Welcome to Chinese Journal of Tropical Crops,

Chinese Journal of Tropical Crops >

2019 , Vol. 40 >Issue 12: 2447 - 2455

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.019

Crop Pests, Diseases and Their Control, Environmental Protection

Effects of smy1 Gene Knockout on Physiological Function of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4

  • HE Zhuang 1, 2 ,
  • QI Yanxiang 2 ,
  • ZENG Fanyun 2 ,
  • DING Zhaojian 2 ,
  • LIANG Junwei 1, 2 ,
  • ZHANG Xin 2 ,
  • PENG Jun 2 ,
  • XIE Peilan 2 ,
  • XIE Yixian , 2, *
Expand
  • 1. Institute of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China
  • 2. Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China
XIE Yixian,E-mail：

Received date: 2019-01-15

  Request revised date: 2019-05-11

  Online published: 2019-12-20

Copyright

Copyright reserved © 2019. Office of Acta Agronomica Sinica All articles published represent the opinions of the authors, and do not reflect the official policy of the Chinese Medical Association or the Editorial Board, unless this is clearly specified.
Fold

Abstract

Smy1 is a kinesin involved in the regulation of fungal growth. In the study, the smy1 kinesin gene of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 (Foc 4) was cloned. The smy1 knockout mutant of Foc 4 was obtained by homologous recombination technique. Besides observing the mycelial morphological characteristic, growth rate and sporulation of the mutants, pathogenicity to banana seedlings and sensitivity to fungicide were studied in order to reveal the role of smy1 played in the growth and development of F. oxysporum and resistance to fungicide. The results showed that, compared with the Foc 4 wild-type strain, the knockout mutants grew slowly, the mycelial morphology changed, the sporulation increased, and the pathogenicity to banana plantlets seedlings decreased, but the resistance level to fungicide changed little. This indicates that the smy1 gene may play an important role in the growth, sporulation and pathogenicity in Foc 4.

Key words： Fusarium oxysporum; gene knockout; pathogenicity; smy1 gene

Cite this article

HE Zhuang , QI Yanxiang , ZENG Fanyun , DING Zhaojian , LIANG Junwei , ZHANG Xin , PENG Jun , XIE Peilan , XIE Yixian . Effects of smy1 Gene Knockout on Physiological Function of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2019 , 40(12) : 2447 -2455 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.019

