西番莲（Passiflora spp.）是西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（Passiflora）果树,原产于南美洲,约有530个种和400多个人工杂种,其中可食用的有80余种[1,2]。西番莲兼具食用和药用价值,具有重要的经济意义[3]。我国早在1901年就引种西番莲,目前在台湾、广东、海南、福建、贵州、广西、云南和四川等省区广泛种植[4]。近年来,西番莲种植面积迅速扩大,各省区之间引种、苗木销售活动频繁,一定程度上加速了各种病害的传播和蔓延[5]。病毒病害严重影响西番莲的产量和品质,是产业健康发展的主要限制因素之一[6]。
国内外已报道了26种侵染西番莲的病毒,包括马铃薯Y病毒属（Potyvirus）、菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）、香石竹潜隐病毒属（Carlavirus）、黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）、芜菁黄花叶病毒属（Tymovirus）、柑橘粗糙病毒属（Cilevirus）、烟草花叶病毒属（Tobamovirus）、线虫传多面体病毒属（Nepovirus）等[5]。我国主要有黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）、东亚西番莲病毒（East Asian Passiflora virus, EAPV）、西番莲斑驳病毒（Passion fruit mottle virus, PaMV）、广东番木瓜曲叶病毒（Papaya leaf curl Guangdong virus, PaLCuGdV）、大戟曲叶病毒（Euphorbia leaf curl virus, EuLCV）和夜来香花叶病毒（Telosma mosaic virus, TeMV）[6,7,8,9]。国内西番莲病毒病害主要发生在台湾、福建、海南和广东等省区[5],贵州暂未见西番莲病毒病相关报道。笔者通过田间调查发现贵州各个主产区均有疑似病毒病侵染的植株,部分果园尤为明显。鉴定侵染贵州西番莲病毒种类,对于病害防控具有重要意义。
目前已经报道的西番莲病毒鉴定方法主要有生物学检测、电子显微镜检测、血清学检测和分子生物学检测等[5]。这些方法在植物病毒鉴定方面均得以成功应用,却也存在一定的局限性。与逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）等传统分子生物学检测方法相比,小RNA测序技术（small RNA sequencing, sRNA-seq）不仅可以同时鉴定多种DNA或RNA病毒,还能发掘新病毒或新分离物,已被广泛应于各种植物病毒鉴定[10,11,12,13,14,15]。本研究应用小RNA测序技术分析了贵州省疑似病毒侵染的西番莲样本,结合RT-PCR验证了鉴定结果,克隆了病毒外壳蛋白（coat protein, CP）基因开放阅读框序列,并对所鉴定病毒的不同分离物进行了系统发育分析,为贵州西番莲病毒病的防控奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
2017年10月—2018年7月在贵州贞丰、镇宁、望谟、罗甸、平塘和从江采集疑似病毒侵染的西番莲叶片6份,其中采自平塘的西番莲品种为‘平塘1号’,其他样本均为‘紫香1号’,样品信息见表1。以健康西番莲植株作为阴性对照。
表1 贵州西番莲疑似病毒病样本信息Tab. 1 The suspected virus infection samples of P. edulis in Guizhou |
| 品种 Cultivar | 样品编号 Sample name | 采集地点 Source | 田间症状 Symptoms |
|---|---|---|---|
| ‘紫香1号’ | ZF | 贞丰县鲁容乡 | 褪绿、皱缩、矮化 |
| ‘紫香1号’ | ZN | 镇宁县良田镇 | 斑驳、皱缩、曲叶、矮化 |
| ‘紫香1号’ | WM | 望谟县郊纳镇 | 褪绿、皱缩 |
| ‘紫香1号’ | LD | 罗甸县逢亭镇 | 褪绿、皱缩、矮化 |
| ‘平塘1号’ | PT | 平塘县克度镇 | 斑驳、皱缩 |
| ‘紫香1号’ | CJ | 从江县下江镇 | 斑驳、皱缩、曲叶 |
1.2 方法
1.2.1 西番莲总RNA提取 采用TRIzol试剂（Invitrogen,美国）提取6份疑似病毒侵染叶片混合样品的总RNA,具体方法参照试剂说明书。应用Nanodrop 2000检测总RNA的浓度和纯度,Agilent 2100测定RIN值。选取RIN值≥8.0、OD260/280≥1.8、浓度≥50 ng/μL的RNA用于测序文库构建。
