橡胶树[Hevea brasiliensis（Willd.ex A.Juss.）Muell. Arg]为大戟科（Euphobiaceae）三叶橡胶树属（Hevea）的多年生热带产胶乔木,其所产生的天然橡胶与石油、煤炭、钢铁并称世界四大工业原料[1]。中国的橡胶树种植区主要分布于海南、云南、广东、广西、福建等地区,其中海南和云南为主要植胶区。随着世界各国越来越重视环境,煤炭等不可再生资源大量消耗,对天然橡胶的需求将不断增加,天然橡胶产业发展前景广阔[2]。
斯里兰卡曾报道了侵染橡胶树的60多种病原菌[3]。由美国植物病理学会组织编撰的作物病虫害数据库[4]中记录的橡胶树病害有117种。危害橡胶生产的病害主要有叶部病害（如白粉病[5]和炭疽病[6]）、根病[7]（如红根病和褐根病）、茎干病害（如绯腐病[8]和割面条溃疡[9]）等。一些橡胶树叶斑病常造成胶树大量落叶,对橡胶树的危害较为严重。
笔者对海南省多个橡胶树种植地进行调查时,在海南省三亚市的吉阳镇胶园中发现一种危害橡胶树叶片的新病害,经初步鉴定后取名为橡胶树毛色二孢叶斑病。调查中发现,该病原菌主要为害胶树下层老化叶片,在6—10月高温、多雨的季节发生,6月开始发病,7—9月进入台风雨季后发病迅速,9月为发病高峰期,株发病率为32.64%。本研究对这一橡胶树新病害的病原菌结合形态学、分子生物学方法及柯赫法则进行种类鉴定,并对其病原菌进行了生物学特性初步研究,以期为进一步研究该病害的发生流行规律及防控提供理论支持和技术借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病样采集及接种苗木 于2017年9月从海南省三亚市吉阳镇橡胶园中的发病胶树上采集病叶,样品用保鲜袋包装后带回实验室备用。致病性测定所用橡胶树苗由海南大学热带农林学院提供的二年生7-33-97橡胶芽接幼树。
1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和查氏培养基（Czapek）,详细配方参阅《植病研究方法》[10]。
1.1.3 试剂及仪器 E.Z.N.A.®Fungal DNA Kit,OMEGA Extraction Kit,2×Taq-Mixture,DNA Marker。Olympus BX 51显微镜。
1.2 方法
1.2.1 橡胶树毛色二孢叶斑病病原菌分离与纯化 采用常规组织分离法,将发病叶片先用无菌水冲洗,再从发病初期叶片病健交界处切取3 mm× 3 mm的病斑组织,在75%酒精中浸泡8 s,再用1%的升汞溶液浸泡1 min,然后用无菌水漂洗3次,用灭菌后的镊子将其转移到PDA培养基上,封口,28 ℃恒温培养。待其产孢后采用单孢分离法用已灭菌的接种环从已长满菌丝的PDA平板里挑取少量带分生孢子的菌丝,置于1 mL灭菌水中混匀后梯度稀释成不同浓度的孢子悬浮液,涂布在PDA平板表面,28 ℃的恒温培养1 d后挑取单孢菌落进行纯化。分离菌株纯化后编号为HNSY003,转入斜面试管4 ℃冷藏保存备用[11]。
1.2.2 菌株的致病性测定 采取6株种植二年生的热研7-33-97健康橡胶树袋装苗,表面消毒后,采用针刺法接种,3株接HNSY003分离菌,3株接空白PDA培养基作对照。用灭菌手术刀在消毒的植株茎干表面削出3个间隔5 cm左右长约1 cm的平面伤口,用灭菌束针刺伤接种的叶片,将培养2 d的菌落上的菌丝块面朝下贴在伤口上,对照处接空白培养基,表面覆盖棉花后用灭菌水湿润保湿,每天观察发病情况,定期记录并拍照。
1.2.3 菌株鉴定 形态鉴定：将分离菌株移接在PDA培养基上,28 ℃培养2 d后,观察菌落形态和颜色,并挑取菌丝制片在光学显微镜下观察和测量病菌的分生孢子器和分生孢子并拍照。