香蕉枯萎病又称香蕉巴拿马病,属于检疫性病害,它的病原菌是尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）,是一种毁灭性土传病害,在热带、亚热带地区广泛传播,香蕉产业也曾因其造成巨大的经济损失[1],目前还没有任何单一的生物或者化学药剂可以长期有效控制香蕉枯萎病。由多菌灵等苯丙咪唑类杀菌剂的大量和长期使用带来的田间抗药问题极其严重,氰烯菌酯活性高专性强,结构新颖独特,高效且价格低廉,对多种镰刀菌引起的植物病害都已有化学防治成功的报道,作为一种新型的杀菌剂被用来防治镰刀菌引起的危害,并取得了一定的效果[2]。
氰烯菌酯是一种结构新颖机制独特的新型杀菌剂,它能强烈抑制镰刀菌菌丝的生长[3],毒性低且对植物没有药害[4],并对镰刀菌属有专化性,对其他植物病原菌如白粉病菌、稻瘟病菌等活性较差或者完全没有活性[5]。通过荧光定位方法检测到氰烯菌酯能抑制其敏感菌株的肌球蛋白运动,氰烯菌酯对Ⅰ型肌球蛋白中ATP酶的活性有很强的抑制作用。而氰烯菌酯对镰刀菌独特专一的抑制作用,是因为镰刀菌与其他真菌的Ⅰ型肌球蛋白氨基酸序列有较大差异[6]。
在酵母（Saccharomyces cerevisiae）中,Smy1蛋白是Ⅴ型肌球蛋白Myosin5的协作蛋白,smy1具有部分互补myosin2B基因的功能作用,而通过酵母双杂实验表明smy1和myosin2B具有较强的互作关系。在镰刀菌中,myosin5的点突变赋予了禾谷镰刀菌对氰烯菌酯的抗性,不同位置的点突变导致不同程度的抗性[7]。而其他两个肌球蛋白通过与myosin5的相互作用和调控表达来综合调节对氰烯菌酯的抗性。有研究表明,smy1突变体致病力下降是因为镰刀菌中smy1基因对毒素合成表现为正调控,毒素下降是突变体致病力下降的主要原因[8]。因此,研究smy1基因对氰烯菌酯的抗药性调控也很有必要。
本研究利用同源重组技术获得香蕉枯萎病菌的smy1基因敲除突变体,对smy1基因敲除突变体的菌丝形态、生长速度、产孢量、对香蕉的致病力和对氰烯菌酯的抗性进行分析[9,10,11],完善该基因的具体功能,以期为香蕉枯萎病菌对氰烯菌酯的抗性研究提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试药剂 使用前将94.9%氰烯菌酯原药（西北农林科技大学刘西莉教授惠赠）用二甲基亚砜溶解,配制成10 mg/mL的母液;Calcofluor White Stain（荧光增白剂,CFW）,购于Stgma- Aldrich公司;Congo Red（刚果红）购于北京拜尔迪生物技术有限公司;Hygromycin B（潮霉素B）溶液购于AMRESCO,北京;Driselase（20 mg/mL,Sigma）细胞壁裂解酶,Lysing enzyme（10 mg/mL）溶壁酶,购于广东省微生物所;氨苄青霉素-Na（10 mg/mL）,购于Biofrox公司。
1.1.2 供试菌株和实验植株 香蕉枯萎病菌4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4,Foc 4）,由本实验室（中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,热带果树病害课题组）鉴定、保存并提供。供试香蕉苗为5~7片叶的巴西蕉。
1.1.3 培养基 PDA培养基（葡萄糖20 g/L,土豆200 g/L,琼脂20 g/L）;PDB培养基（葡萄糖20 g/L,土豆200 g/L）;SR筛选培养基（胰蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,酵母浸膏5 g/L,琼脂20 g/L,琼脂粉25 g/L）。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 将香蕉枯萎病菌野生型菌株接种到PDA培养基上,收集新鲜有活力的菌丝,采用CTAB法提取基因组DNA。
1.2.2 smy1基因克隆与分析和同源性比较 根据尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种菌株的smy1基因核酸序列（GenBank登录号：ESU11006）已完成测序的结果,用DNAman软件在其序列两端设计特异性引物：Foc 4-smy1-F（5′-ACTCTTTC CACCGCTGCCTAT-3′）/Foc 4- smy1-R（5′-CACCTAACTCCTCCGCTGTGG- 3′）。利用PTC200 PCR仪（MJ RESEARCH）上进行PCR扩增反应,制备1.5%的琼脂糖凝胶,对PCR产物进行电泳检测。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,60 ℃退火1 min 40 s,72 ℃延伸2 min 50 s;循环32次,72 ℃延伸6 min,调整至16 ℃保存。配制PCR总体积50 μL,正反引物各1 μL（20 μmol/L）,dNTP混合物（2.5 mmol/L）2 μL,10×buffer缓冲液5 μL,0.25 μL Taq酶（5 U/μL）,DNA添加1 μL,余下用无菌超纯水补足至50 μL。
用GenBank数据库与测得序列进行同源性分析,通过BLAST搜索分析smy1基因的同源性,用Clustal X 2.0软件进行多重序列比对,最后用常用软件MEGA 6.0构建进化树。
1.2.3 smy1基因敲除重组片段扩增 采用Split-marker技术基因重组原理进行PCR扩增,以野生型Foc 4 DNA为模板,使用设计的引物组合Foc 4-smy1-LBCK和Foc 4-smy1-HPH-LB-R,Foc 4-smy1-HPH-RB-F和Foc 4-smy1-RBCK（表1）扩增第一轮上下游片段。重组PCR用引物Foc 4-smy1-LB-F和HYG-R1、HYG-F1和Foc 4- smy1-RB-R（表1）来扩增第二轮上下游片段。最后获得smy1基因重组片段。
表1 本实验所用引物序列

