三明野生黄精（Polygonatum cyrtonema Hua）为百合科（Liliaceae）黄精属（Polygonatum Mill.）多年生药用草本植物,集药用、食用、美容和观赏价值于一身,具有广阔的开发利用前景[1]。黄精根状茎主要含多糖[2]、黄酮、蒽醌、甾体皂苷[3]、木脂素等化合物及多种对人体有用的氨基酸等多种物质,性平、味甘,为滋补上品,具有滋阴润燥、降血脂、降血糖、降血压、提高人体免疫力、补中益气、平补气血的作用和功效[4,5,6,7,8]。但由于黄精生长周期长,种子繁殖需要5 a以上,根状茎繁殖也至少需要3 a,传统的无性繁育技术不仅使黄精优良性状难以保存,而且繁殖效率较低,极大地限制了黄精的规模化扩繁。近年来随着人们对黄精的需求量与日俱增,野生资源已远远不能满足生产的需要,工厂化生产势在必行[9]。植物组织培养技术不仅可以很好地保存黄精的优良性状,而且还可以消除季节等外在因素的影响,从而在可控的环境下显著提高增殖系数。因此,建立高效的无菌培养体系是目前黄精快速繁殖的重要途径。
1 材料与方法
1.1 材料
取三明地区野生黄精根状茎为外植体,选表面浅黄色至黄褐色、生活力较强的地下根状茎为外植体。消毒试剂为多菌灵溶液、次氯酸钠和氯化汞。
1.2 方法
1.2.1 外植体预处理 取放晴3 d以上春季3—4月的三明野生黄精,野生黄精根状茎去除须根,选色泽鲜黄,生活力较强的地下根状茎为外植体。采用表1中的3种方法进行外植体预处理。
表1 外植体预处理方法Tab. 1 Pretreatments to explants |
| 处理 Treatment | 处理方法 Pretreatmengts |
|---|---|
| 1 | 野生黄精根状茎去除须根,用软毛牙刷在清水下洗去野生黄精根状茎表面的泥土,再采用3%多菌灵浸泡3 d,期间时常震荡摇晃,在清水下用软毛牙刷清洗根状茎表面残留的多菌灵,盛放于瓷杯中,获得正式消毒前的外植体。 |
| 2 | 将根状茎用软毛牙刷在清水下洗去野生黄精根状茎表面的泥土后,不加多菌灵表面预消毒,晾干3 d,获得消毒前外植体备用。 |
| 3 | 将根状茎用软毛牙刷在清水下洗去野生黄精根状茎表面的泥土,先用洗衣粉在自来水下开到最大,冲洗16 h,再用3%多菌灵浸泡2 d,期间时常震荡摇晃,在清水下用软毛牙刷清洗根状茎表面残留的多菌灵,在滤纸上晾放5 h后进行外植体消毒。 |
1.2.2 外植体消毒 选择1.2.1中最佳外植体预处理方法处理野生黄精根状茎后,分别使用以下2种方法对外植体进行消毒：（1）先用酒精（75%）消毒30 s,再使用氯化汞（0.2%）浸泡消毒（10、15、20 min）,消毒后的野生黄精根状茎用无菌水冲洗3~4次;（2）先用酒精（75%）消毒30 s、再使用次氯酸钠（2%）浸泡消毒（20、30、40 min）,消毒后再用无菌水冲洗3~4次。每个处理3组,每组20瓶,每瓶接1个外植体,接种后15 d统计外植体污染率、褐化率和出芽率。
将预消毒处理后获得的野生黄精外植体分装于瓷杯中,置于经紫外消毒的超净工作台上,先用无菌水清洗3次,根据根状茎节间大小切成小块;再使用75%酒精浸泡30 s;然后使用0.2% HgCl2浸泡15 min,同时滴一滴吐温20;最后使用无菌水清洗4~5遍至干净;将消毒好的根状茎置于滤纸上,晾干;接种于MS培养基（MS+6-BA 4 mg/L +NAA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂,pH 5.8）,每个处理3组,每组20瓶。
1.2.3 培养条件 外植体消毒后接种于经高压（121 ℃/20 min）灭菌的MS培养基中,培养温度为(25±2)℃,12 h/d光照培养,光照强度为22~ 25 μmol/(m2•s),培养15 d后统计污染率、褐化率及成活率。
1.2.4 取材时间对野生黄精不定芽诱导的影响 分别在3—4月和11—12月对三明野生黄精进行取材,接种于表2中的2号培养基中,比较不同季节取材对外植体不定芽诱导的影响,每瓶接入一个外植体,每个处理3组,每组20瓶,15 d后统计污染率和出芽率。
表2 不定芽诱导培养基Tab. 2 Adventitious bud induction media |