1.2.2 西番莲sRNA 测序 应用Small RNA Sample Pre Kit （Illumina,美国）构建文库,使用Qubit 2.0进行初步定量,稀释文库至1 ng/μL,然后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测。库检合格后,用HiSeq2000进行高通量测序,测序单端读长为50 nt。sRNA测序委托北京百迈克生物科技有限公司完成。
1.2.3 sRNA的拼接和注释 去除原始数据中的低质量序列,保留长度为18~35 nt的序列。应用Velvet 1.2软件对高质量的sRNAs进行拼接,获得一系列contigs。将上述contigs在NCBI数据库中进行BLASTn和BLASTx比对,得到可能存在的病毒序列并进行分类和注释,确定样本中可能存在的病毒种类。
1.2.4 病毒RT-PCR验证 根据拼接得到的病毒核酸序列设计CMV和TeMV的特异引物（表2）,用于RT-PCR检测。分别以6份疑似病毒侵染的西番莲叶片总RNA为模板,合成cDNA第一链,逆转录反应体系为：总RNA 2 μg,5×M-MLV buffer 4 μL,M-MLV反转录酶（Promega,美国）40 U,10 μmol/μL随机六聚体引物2 μL,10 mmol/L dNTPs 2 μL,RNA酶抑制剂20 U,以无RNA酶的去离子水补充体积至25 μL。反应程序为：37 ℃孵育1 h,70 ℃灭活10 min后备用。以cDNA为模板进行PCR扩增,反应体系25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL、10 mmol/L的dNTPs 2 μL、2.5 μmol/L的上下游引物各1 μL,Taq DNA聚合酶1 U,cDNA 2 μL,去离子水补充体积至25 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,复性30 s（退火温度见表1）,72 ℃延伸90 s,35次循环,最后72 ℃延伸10 min。PCR产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,纯化、克隆并测序。TA克隆及阳性克隆筛选方法参照pGM-T连接克隆试剂盒 （天根生化科技有限公司,北京）,随机选择5个阳性克隆送上海生工测序。获得的序列应用DNAMAN 8进行比对分析。
表2 用于RT-PCR的引物信息Tab. 2 Primer pairs for RT-PCR and ORF cloning |
| 引物名称 Primer name | 引物序列 Sequence (5′-3′) | 退火温度 Tm/℃ | PCR产物大小 Amplification length/bp | 引物用途 Primer type |
|---|---|---|---|---|
| CMV-F1 | CCGCTCCGCTTCCTCCTC | 62.7 | ||
| CMV-R1 | TTGAATACACGAGCACGGCG | 62.0 | 506 | CMV检测 |
| TeMV-F1 | ATGCAGGCAACACAGGCAAAG | 62.3 | ||
| TeMV-R1 | GTCCATCATCACCCACACGC | 61.4 | 398 | TeMV检测 |
| CMV-F2 | ATGGACAAATCCGAATCAACC | 60.0 | ||
| CMV-R2 | TCAAACTGGGAGCACACCA | 58.0 | 657 | CP基因克隆 |
| TeMV-F2 | TCAAGTAAGGTGGATGATGT | 56.0 | ||
| TeMV-R2 | CTGCACAGAACCTACCCCA | 58.0 | 816 | CP基因克隆 |
1.2.5 病毒CP基因克隆及系统发育分析 根据拼接得到的病毒核酸序列设计CMV和TeMV的CP基因开放阅读框（open reading frame, ORF）扩增引物（表2）,用于CP基因克隆。PCR扩增、产物克隆测序方法参照1.2.4。在NCBI数据库中检索已经报道的侵染西番莲的CMV以及侵染西番莲等植物的TeMV的CP基因序列,应用MEGA 7.0对两种病毒不同分离物进行系统发育分析。采用ClustalW进行多序列比对,设置自展值为1000,以Neighbor Joining法构建系统进化树。
2 结果与分析
2.1 西番莲sRNA测序结果分析
经检测,西番莲总RNA浓度为422 ng/μL,OD260/280为8.4,总量为9.7 μg,完全符合sRNA测序要求。sRNA测序获得28 964 784个reads,除去接头和低质序列后得到了25 994 547个clean reads,占reads总数的89.76%。sRNA长度为18~35 nt,其中长度为21 nt的数量最多,高达117 303个,其次是22 nt（92 920个）、20 nt （60 100个）和19 nt（38 724个）,25~35 nt的sRNA较少,总和为27 940个（图1）。