Tab.1 Primer sequences used in the assay

引物名称
Primer name		 序列（5′-3′）
Sequence (5′-3′)
HYG-F CTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGT
HYG-R CCCGGTCGGCATCTACTCTATTC
HYG-R1 GGATGCCTCCGCTCGAAGTA
HYG-F1 CGTTGCAAGACCTGCCTGAA
HPT-LBCK GACAGACGTCGCGGTGAGTT
HPT-RBCK TCTGGACCGATGGCTGTGTAG
Foc 4-smy1-LBCK ACTCTTTCCACCGCTGCCTAT
Foc 4-smy1-HPH-LB-R ACCTCCACTAGCTCCAGCCAAGGGTTGTTGGTCTTGTTTCACTCG
Foc 4-smy1-LB-F CACCTAACTCCTCCGCTGTGG
Foc 4-smy1-HPH-RB-F GAATAGAGTAGATGCCGACCGGGGGCGAAGATGACACAGAGGG
Foc 4-smy1-RBCK TGGTGAGGTTGGATAGAATAGAGGG
Foc 4-smy1-RB-R GCCAATCTGCCTTGTAAGCG
Foc 4-smy1-CK-F CAGATGTGGCGTGCTGGTG
Foc 4-smy1-CK-R ACTCGCTTGAGGAAGTGCTGT
1.2.4 原生质体制备及转化 将振荡培养3 d的1~2 mL Foc 4菌液加入到PDB培养基中,并在28 ℃和160 r/min下继续振荡培养过夜。然后将菌液通过灭菌并含有4层擦镜纸的漏斗过滤,并通过用无菌水和0.7 mol/L NaCl冲洗来收集菌丝。将崩溃酶加入菌丝中,振荡酶解3~4 h,过滤收集酶解后的原生质体,在显微镜下观察,并将原生质体的浓度调节至108 cells/mL。参考王飞燕等[12]的研究对原生质体制备实验改善进行。
参照韩小路等[13]的方法进行PEG介导的原生质体转化实验。取50 μL第二轮扩增上下游重组片段,加入到400 μL原生质体中混匀,冰上放置20 min。逐滴滴加2 mL配制好的PTC溶液,室温20 min左右;然后加入到含有80 μg/mL潮霉素B和120 μg/mL氨苄青霉素的选择再生培养基中,在28 ℃培养3~7 d挑斑获取转化子。
1.2.5 smy1敲除突变体鉴定 通过CTAB法[14,15]略作改善提取Foc 4与smy1转化子的基因组DNA,并通过PCR模板扩增。根据smy1上游片段和潮霉素基因序列设计引物Foc 4-smy1-LBCK和HPT-RBCK（表1）,根据潮霉素基因序列和smy1下游片段设计引物Foc 4-smy1-RBCK和HPT- LBCK（表1）,根据潮霉素基因片段设计特异引物HYG-F和HYG-R（表1）,根据smy1基因序列设计特异性内源引物Foc 4-smy1-CKFP和Foc 4- smy1-CKRP,使用这4对特异性引物通过PCR鉴定smy1基因的转化子,若引物Foc 4-smy1-CKFP/ Foc 4-smy1-CKRP扩增出来结果显示阴性,且同时引物Foc 4-smy1-LBCK/HPT-LBCK、HPT-RBCK/ Foc 4-smy1-RBCK和HYG-F/HYG-R扩增出来结果都为阳性,即为正确的smy1敲除突变体。
