枇杷（Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.）隶属于蔷薇科（Rosaceae）枇杷属（Eriobotrya）,是我国南方主要经济树种和名贵特产果树之一[1,2],枇杷原产我国西南（四川雅安境内大渡河流域）,已有2100多年的栽培历史;我国是世界枇杷的自然分布中心和栽培中心[3,4]。四川是枇杷的栽培大省,栽培面积4万hm2,产量40万t,其栽培面积和产量均居全国第一。枇杷已成为四川最具特色和竞争优势的亚热带果品之一,在推动四川盆周山区农村经济发展、产业结构调整和农民增收致富中占有重要地位[5]。
1 材料与方法
1.1 材料
供试的6个枇杷品种分别为冠玉、宁海白、大五星、龙泉5号、早钟6号,WT（白肉芽变）,所有材料均为3年生盆栽嫁接苗,砧木为解放钟;选择长势基本一致,高度为80~90 cm、幼果直径大小为1.2~1.3 cm的挂果盆栽为试材。
1.2 方法
1.2.1 低温胁迫 将盆栽苗进行梯度降温后（降温速度为4 ℃/h）,分别进行不同温度（3 ℃、1 ℃、-1 ℃、-3 ℃、-5 ℃）,每个温度梯度均处理24 h,以25 ℃为对照,1 ℃处理置于人工气候箱（光照时间9 h/d,光照强度为3000 lx,空气湿度60%）。-1 ℃、-3 ℃、-5 ℃处理置于低温植物培养箱中进行（其精确度为±1 ℃,空气湿度、光照时间和强度同人工气候箱处理相一致）,每个温度梯度处理5盆,重复3次。盆栽苗经预设低温处理后室温恢复12 h,分别选取不同处理后直径大小为1.2~1.3 cm幼果,手术刀冰面上迅速切取幼果种胚,液氮速冻后超低温保存进行相关生理指标测定。
1.2.3 生理指标的测定 细胞膜透性采用电导率法,REC和Logistic方程配合,计算种胚的半致死温度LT50;丙二醛（MDA）的测定采用硫代巴比妥酸法;超氧化物歧化酶（SOD）测定采用抑制光化还原法;过氧化氢酶（CAT）测定采用高锰酸钾滴定法;过氧化物酶（POD）测定采用愈创木酚法;可溶性糖（SS）含量用蒽酮比色法测定;可溶性蛋白（SP）含量采用考马斯亮蓝法测定。
1.2.4 抗寒性综合评价 采用隶属函数法综合各项指标对枇杷材料进行抗寒性评价[16]。
1.3 数据处理
采用DPS 7.05软件对实验数据进行方差分析和差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 低温胁迫下枇杷幼果种胚的相对电导率变化与半致死温度
随处理温度的降低,各枇杷品种幼果种胚相对电导率REC呈现“小-大-小”的“S”型曲线变化（图1）,不同枇杷品种对低温胁迫的敏感性不同,当处理温度从3 ℃降到1 ℃时,WT、冠玉、宁海白相对电导率分别增加了4.7%、7.6%、12.5%,而红肉枇杷龙泉5号、早钟6号、大五星相对电导率分别增加了18.7%、28.1%、36.4%。当温度降至-3 ℃时,WT、冠玉、宁海白相对电导率分别为59.32%、67.32/%、70.21%,而龙泉 5号、早钟6号、大五星相对电导率均超过了80%,当处理温度为-5 ℃时,早钟6号、大五星相对电导率分别为88.39%、89.54%,显著高于其他4个品种,WT相对电导率最低,为65.21%,根据电导率大小与植物抗寒性的关系可知,WT的抗寒能力强,大五星的抗寒能力最弱。
Logistic方程拟合结果显示,6个枇杷品种种胚相对电导率与半致死温度LT50呈较强的线性关系,R2介于0.907~0.946之间,表明拟合结果较精确可靠,可作为枇杷抗寒性判定的重要指标（表1）。不同枇杷品种种胚的半致死温度介于-4.759~-2.73 ℃之间,其中,WT幼果种胚的半致死温度最低,抗寒能力强,大五星幼果种胚的半致死温度最高,抗寒能力弱。
表1 6个枇杷品种的Logistic方程及半致死温度Tab. 1 Logistic equation and the semi-lethal temperature of six loquat varieties |