2.2 sRNA序列的拼接与注释
应用Velvet软件对所得到sRNA进行拼接,得到长度大于30 nt的contig共2194个。contig序列在NCBI数据库中的BLAST比对结果显示,183个contig可以比对到2种病毒序列,其中69个contig可比对到CMV序列,同源性为90%~ 100%;114个contig可以比对到TeMV序列,同源性为65%~93%。以CMV和TeMV基因组序列为参照,将所有contig组装成4段核酸序列,其中3段序列与CMV的RNA1、RNA2和RNA3全长的覆盖率分别为85.6%、86.1%和72.5%;1段序列与TeMV基因组的覆盖率为63.3%（表3）。sRNA序列分析结果表明,6份混合样本中可能存在CMV和TeMV。
表3 拼接序列与已报道病毒序列一致性及覆盖率分析Tab. 3 BLAST analysis of contigs with reference from NCBI |
| 病毒名称 Virus name | 参考序 列长度 Reference length/bp | 匹配序列长度 Consensus length/bp | Contig数量 Contig count/个 | 覆盖率 Rate/% |
|---|---|---|---|---|
| CMV isolate DS segment | 3 360 | 2 875 | 20 | 85.6 |
| RNA1-KU255787 mapping | ||||
| CMV isolate ZMBJ segment | 3 054 | 2 629 | 16 | 86.1 |
| RNA2-KT350981 mapping | ||||
| CMV isolate DS segment | 2 220 | 1 610 | 33 | 72.5 |
| RNA3-KU255789 mapping | ||||
| TeMV isolate Hanio complete | 9 689 | 6 130 | 114 | 63.3 |
| genome DQ851493 mapping |
2.3 RT-PCR分析
为验证sRNA注释结果的可靠性,根据拼接序列设计了CMV和TeMV的特异性引物,分别对6份样本进行RT-PCR检测。结果显示,所有样品均扩增到2种病毒的核酸片段,大小分别为506 bp和398 bp,与预期大小一致（图2）。
将PCR产物测序发现：6个样本的CMV扩增产物序列完全一致,该序列与侵染香蕉（Musa nana）的CMV分离物HS-5（KT302188）的CP基因序列一致性为98%,将侵染贵州西番莲的CMV命名为CMV-GZ;样本PT的TeMV扩增产物序列与广西分离物GX1（KJ789129）的CP基因序列一致性最高为99%,将该侵染贵州西番莲的TeMV命名为TeMV-GZ1;样本ZF、ZN、WM、LD和CJ的TeMV扩增产物得到2种核酸序列,其中一种与样本PT的扩增序列完全一致,另一种与GX1的CP基因序列一致性为94%,将此分离物命名为TeMV-GZ2。以上结果说明RT-PCR检测结果准确可靠,与sRNA拼接及注释结果一致。样本ZF、ZN、WM、LD和CJ中含有TeMV-GZ1和TeMV-GZ2 2种分离物。
2.4 病毒系统发育分析
PCR扩增侵染贵州西番莲的CMV和TeMV的CP基因ORF序列,产物大小分别为657 bp和816 bp（图3）。
将PCR扩增产物克隆测序后,分别在NCBI数据库进行BLAST分析。其中CMV-GZ（MH623077）的CP基因ORF及其氨基酸序列与侵染胡椒（Piper nigrum）的CMV分离物FT （KU255786）的一致性分别为97.1%和100%,与其他侵染西番莲的分离物CP基因全序列或部分序列的一致性为82.3%~95.9%,与相应氨基酸序列的一致性为97.3%~98.6%（表4）;TeMV-GZ1（MH623078）与TeMV-GZ2（MH623079）的CP基因ORF及其氨基酸序列一致性分别为96.5%和96.7%,两者与其他TeMV分离物的CP基因全序列或部分序列的一致性分别为87.8%~ 99.3%和87.8%~98.3%,与相应氨基酸序列的一致性为88.3%~98.2%和88.3%~96.7%（表5）。
表4 CMV-GZ与其他分离物的CP基因核苷酸序列及氨基酸序列一致性Tab. 4 Nucleotide and amino acid sequence identities of CP gene between GZ and other CMV isolates |
| GenBank 编号 GenBank number | 分离物 Isolate | 寄主植物 Host | 国家 Country | 一致性 Identity/% | |