1.2.6 smy1敲除突变体对氰烯菌酯的敏感性测定和非生物胁迫检测 将野生型菌株Foc 4和smy1敲除突变体菌株在PDA平板活化一周,用打孔器在平板上打取6 mm的菌饼分别接种于含有Calcofluor White Stain（终浓度100 μg/mL）,Congo Red（终浓度100 μg/mL）,SDS（终浓度0.02%）,Sorhitol（终浓度1.2 mol/L）和H2O2（终浓度5 mmol/L）的MM平板上,未添加任何试剂的MM平板作为对照,28 ℃培养7 d,观察菌落生长状态,测量菌落直径记录并计算抑制率,实验重复3次,每次设3个重复。
参照张承启等[16]的方法对供试菌株进行氰烯菌酯敏感性测定。将smy1敲除突变体和野生型菌株Foc 4接种到PDA平板上,28 ℃培养5 d得到具有新鲜活力的菌株。用打孔器从菌落边缘打取直径为6 mm菌饼置,分别接种在含氰烯菌酯为0、2、4、8、15、50、100、200 μg/mL 8个处理终浓度的PDA平板上。28 ℃恒温培养箱培养,每个浓度做3个平板,实验重复3次。用十字交叉法测量菌落直径,计算取平均值并进行抑制率换算,查生物统计几率换算表,将药剂浓度转换为对数值同时将抑制率转换为几率值,进行回归分析,计算EC50。
1.2.7 smy1敲除突变体生物学特性分析 生长速率和生长形态测定：将smy1敲除突变体和野生型菌株Foc 4接种到PDA平板上,28 ℃培养,每天观察菌落生长状态,并于隔天拍照,设置平行实验3个重复,实验重复3次。
产孢量测定：分别从长有smy1敲除突变体和野生型菌株Foc 4（均培养了7 d）的PDA平板上打直径6 mm的菌饼3个,置于100 mL PDB培养基中摇培3 d,过滤取滤液加水稀释用血球计数板计数测算孢子浓度,实验重复3次。
菌丝观察：从恒温振荡培养3 d的smy1敲除突变体和野生型菌株Foc 4中取过滤收集的菌丝,制片于显微镜下观察菌丝形态并拍照记录。
1.2.8 smy1敲除突变体致病性测定分析 将野生型菌株Foc4和smy1敲除突变体接种于PDB中,置于调控温度为28 ℃、转速为160 r/min的摇床震荡培养3 d,过滤收集孢子,用无菌水稀释孢子悬浮液至106个/mL的浓度。采用盆栽伤根法接种香蕉幼苗。每株苗滴加20 mL孢子悬浮液,每个处理接种24株香蕉苗,以无菌水作为对照,实验重复3次。栽培管理让其生长30 d,取出观察球茎褐变程度及外部叶片黄化情况,记录并拍照作为实验数据,纵向切开巴西蕉球茎,参考Mohamed等[17]的病情调查分级标准,记录每株蕉苗的发病等级,最后对病情指数进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 野生型菌株对氰烯菌酯敏感性测定