分子鉴定：使用OMEGA Fungal DNA Kit来提取病原菌DNA。采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′）[12]扩增rDNA基因内转录间隔区以及特异性引物EF1-688F（5′-CGGTCACT TGATCTACAAGTGC-3′）/EF1-1251R（5′-CCTCG AACTCACCAGTACCG-3′）[13]扩增翻译延伸因子的部分序列。PCR扩增后对其产物进行电泳检测。使用OMEGA Extraction Kit试剂盒切胶回收目的片段,纯化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将获得的序列在NCBI上进行比对分析,并提交序列,然后对测序后的rDNA-ITS和EF1-α序列进行序列联配比较、编辑。利用 MEGA 6.0软件用邻接法（neighbor-joining,NJ）以Botryosphaeria dothidea为外群,构建系统发育树[14]。
1.2.4 橡胶树毛色二孢叶斑病病原菌的生物学特性测定 用直径5 mm的打孔器在培养2 d的菌落边缘打取菌饼,将其移接到不同种类的培养基平板中心进行培养。逐日定时定点用十字交叉法测量菌落直径。每组不同处理测定设置3个重复。除碳、氮源生物学测定外,其他条件所使用的培养基均为PDA培养基。
（1）温度：接菌后置于15、20、25、28、30、32、35、40 ℃共8个温度梯度下恒温黑暗培养。
（2）光照：采用15 W照明灯,测定条件设置为连续光照、完全黑暗、12 h光暗交替3种条件,28 ℃恒温培养。
（3）pH：在已灭菌的PDA培养基凝固之前,用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH将pH分别调至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11共10个梯度,28 ℃恒温培养。
（4）碳、氮源：分别称取等碳量的D-果糖、D-山梨醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、肌醇加入基础碳源培养基,称取等氮量的L-天冬酰胺、牛肉膏、酵母浸膏、大豆蛋白胨、硝酸铵、草酸铵、氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙加入基础氮源培养基中,将不加蔗糖、硝酸钠的Czapek培养基作为缺碳、缺氮空白对照。
1.3 数据处理
利用Excel 2010软件和SAS 9.1软件进行数据统计分析,采用Duncan’s multiple range test进行多组样本间差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 橡胶树毛色二孢叶斑病症状
2.2 致病性测定
用菌株HNSY003接种橡胶树叶片,针刺接种1 d后发病,3 d后发病部位失水褪绿变成灰白色（图2A）,7 d后病斑逐渐扩展成近圆形,边缘灰褐色至褐色,中间灰白色,外围具明显黄色晕圈,症状与田间发病植株症状一致（图2B）,对照均未发病。茎干接种3~14 d后,伤口接种分离菌的橡胶苗茎干被侵染变褐色并扩展,对照则无明显变化。菌丝块接种3 d后伤口变黑褐色并向周围扩展,病健交界处有褐色水渍状坏死带,上部叶片仍保持绿色,14 d后,接种病原菌的橡胶苗嫩茎病部组织变干,表面生出大量小黑点（分生孢子器）,上部叶片失水下垂,失绿并变黄（图2C,图2D,图2E）。采发病组织进行分离获得相同的菌株,表明分离菌为致病菌。
图2 橡胶树毛色二孢叶斑病的致病性测定A：叶片接种3 d后症状;B：叶片接种7 d后症状;C：茎干接种3 d后症状;D、E：茎干接种14 d后症状。 Fig. 2 Pathogenicity test of Lasiodiplodia leaf spot on rubber tree A: Symptoms after 3 days of leaf inoculation; B: Symptoms after 7 days of leaf inoculation; C: Symptoms after 3 days of stem inoculation; D, E: Symptoms after 14 days of stem inoculation. |
2.3 病原菌的形态鉴定