| 品种 Variety | Logistic方程 Logistic equation | R2 | 半致死温度LT50 The median-lethal temperature/℃ |
|---|---|---|---|
| WT | y=92.312/(1+8.214e-0.431x) | 0.921 | -4.759 |
| 冠玉 | y=94.258/(1+9.325e-0.461x) | 0.946 | -4.02 |
| 宁海白 | y=89.775/(1+7.841e-0.495x) | 0.947 | -3.81 |
| 龙泉5号 | y=98.553/(1+6.964e-0.478x) | 0.934 | -2.98 |
| 早钟6号 | y=96.742/(1+9.119e-0.477x) | 0.911 | -2.91 |
| 大五星 | y=96.954/(1+6.665e-0.492x) | 0.907 | -2.73 |
2.2 低温胁迫下枇杷种胚的生理响应特征
低温胁迫下,6个枇杷丙二醛含量呈现出先升高后降低的倒“V”型变化趋势,但增幅和达到峰值的时间点不同（图2）,龙泉5号、早钟6号、大五星丙二醛含量在处理胁迫温度为-1 ℃时达到最大值,其中大五星丙二醛含量最高,达0.92 nmol/g,冠玉、宁海白在-3 ℃时达到最大值,而WT在处理温度为-5 ℃时达到最大值。在整个低温胁迫3 ℃降到-5 ℃时过程中,大五星丙二醛含量变幅最大,其次为早钟6号,WT丙二醛变幅最小。
6个枇杷品种低温胁迫下脯氨酸含量（图3）变化规律与MDA类似,低温处理初期,脯氨酸含量急剧上升,随着处理时间延长脯氨酸含量又逐渐降低。龙泉5号、早钟6号、大五星脯氨酸在-1 ℃时达到最大值,相比3 ℃时增幅分别为92%、60.7%、75%;冠玉、宁海白、WT脯氨酸在-3 ℃时达到最大值,相比3 ℃时其增幅分别为106.9%、91.6%、98.5%。WT脯氨酸含量在低温胁迫过程中始终处于较高水平且增幅较大。
随着处理温度的降低,6个枇杷品种的可溶性糖含量呈逐渐增加的趋势,均在-5 ℃时达到最大值,其中早钟6号和大五星的增幅相对较小,分别为88.3%和98.1%,而WT的可溶性蛋白增幅最大,达141.6%（图4）。可溶性蛋白含量与可溶性糖含量具有相似的变化规律（图5）,也是随着处理温度的降低呈上升的趋势,在低温胁迫初期（3 ℃）时,可溶性蛋白含量基数白肉品种冠玉、宁海白、WT显著高于红肉品种龙泉5号、早钟6号、大五星,在-5 ℃时达到最大值时,可溶性蛋白含量白肉品种冠玉、宁海白、WT分别较3 ℃时增加了132.5%、111.8%、101.1%、黄肉品种龙泉5号、早钟6号、大五星分别增加了139.3%、138.5%和166.7%。
图4 低温胁迫下6个枇杷种胚可溶性糖含量的变化Fig. 4 Dynamic changes of the contents of soluble sugar in vitro seed embryos of young fruits of six loquat varieties under cold stress |
2.3 抗寒性综合评价和聚类分析
采用隶属函数法对6个枇杷的5项生理指标进行抗寒性综合评价,结果表明（表2）,WT、宁海白、冠玉、早钟6号、龙泉5号及大五星的平均隶属度分别为0.759、0.556、0.592、0.434、0.474、0.407,平均隶属度综合反映了品种抗寒能力的大小,其值越大则表明抗寒性越强。因此,低温胁迫下6个枇杷品种的抗寒能力大小依次为WT>冠玉>宁海白>龙泉5号>早钟6号>大五星。
表2 6个枇杷材料抗寒性的综合评价值Tab. 2 Comprehensive evaluation on cold resistance of six loquat varieties |
| 指标 Indexes | WT White bud mutation | 宁海白 Ninghaibai | 冠玉 Guanyu | 早钟6号 Zaozhong No.6 | 龙泉5号 Longquan No.5 | 大五星 Dawuxing |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 相对电导率 | 0.763 | 0.641 | 0.698 | 0.611 | 0.604 | 0.521 |