在含不同浓度氰烯菌酯平板上对野生型菌株Foc 4进行敏感性测定。由图1知,生长7 d后,对照组长满平板,野生型菌株Foc 4对氰烯菌酯表现出浓度效应的抑制作用,氰烯菌酯浓度分别为2、4、8、15、50、100、200 μg/mL时,对应的抑制率分别为8.75%、48.75%、72.5%、80.87%、88.13%、96.25%、98.75%,计算的EC50为6.2 μg/mL。
图1 不同浓度的氰烯菌酯对野生型菌株Foc 4抑制情况

Fig. 1 Inhibition of wild-type strain Foc 4 by different concentrations of phenamacril

2.2 smy1基因的序列分析和同源性比较

野生型菌株Foc 4的smy1基因全长2943 bp,包含3个外显子和2个内含子,GenBank登陆号：EXL99923,编码的蛋白由944个氨基酸残基组成。
用MEGA 6.0软件构建进化树,Foc 4中smy1基因的氨基酸序列,与和禾谷镰刀菌（F. graminearum）（AAP68979.1）、木霉菌（Trichoderma harzianum）(PNP52028.1)、尖孢镰刀菌番茄专化型（F. oxysporum f. sp. lycopersici）（XP_018241948.1）等几种常见的植物病原真菌中的smy1氨基酸序列有很高的同源性（图2）。
图2 smy1系统进化分析

Fig. 2 Phylogenetic analysis of smy1

2.3 扩增smy1基因敲除重组片段

本实验PCR扩增根据Split-marker技术原理进行。如图3所示,第一轮PCR扩增出上下游片段在电泳图中位置与实际大小1999 bp和2065 bp相符,扩增出的潮霉素（HYG）基因片段在图中位置与实际1376 bp相符,第二轮PCR扩增出上下游片段在图中位置与实际相符,分别为2636 bp和2542 bp,二扩产物可用于原生质体转化实验。
图3 smy1基因敲除重组片段和扩增电泳示意图

A：smy1基因同源重组敲除示意图;B：两轮PCR扩增的上下游片段（1~2：第一轮PCR扩增上下游片段;3：扩增出来HYG基因;4~5：第二轮PCR扩增上下游片段;M：DNA Marker DL 5000）。

Fig. 3 Schematic diagram of smy1 gene knockdown recombinant fragment and amplification electrophoresis

A: schematic diagram of homologous recombination knockout of smy1 gene; B: upstream and downstream fragments amplified by two rounds of PCR (1-2: first round PCR amplification of upstream and downstream fragments; 3: amplification of HYG gene; 4-5: second round of PCR amplification of the upstream and downstream fragments; M: DNA Marker DL 5000).

2.4 smy1敲除突变体的PCR鉴定

通过PEG介导的转化和潮霉素筛选,挑斑培养获得生长状态良好的转化子96个。转接后分别提取转化子的基因组DNA,用引物HPT-LBCK/ Foc 4-smy1-LBCK、HPT-RBCK/Foc 4-smy1- RBCK、HYG-F/HYG-R和Foc 4-smy1-CK-F/Foc 4-smy1- CK-R进行PCR扩增。经琼脂糖凝胶电泳,96个转化子中阳性转化子有8个,挑出其中4个转化子做后续验证。用引物HPT-LBCK/Foc 4-smy1-LBCK和HPT-RBCK/Foc 4-smy1-RBCK对这4个转化子的DNA进行PCR扩增,扩增出2个条带大小分别为2393、2170 bp,符合预期条带大小,以Foc 4基因组DNA为模板扩增作为对照（图4A）。用引物Foc 4-smy1-CKFP/Foc 4-smy1-CKRP进行PCR扩增,显示4个转化子无扩增条带,且Foc 4基因组DNA条带位置与实际大小697 bp相符（图4B）。用引物HYG-F/HYG-R进行PCR扩增,获得约1376 bp的条带,Foc 4为对照未扩增出条带（图4C）。以上结果表明这4个转化子的smy1基因已被敲除,将其分别命名为smy1-1、smy1-2、smy1-3和smy1-4。其中选取smy1-1敲除突变体作为研究对象进行后续研究。
图4 smy1敲除突变体的PCR验证

A：1~2：验证敲除突变体的上下游重组片段PCR扩增,条带大小分别为2393、2170 bp,H2O和Foc4为对照,M：DL 5000 Marker;B：1~4：敲除突变体内源基因PCR扩增为空白条带,5：H2O对照,6：Foc4对照,条带大小为697 bp,M：DL 5000 Marker;C：1~4：敲除突变体潮霉素基因PCR扩增,5：H2O对照,6：Foc4对照,条带大小为1376 bp,M：DL 5000 Marker。