|---|---|---|---|---|---|
| 核苷酸Nucleotide/nt | 氨基酸Amino acid/aa | ||||
| KU255786 | FT | Piper nigrum | 中国 | 97.1 | 100 |
| KX470408 | Pichilingue 1 | Passiflora edulis | 厄瓜多尔 | 95.9 | — |
| KX470410 | Pichilingue 3 | Passiflora edulis | 厄瓜多尔 | 95.9 | — |
| KR535607 | KoPF | Passiflora edulis | 韩国 | 95.6 | 97.3 |
| AF418576 | — | Passiflora edulis | 巴西 | 95.6 | — |
| AF418577 | — | Passiflora edulis | 巴西 | 95.6 | — |
| MF140363 | xm-pf1 | Passiflora edulis | 中国 | 95.2 | 98.2 |
| KX470409 | Pichilingue 2 | Passiflora edulis | 厄瓜多尔 | 95.2 | — |
| AF418575 | — | Passiflora edulis | 巴西 | 95.2 | — |
| AF368192 | Pf | Passiflora edulis | 中国 | 95.2 | 98.6 |
| AF418574 | — | Passiflora edulis | 巴西 | 94.8 | — |
| FN257306 | PAE1 | Passiflora edulis | 意大利 | 82.3 | — |
Note: — indicates that the identity is unknown. | |
注： —表示一致性未知。 |
表5 TeMV-GZ1和GZ2与其他分离物的CP基因核苷酸序列及氨基酸序列一致性Tab. 5 Nucleotide and amino acid sequence identities of CP gene between GZ1, GZ2 and other TeMV isolates |
| GenBank 编号 GenBank number | 分离物 Isolate | 寄主植物 Host | 国家 Country | 一致性 Identity/% | |
|---|---|---|---|---|---|
| 核苷酸Nucleotide/nt | 氨基酸Amino acid/aa | ||||
| KJ789129 | GX1 | Passiflora edulis | 中国 | 99.3/98.3 | 98.2/96.7 |
| AB699341 | Garut 2 | Pogostemon cablin | 印度尼西亚 | 92.8 | —/— |
| AB699338 | Garut 1 | Pogostemon cablin | 印度尼西亚 | 92.6 | —/— |
| AB699131 | Ciamis 1 | Pogostemon cablin | 印度尼西亚 | 92.3 | —/— |
| AB699342 | Ciamis 2 | Pogostemon cablin | 印度尼西亚 | 92.3 | —/— |
| AM409187 | Pangda 12 | Passiflora edulis | 泰国 | 92.3 | 88.3/88.3 |
| AM409188 | Pangda 15 | Passiflora edulis | 泰国 | 92.3 | 93.4/93.4 |
| AB699130 | Pasaman 2 | Pogostemon cablin | 印度尼西亚 | 92.1 | —/— |
| AB699343 | Bogor 2 | Pogostemon cablin | 印度尼西亚 | 91.6 | —/— |
| DQ851493 | Hanoi | Telosma cablin | 越南 | 91.3 | 88.6/89.3 |
| AB699340 | Manoko 1 | Pogostemon cablin | 印度尼西亚 | 90.7 | —/— |
| AB699130 | Pasaman | Pogostemon cablin | 印度尼西亚 | 87.8 | —/— |
Note: — indicates that the identity is unknown. | |
注：—表示一致性未知。 |