| 可溶性糖含量 | 0.819 | 0.608 | 0.671 | 0.366 | 0.413 | 0.354 |
| 可溶性蛋白含量 | 0.731 | 0.539 | 0.581 | 0.287 | 0.429 | 0.302 |
| 丙二醛含量 | 0.626 | 0.439 | 0.447 | 0.417 | 0.403 | 0.389 |
| 脯氨酸含量 | 0.857 | 0.555 | 0.564 | 0.488 | 0.523 | 0.471 |
| 平均隶属度 | 0.759 | 0.556 | 0.592 | 0.434 | 0.474 | 0.407 |
| 抗寒能力排序 | 1 | 3 | 2 | 5 | 4 | 6 |
对6个枇杷的抗寒平均隶属函数值进行聚类分析（图6）,可将6个枇杷品种分为3类。第一类：WT,抗寒能力强;第二类：冠玉>宁海白,抗寒能力中等;第三类：龙泉5号>早钟6号>大五星,抗寒能力较弱。这与半致死温度LT50得出的结果基本一致。
3 讨论
植物膜系统是植物受低温伤害的原发部位,其稳定性对于植物抵御低温逆境具有重要意义。相对电导率的变化反应细胞膜透性的改变,因此常作为评定植物细胞膜损坏程度的重要参考指标[17]。前人研究表明,抗寒能力强的植物低温胁迫下植物膜系统稳定性较强,相对电导率较小,反之,植物膜系统稳定性较差,相对电导率较大[18]。本研究表明,随处理温度的降低,6个枇杷品种幼果种胚相对电导率REC呈现“小-大-小”的“S”型变化趋势,表明各枇杷品种随着低温胁迫的加剧,种胚细胞膜系统均受到不同程度的伤害。不同枇杷品种对低温胁迫的敏感性不同,当处理温度为-5 ℃时,大五星相对电导率最高,为89.54%,而WT相对电导率最低,为65.21%,根据电导率大小与植物抗寒性的关系可知,WT的抗寒能力最强,大五星的抗寒能力最弱,这与Logistic方程的拟合结果一致。
脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白是植物内重要的渗透调节物质[22,23],是植物抗寒性鉴定的重要生理指标[24]。本研究结果显示,6个枇杷材料的脯氨酸含量随低温胁迫均呈现出先升高后降低的倒“V”型变化趋势,LT50较低的WT脯氨酸含量在低温胁迫过程中始终处于较高水平且增幅较大,说明低温胁迫中脯氨酸积累越多,植物的抗寒能力越强,当低温加剧致使其酶系统损坏时,种胚中脯氨酸能力降低,脯氨酸含量下降。随着低温胁迫的加剧,6个枇杷材料种胚中可溶性糖及可溶性蛋白含量则呈现逐渐增加并趋于平稳的态势,这与针对柑橘[25]、葡萄[26]、火龙果[27]、草莓[28]等果树的研究结果一致。在整个胁迫过程中3种渗透调节物质变幅均较为明显,表明枇杷种胚中脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白对低温较为敏感,对枇杷抵御低温逆境具有重要的调节作用。
植物的抗寒性受生理生化特征遗传表现的综合作用,因此,单一抗寒指标难于判断植物对低温的综合适应能力[22],本研究采用隶属函数法对6个枇杷的5项生理指标进行抗寒性综合评价,表明6个枇杷品种的抗寒能力大小依次为WT>冠玉>宁海白>龙泉5号>早钟6号>大五星。该结果与单独运用半致死温度LT50评价枇杷的抗寒结果一致,表明半致死温度LT50结合隶属函数法的综合评价能较为准确鉴定枇杷品种的抗寒性。
4 结论
低温胁迫下,6个枇杷品种的生理响应存在显著的差异性,枇杷品种幼果种胚相对电导率REC呈现“小-大-小”的“S”型曲线变化;Pro含量、MDA含量随低温胁迫均呈现出先升高后降低的倒“V”型变化趋势;可溶性糖和可溶性蛋白含量呈逐渐增加的趋势。WT对低温的胁迫具有较强的适应性,抗寒能力强,半致死温度LT50结合隶属函数法的综合评价能准确鉴定枇杷品种的抗寒性,为枇杷抗寒种质的筛选及寻找提高抗寒性的新途径提供理论依据。