Fig. 4 Identification of smy1 knockout mutants by PCR

A: 1-2: PCR amplification of the upstream and downstream recombinant fragments of the knockout mutant was verified, the band sizes were 2393 bp, 2170 bp, H2O and Foc4 were controls, M: DNA Marker DL 5000; B: 1-4: Knockout mutant in vivo gene amplification by PCR, 5: H2O control, 6: Foc4 control, band size 697 bp, M: DNA Marker DL 5000; C: 1-4: knockout mutation PCR amplification of the hygromycin gene, 5: H2O control, 6: Foc4 control, band size 1376 bp, M: DNA Marker DL 5000.

2.5 smy1敲除突变体对氰烯菌酯敏感性测定

将野生型菌株Foc 4和smy1敲除突变体分别接种到含有不同浓度氰烯菌酯的PDA平板上,测定smy1敲除突变体和野生型菌株Foc 4对氰烯菌酯敏感性。结果表明smy1敲除突变体（EC50= 6.4 μg/mL）和野生型菌株Foc 4（EC50=6.2 μg/mL）对氰烯菌酯的敏感性差异不显著（图5）。
图5 野生型菌株Foc 4和smy1敲除突变体在不同浓度氰烯菌酯的PDA平板上的菌落生长情况

Fig. 5 Colony growth of wild-type strains Foc 4 and smy1 knockout mutants on PDA plates with different concentrations of phenamacril

2.6 smy1敲除突变体的非生物胁迫分析

smy1敲除突变体对渗透压、氧化压力和细胞壁选择性压力均不敏感,对SDS非生物胁迫敏感（图6）。以普通MM培养基做对照,1.2 mol/L的Sorhitol对野生型菌株Foc 4和smy1敲除突变体的抑制率分别为44.9%和14.3%,表现出促进生长的特点;5 mmol/L H2O2 对野生型菌株Foc 4和smy1敲除突变体的抑制率分别为59.2%和35.7%,野生型菌株Foc 4受到明显抑制;0.02% SDS对野生型菌株Foc 4和smy1敲除突变体的抑制率分别为49%和71.4%,smy1敲除突变体受到的抑制较Foc 4明显;100 μg/mL CR（Congo Red）对野生型菌株Foc 4和smy1敲除突变体的抑制率分别为55.1%和28.6%,野生型菌株生长受到明显抑制;100 μg/mL CFW（Calcofluor White）对野生型菌株Foc 4和smy1敲除突变体的生长抑制率分别为61.2%和50%。
图6 不同胁迫因子对野生型菌株和smy1敲除突变体菌落生长的影响

Fig. 6 Effects of different stress factors on the growth of wild-type strains and smy1 knockout mutant colonies

2.7 smy1敲除突变体的生长特性分析

将smy1敲除突变体和野生型菌株Foc 4接种在PDA平板上28 ℃培养7 d,每天测量菌落直径。结果表明,野生型菌株Foc 4生长速度较快,7 d后菌丝几乎长满平板,而smy1敲除突变体菌丝生长缓慢（图7A,图7B）。通过光学显微镜观察野生型菌株Foc 4和smy1敲除突变体的菌丝发现,与野生型菌株Foc 4菌丝相比smy1敲除突变体的菌丝生长出现畸形（图7C,图7D）。收集统计菌株生长的孢子量,结果显示野生型菌株Foc 4的孢子浓度约为2.605×106个/mm2,smy1敲除突变体的孢子数量浓度约为6.053×106个/mm2（图7E）,smy1敲除突变体产孢量相对增加。
图7 smy1敲除突变体生物学特性

A: Foc 4 和smy1 菌落形态（2、4、6和7 d）;B：菌落生长直径;C：产孢量比较;D：Foc 4菌丝生长形态;E：smy1菌丝生长形态。误差线代表3次生物学重复的标准误差,不同小写字母代表差异显著（P<0.05）。

Fig. 7 Biological characteristics of smy1 knockout mutants

A: The colonies morphology of Foc 4 and smy1 (2, 4, 6 and 7 d); B: The diameter of colonies; C: The conidia of the smy1 mutants and Foc 4; D: The mycelial growth form of Foc 4; E: The mycelial growth form of smy1 mutants. The error bar represents the standard error of three biological repetitions, and different lowercase letters represent significant difference (P<0.05).

