/L NAA+ 1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3。在培养基中加入5~6 g/L硫代硫酸钠和1.25 g/L聚乙烯吡咯烷酮能有效地抑制外植体的褐变。