为进一步明确CMV-GZ、TeMV-GZ1和TeMV-GZ2与已经报道的CMV和TeMV分离物的进化关系,分别以花生矮缩病毒（Peanut stunt virus, PSV, KM823528）和大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus, SMV, FJ548849）为外组,基于CP基因序列构建了系统进化树。侵染西番莲的CMV分离物分成2支,其中CMV-GZ（MH623077）与巴西的4个分离物（AF418574, AF418575, AF418576, AF418577）、韩国分离物CMV-KoPF（KR535607）、中国福建分离物CMV-xm-pf1（MF140363）、中国海南分离物CMV-Pf （AF368192）、厄瓜多尔的3个分离物（CMV-Pichilingue 1: KX470408, CMV-Pichilingue; 2: KX470409, CMV-Pichilingue; 3: KX470410）聚集于同一个大的分支,而意大利分离物CMV-PAE1（FN257306）则单独一支（图4）。
来自不同国家和地区的14个TeMV分离物分成两个类群（图5）,来自印度尼西亚的8个分离物和来自越南的1个分离物以较高的后验概率聚为一支,本研究获得的TeMV-GZ1（MH623078）、TeMV-GZ2（MH623079）分离物与广西分离物GX1（KJ789129）、泰国分离物Pangda12（AM409187）和Pangda15（AM409188）组成第2大类群,其中分离物GZ1与中国广西分离物GX1以较高的后验概率（PP=100%）先聚为一个分支,而后与分离物GZ2和泰国分离物Pangda12和Pangda15进一步相聚成簇（图5）。相同地区或寄主来源的分离物优先相聚成簇,表现出较强的地理和寄主特异性。
3 讨论
本研究应用小RNA测序技术,从6个疑似病毒侵染样品的混合cDNA文库中检测到CMV和TeMV两种病毒,进一步应用RT-PCR进行了验证。CMV是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员。紫果西番莲（Passiflora edulis）被CMV侵染后,嫩叶上有明显黄点或黄斑,顶部新抽出嫩叶卷曲;老叶有褪绿及黄化现象。病株矮化,花、果明显减少。黄果西番莲（Passiflora edulis f. flavicarpa）受侵染也呈典型花叶,老叶上有黄化斑点,但病株无明显矮化现象[16]。TeMV是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus,PVY）成员之一,侵染西番莲引起花叶、叶片皱褶和畸形[17]。这两种病毒侵染西番莲在贵州省均为首次报道。
按照国际病毒分类委员会关于马铃薯Y病毒的划分标准,即CP基因氨基酸序列一致性低于80%;CP基因或整个基因组的核苷酸序列一致性低于76%[18]。本研究测定的TeMV-GZ1和TeMV-GZ2分离物CP基因氨基酸、核苷酸序列与已报道的TeMV分离物一致性最高分别为99.3%、98.3%和98.2%、96.7%,高于80%、76%标准,与马铃薯Y病毒的划分标准相符。因此,TeMV-GZ1和TeMV-GZ2是TeMV的两个分离物。CMV-GZ的CP基因序列与已报道的其他分离物的一致性为82.3%~95.9%,介于张璇等[19]报道的77.1%~100.0%之间,由此可以确定CMV-GZ是CMV的一个分离物。根据寄主范围、致病性、血清性分析和CP核酸序列分析等,CMV株系或分离物可分为亚组I、亚组II[20]以及两者的重组型[21],其中亚组I进一步分为亚组IA和亚组IB。CMV-GZ的CP基因及其氨基酸序列与侵染胡椒的CMV分离物FT（KU255786）CP基因的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为97.1%和100%,CMV-GZ可能与FT同属于亚组IB[22]。RT-PCR验证结果表明,6份样品中均存在两种病毒,且样品ZF、ZN、WM、LD和CJ同时含有TeMV-GZ1和TeMV-GZ2分离物。
综合文献报道和NCBI数据库中登录的病毒序列信息来看,侵染西番莲的CMV主要分布于澳大利亚、美国、南非、巴西、厄瓜多尔、意大利、中国和韩国[5, 16, 23],系统进化分析结果显示,意大利分离物单独聚为一支,巴西、厄瓜多尔、中国和韩国分离物聚为一支。侵染西番莲的TeMV仅在泰国和中国有报道,而TeMV的其他自然寄主植物广藿香（Pogostemon cablin）和夜来香（Telosma cordata）主要分布于越南、印度尼西亚等南亚国家。侵染西番莲的CMV分布更为广泛,遍布全球西番莲主产区;TeMV可能源于南亚地区,通过引种或其他途径传播到中国。系统发育分析结果显示,西番莲TeMV的贵州分离物TeMV-GZ1、TeMV-GZ2与广西分离物GX1的遗传距离最小,其次是泰国分离物Pangda12和Pangda15。相同地区或寄主来源的分离物优先相聚成簇,表现出较强的地理和寄主特异性,这与谢丽雪等[6]的研究结果较为一致,该病毒的适应性进化可能同时受地域和寄主植物驱动。