2.8 smy1基因敲除突变体的致病性

将野生型菌株Foc 4和smy1敲除突变体接种巴西蕉苗,让其侵染1个月,观察检测发现接种野生型菌株Foc 4的蕉苗出现黄化枯萎现象的叶片数量较多,甚至出现植株整株死亡的现象,纵向切开球茎测量球茎褐化部位占比并分级,大部分病级严重度达到5~7级;接种过smy1敲除突变体的巴西蕉苗出现部分植株下部少量叶片变黄现象,切开球茎观察到部分球茎呈现轻微的褐化现象,病害症状较轻;用H2O作为对照组的蕉苗生长状态良好,没有出现叶片黄化现象,对其切开球茎也未观察到褐化现象（图8A）。根据病情分级计算病情指数结果,接种野生型菌株Foc 4的平均病情指数为67.50,接种smy1敲除突变体的巴西蕉苗平均病情指数为37.50,接种smy1突变体的香蕉苗病情指数低于接种野生菌株Foc 4的病情指数（图8B）,突变体的致病能力下降。表明smy1基因在野生型菌株Foc 4的侵染香蕉苗和致病性方面起着重要作用。
图8 smy1基因敲除突变体的发病症状

A：Foc 4野生型菌株和smy1菌株侵染的巴西蕉球茎发病症状;B：巴西蕉苗病级指数。误差线代表3次生物学重复的标准误差,不同小写字母代表差异显著（P<0.05）。

Fig. 8 Pathogenicity test of smy1 mutant strain

A: Symptoms of the Brazilian banana bulb infected by Foc 4 wild-type strain and smy1 strain; B: Brazilian banana seedling disease index map. The error bar represents the standard error of three biological repetitions, and different lowercase letters represent significant difference (P<0.05).

3 讨论

本研究利用同源重组原理,经转化获得了smy1基因的敲除突变体,与尖孢镰刀菌野生型菌株相比,其菌丝长很密集,生长速度下降,且菌丝呈现不规则的发散状,但是产孢量增加,除对SDS敏感之外,对其他的细胞壁选择性压力、氧化压力和渗透压力表现均不敏感。通过其致病力实验发现,接种过突变体的香蕉幼苗比接种野生菌的香蕉苗发病症状轻,这与刘秀梅[7]的研究敲除smy1基因致病力结果一致,切开球茎,通过病情分级测量得出其侵染范围低于野生菌株的侵染范围。由此表明smy1基因在调控镰刀菌致病力方面起着重要作用。用氰烯菌酯做敏感性测试,发现其对smy1敲除突变体的EC50值与Foc 4野生型菌株没有显著差异,表明突变体对氰烯菌酯的抗性没有显著变化,未能达到预期效果,这与Liu等[18]的结果有所不同,推测在尖孢镰刀菌中smy1基因的突变对氰烯菌酯的抗药性不明显。
综上所述,smy1基因的敲除导致香蕉枯萎病菌生长缓慢,产孢增加,菌丝畸形,致病力减弱。推测smy1基因在香蕉枯萎病菌的生长发育及致病力等方面发挥着重要作用,但对香蕉枯萎病菌致病性的具体调控机制还需进一步研究。

References

Publishing order | Descend order by publishing year | Descend order by cited within
[1]
李晓娜, 曾小红, 张慧坚 , 等. 世界香蕉枯萎病防治研究进展[J]. 中国热带农业, 2017(6):71-73.