在PDA平板上培养的菌株HNSY003的菌落初期呈白色绒毛状,近圆形,边缘整齐,病原菌生长很快,28 ℃黑暗条件下培养2 d即可长满培养皿（d=90 mm）（图3A）,菌丝放射状生长,继而变墨绿色,菌丝致密,气生菌丝发达,后期逐渐变为黑色,气生菌丝极发达。低温处理后在PDA培养基上产生许多黑色颗粒状的分生孢子座,散生,球形或近球形,暗褐色,较厚。在发病的胶树叶片和橡胶嫩茎上产生分生孢子器（图3B,图3C）,常多个聚生,单室,球形或近球形,初埋生于寄主表皮下,成熟后突破表皮外露,器壁暗褐色,较厚,大小为163.9~227.53 μm× 105.98~209.4 μm（平均197.53 μm×184.75 μm）（图3D,图3E）。分生孢子有2种类型,椭圆形或卵圆形,壁厚;不成熟时呈无色透明状,单胞,成熟后变棕色至黑色,具有纵纹,厚壁,双胞;分生孢子大小为 21.5~31.85 μm×12.06~14.49 μm（平均26.63 μm×13.1 μm）（图3F,图3G）。根据该病原菌的菌落特征及显微形态特征,结合致病性测定,确定该病原菌为假可可球二孢菌[Lasiodiplodia pseudotheobromae A.J.L. Philips, A. Alves & Crous.][15,16,17,18],属半知菌类（Imperfect）、腔孢纲（Coelomycetes）、球壳孢目（Sphacropsidales）。其有性阶段未知。
图3 橡胶树毛色二孢叶斑病的形态A：PDA培养基上生长2 d的菌落;B：病叶上产生的分生孢子器;C：发病嫩茎上产生的分生孢子器;D：分生孢子器聚生;E：聚生的分生孢子器;F：单胞分生孢子;G：双胞分生孢子。 Fig. 3 The pathogen of Lasiodiplodia leaf spot on rubber tree A: Pathogen’s colony morphology on PDA medium (2 d); B: Pycnidia produced on diseased leaves; C: Pycnidia produced on the tender stems of the disease; D: Pycnidia aggregation; E: Agglomerated pycnidia; F: Timmature conidia; G: Mature conidia. |
2.4 橡胶树毛色二孢叶斑病病原菌的分子鉴定
经测序,病原菌 rDNA-ITS和EF1-α序列分别为503 bp（NCBI登录号为MH422961）,和523 bp（NCBI登录号为MH543322）,与NCBI登录号为KX244815.1、MH102237.1等假可可毛色二孢菌[Lasiodiplodia pseudotheobromae A.J.L. Philips, A. Alves & Crous]序列的相似度为100%。从GenBank中选取含模式菌株在内的相关菌株Lasiodiplodia pseudotheobromae、Lasiodiplodia theobromae、Lasiodiplodia parva等菌株的ITS及 EF1-α序列,使用2种序列联合建树,进行多重序列比较及系统发育学分析,结果显示,该病原菌的rDNA-ITS及EF1-α序列与假可可毛色二孢菌的同源性达100%,表明该病原菌HNSY003与假可可毛色二孢菌遗传距离最小,聚为一类（图4）。结合形态学特征观察及分子生物学技术鉴定结果,确定该病原菌为假可可毛色二孢菌[Lasiodiplodia pseudotheobromae A.J.L. Philips, A. Alves & Crous.]。
2.5 橡胶树毛色二孢叶斑病病菌的生物学特性
2.5.1 温度对菌落生长的影响 该菌菌落在15~ 40 ℃温度范围内均能生长,25~35 ℃适合该菌生长,最适生长温度为32 ℃,40 ℃时,该菌菌落生长速度下降明显,当温度45 ℃时停止生长,但病原菌未死亡,将其转移至适合的温度仍可继续生长（图5）。
2.5.2 光照对菌丝生长的影响 在连续光照、完全黑暗、12 h光暗交替3种光照条件下该菌均能生长,且3种处理下病原菌菌落生长势基本一致,由此可见,3种不同的光照条件对菌丝的生长几乎没有影响（图6）。