[2]
张承启 . 新型杀菌剂氰烯菌酯对禾谷镰刀菌的作用机制研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2016.

[3]
Bollen G J, Scholten G . Acquired resistance to benomyl and some other systemic fungicides in a strain of Botrytis cinerea in cyclamen[J]. Netherlands Journal of Plant Pathology, 1971,77(3):83-90.

DOI

[4]
Chinthalapudi K, Taft M H, Martin R , et al. Mechanism and specificity of pentachloropseudilin-mediated inhibition of myosin motor activity[J]. Journal of Biological Chemistry, 2011,286(34):29700-29708.

DOI

[5]
高启迅 . 小麦赤霉病菌对常用杀菌剂的抗性研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2016.

[6]
李恒奎, 陈长军, 王建新 , 等. 禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的敏感性基线及抗药性风险评估研究[C]// 中国植物病理学会2005年学术年会暨植物病理学报创刊50周年纪念会论文集. 保定. 2005: 42.

[7]
刘秀梅 . 亚洲镰孢菌(Fusarium asiaticum)对氰烯菌酯抗性水平调控机制的研究[D]. 南京: 南京农业大学, 2016.

[8]
Zheng Z, Hou Y, Cai Y , et al. Whole-genome sequencing reveals that mutations in myosin-5 confer resistance to the fungicide phenamacril in Fusarium graminearum[J]. Scientific Reports, 2015,5:8248.

DOI PMID

[9]
刘远征, 漆艳香, 曾凡云 , 等. 香蕉枯萎病菌4号生理小种β1-微管蛋白基因的功能分析[J]. 热带作物学报, 2018,39(6):1153-1160.

[10]
王小琳, 李春强, 杨景豪 , 等. 香蕉枯萎病菌4号生理小种cat1基因敲除与表型分析[J]. 热带作物学报, 2017,38(2):335-342.

[11]
符冬妹 . 基于致病性丧失突变体Focr4-1366的香蕉枯萎病菌致病相关基因功能分析[D]. 海口: 海南大学, 2015.

[12]
王飞燕, 郭立佳, 杨腊英 , 等. 尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种fpd1基因敲除与表型分析[J]. 热带作物学报, 2015,36(8):1462-1468.

[13]
韩小路, 白静科, 张玮 , 等. PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichum fructicola原生质体转化[J]. 西北农业学报, 2016,25(3):442-449.

[14]
漆艳香, 谢艺贤, 张欣 , 等. 香蕉枯萎菌基因组DNA提取方法的研究[J]. 生物技术, 2004,14(6):32-34.

[15]
Li C, Shao J, Wang Y , et al. Analysis of banana transcriptome and global gene expression profiles in banana roots in response to infection by race 1 and tropical race 4 of Fusarium oxysporum f. sp. cubense[J]. BMC Genomics, 2013,14(1):851.

DOI PMID

[16]
张承启 . 新型杀菌剂氰烯菌酯对禾谷镰刀菌的作用机制研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2016.

[17]
Mohamed A A, Mak C, Liew K W , et al. Early evaluation of banana plants at nursery stage for Fusarium wilts tolerance[C]// Molina A B, Masdek N H, Liew K W. Banana Fusarium wilt management: towards sustainable cultivation. Rome: INIBAP Press, 2001: 174-185.

[18]
Liu X, Zheng Z, Li B , et al. A myosin passenger protein gene (FaSmy1) is an essential regulator of cell development, pathogenicity, DON biosynjournal, and resistance to the fungicide phenamacril in Fusarium asiaticum[J]. European Journal of Plant Pathology, 2017,148(3):709-722.

DOI

Options
Outlines

/

〈 〉

琼ICP备19001573号
Copyright © Chinese Journal of Tropical Crops, All Rights Reserved.
Tel: 0898-66989102　E-mail: rdzx136@163.com
Powered by Beijing Magtech Co. Ltd