2.5.3 pH对菌丝生长的影响 橡胶树叶斑病病菌HNSY003在pH 3~11范围内均能生长,但是在不同的pH条件下培养2 d后,该菌的菌落直径不同,pH为5时菌落直径最大,且极显著高于其他处理,表明pH 5最适宜菌丝生长,pH 4~7与pH 8处理间菌落直径差异显著（图7）,表明橡胶树叶斑病病菌更适合在弱酸性至中性环境中生长。
2.5.4 碳、氮源对菌丝生长的影响 由表1可知,橡胶树毛色二孢叶斑病病菌HNSY003在供试的8种不同碳源培养基上均能正常生长,D-果糖为最适碳源,菌落直径最大,菌丝致密,白色绒毛状;其次为可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖和蔗糖,在肌醇和D-山梨醇中菌落直径最小,且在D-山梨醇中菌落稀薄,碳源的利用率低。表明橡胶树毛色二孢叶斑病病菌菌丝对不同的碳源利用率存在差异。
表1 碳源对菌丝生长的影响Tab. 1 Effect of different carbon sources on mycelia growth |
| 碳源Carbon source | 菌落直径Colony diameter/cm | 菌落特征Colony characteristics |
|---|---|---|
| D-果糖D-Fructose | 7.38±0.03aA | 菌落圆形,菌丝絮状,气生菌丝发达,致密 |
| 可溶性淀粉Soluble starch | 5.93±0.03bB | 菌落圆形,菌丝白色,较薄 |
| 葡萄糖Glucose | 5.62±0.03cC | 菌落圆形,菌丝絮状,致密 |
| 麦芽糖Maltcose | 5.57±0.08cC | 菌落圆形,菌丝絮状,稀薄 |
| 蔗糖Sucrose | 5.55±0.01cC | 菌落圆形,菌丝絮状,较密 |
| 肌醇Inositol | 5.05±0.10dD | 菌落圆形,丝絮状,白色,菌丝稀薄 |
| D-山梨醇D-Sorbitol | 4.83±0.03eE | 菌落圆形,菌丝絮状,乳白色,较薄 |
| 对照CK | 3.78±0.06fF | 菌落圆形,菌丝白色,稀薄 |
Note: Different capital letters mean extremely significant difference at 0.01 level; different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level. | |
注：不同大写字母表示0.01水平上差异极显著,不同小写字母表示0.05水平上差异显著。 |
由表2可知,橡胶树毛色二孢叶斑病病菌HNSY003在供试的12种不同氮源培养基上均可生长,单一氮源以硝酸铵为最适氮源,其菌落直径最大,菌丝致密长势优良,其次为硝酸钙。草酸铵为氮源的菌落利用率最低,直径最小。只有草酸铵和氯化铵为碳源时菌落直径小于对照。在缺氮的培养基中,菌丝稀薄。复合氮源中以酵母浸膏为最适氮源,菌落圆形,致密。表明病原菌对不同的氮源利用率存在差异。
表2 氮源对菌丝生长的影响Tab. 2 Effect of different nitrogen sources on mycelia growth |
| 氮源Nitrogen source | 菌落直径Colony diameter/cm | 菌落特征Colony characteristics |
|---|---|---|
| 酵母浸膏Yeast extract | 6.82±0.06aA | 菌落圆形,致密,菌丝絮状,气生菌丝发达 |
| 大豆蛋白胨Soya peptone | 6.12±0.06bB | 菌落圆形,致密,菌丝絮状,气生菌丝发达 |
| L-天冬酰胺L-Asparagine | 5.68±0.03cC | 菌落近圆形,菌丝絮状,气生菌丝发达,较密 |
| 牛肉浸膏Beef extract | 5.38±0.01dD | 菌落圆形,菌丝絮状,气生菌丝发达,较密 |
| 硝酸铵NH4NO3 | 5.27±0.03eE | 菌落近圆形,菌丝絮状,气生菌丝发达,较密 |
| 硝酸钙Ca(NO3)2 | 5.22±0.03fF | 菌落圆形,白色,致密 |
| 硝酸钾KNO3 | 5.18±0.03fF | 菌落圆形,米白色,气生菌丝发达 |
| 硫酸铵(NH4)2SO4 | 5.17±0.03fgFG | 菌落近圆形,白色,菌丝较密 |
| 硝酸钠NaNO3 | 5.07±0.03fgFG | 菌落近圆形,白色,菌丝稀疏 |
| 氯化铵NH4Cl | 5.02±0.03hH | 菌落近圆形,白色,菌丝稀疏 |
| 草酸铵(NH4)2C2O4 | 3.68±0.03iI | 菌落近圆形,白色,菌丝稀疏 |
| 对照CK | 5.07±0.03ghGH | 菌落圆形,菌丝稀薄,白色 |
Note: Different capital letters mean extremely significant difference at 0.01 level; different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level. | |
注：不同大写字母表示0.01水平上差异极显著,不同小写字母表示0.05水平上差异显著。 |
3 讨论
通过对海南省三亚市橡胶树种植区新发现的毛色二孢叶斑病病原菌的形态特征观察、致病性测定及分子鉴定,表明该病害是由假可可毛色二孢（Lasiodiplodia pseudotheobromae）侵染引起的,这是该病原菌所致橡胶树叶斑病的首次发现。该病原菌主要为害橡胶树老化叶片,严重时从下部老叶向上部扩展蔓延;人工接种可侵染橡胶树小苗茎干,导致橡胶树小苗整株叶片在短期内失绿发黄,迅速失水、萎蔫下垂,树皮干缩,最后整株彻底枯死。假可可毛色二孢是一种重要的植物病原菌,寄主范围广泛,包括中国的相思树、林生杧果、泡桐、南洋楹,泰国的橡胶树、依兰、莲雾、龙眼、桂花,乌拉圭的大桉,哥斯达黎加的马占相思,苏里南的酸橙,巴西的番木瓜,马达加斯加的榄仁树等多种植物的枝干和果实[19],引起溃疡病、枝枯病及果腐病等,造成巨大的经济损失。Trakunyingcharoen等[20]曾经报道假可可毛色二孢也能为害橡胶树的茎干和叶片,致使橡胶树整株叶片在短期内迅速失水、萎蔫下垂,大枝条和茎干继续失水,树皮干缩,最后整株彻底枯死。
假可可毛色二孢（L. pseudotheobromae）与可可毛色二孢（L. theobromae）都是重要的农业病原菌,两者的田间发病症状及形态结构相似不易区分,假可可毛色二孢曾为可可毛色二孢的隐含种[15,16],Alves等[19]认为该种应从可可毛色二孢中划分出来,成为一个新种。虽然2个种不易区分,但两者在分生孢子形态和分生孢子器的分布上存在差别。可可毛色二孢的成熟分生孢子的两端呈圆形,分生孢子器大多单生;而假可可毛色二孢的分生孢子稍长,顶端钝圆,向基部变尖,呈平截状,分手孢子器大多聚生,稍小。根据分子鉴定及构建系统发育树分析,两者分别聚在系统进化树的不同分支,能够明显区分开假可可毛色二孢与可可毛色二孢。目前,利用形态学性状及生理生化等宏观上的鉴定手段已经不能满足我们的需求,还需结合分子系统学等各方面的性状才能进行更精准的鉴定。
本研究发现,该病原菌菌丝生长适宜温度为25~35 ℃,32 ℃时最适该菌生长;pH为4~6适宜该菌生长,pH为5时最适菌丝生长;8种供试碳源培养基中,D-果糖为最适碳源,菌落直径最大,长势最好;12种不同氮源培养基中,单一氮源以硝酸铵为最适氮源,复合氮源中以酵母浸膏为最适氮源,菌落直径最大,圆形,致密,长势优良。调查中发现,该病原菌主要为害胶树下层老化叶片,在6—10月高温、多雨的季节发生,6月开始发病,7—9月进入台风雨季后发病迅速,9月为发病高峰期;该病原菌常与白粉病褐色坏死斑伴随侵染橡胶树,但白粉病菌不侵染老叶,其褐色坏死斑病斑不规则形,而毛色二孢叶斑病菌侵染老化叶后,发病初期产生带有黄色晕圈的黑褐色小病斑,易与白粉病病斑区分。研究发现病原菌易从叶片上的伤口侵入,对橡胶树存在潜在的危害性,在生产防治中应给予高度重视并加强监测和防控。