| 培养基序号 Medium number | 6-BA浓度 6-BA concentration/(mg·L-1) | 培养基 Medium type |
|---|---|---|
| 1 | 2.0 | MS+NAA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+7g/L琼脂,pH 5.8 |
| 2 | 4.0 | |
| 3 | 6.0 | |
| 4 | 10.0 |
1.2.5 三明野生黄精不定芽诱导 三明野生黄精不定芽诱导培养基为：采用1.2.1和1.2.2中对比实验后的最佳处理组合筛选出来的无污染健康的外植体接入到MS+NAA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂的固体培养基（pH为5.8）,同时添加不同浓度（2.0、4.0、6.0、10.0 mg/L）的6-BA（6-苄氨基嘌呤）（表2）,接种15 d后观察根状茎的存活情况与出芽情况。每瓶接种1块根状茎,每个处理3组,每组20瓶。
污染率=污染的外植体数/接种的外植体数× 100%
褐化率=褐化的外植体数/接种的外植体数× 100%
成活率=成活的外植体数/接种的外植体数× 100%
出芽率=发芽的外植体数/接种的外植体数× 100%
1.3 数据统计
采用Excel 2003软件进行数据统计、图表制作及相关分析。
2 结果与分析
2.1 外植体预处理对无菌体系建立的影响
由表3可知,外植体污染率的大小为2>1>3,污染率分别为89.1%、53.8%、34.6%。由实验结果可知,未经多菌灵溶液浸泡的外植体（处理2）的污染率高达89.1%,说明多菌灵溶液对于野生黄精外植体的消毒效果有明显影响,加入多菌灵溶液浸泡后的外植体污染率远远低于未加多菌灵浸泡的。此外,外植体的污染率与洗衣粉水冲洗植株的时间也有关联,未经过洗衣粉水冲洗而直接浸泡在多菌灵中的外植体的污染率比经过洗衣粉水的冲洗后再浸泡于多菌灵溶液中高出19.2%,这可能是因为野生黄精根状茎生长于泥土中,表面带有大量微生物,将其置于洗衣粉水下冲洗一定的时长,洗衣粉水也具有一定的杀菌能力,再采用一定浓度的酒精和氯化汞消毒外植体,便可以有效的降低污染率。
表3 外植体预处理方法对污染率的影响Tab. 3 Effect of different pretreatment on contamination rates of explants |
| 处理 Treatment | 外植体数 Explant number | 污染率 Contamination rate/% |
|---|---|---|
| 1 | 60 | 53.8 |
| 2 | 60 | 89.1 |
| 3 | 60 | 34.6 |
2.2 乙醇与次氯酸钠不同时间配合处理对外植体的影响
为研究次氯酸钠对野生黄精外植体消毒效果的影响,本实验使用2%的次氯酸钠对外植体进行消毒。实验结果表明,2%次氯酸钠处理不同时间后,野生黄精外植体均大量污染,污染率高达89.7%,褐化率高达47.1%（表4）。且大部分为细菌污染,有部分块茎甚至腐烂。因此,采用2%次氯酸钠消毒的方法显然不适合于野生黄精外植体的消毒灭菌,不利于野生黄精无菌体系的建立。
表4 乙醇与次氯酸钠不同时间配合处理对外植体的影响Tab. 4 Effects of alcohol and sodium hypochlorite on different time handling of explants |
| 处理 Treatment | 消毒时间 Disinfection time | 污染率 Contamination rate/% | 褐化率 Browning rate/% | |
|---|---|---|---|---|
| 75%乙醇 75% alcohol | 2%次氯酸钠 2% Sodium hypochlorite | |||
| 1 | 30 s | 20 min | 89.7 | 35.3 |
| 2 | 30 s | 30 min | 85.2 | 39.4 |
| 3 | 30 s | 40 min | 79.9 | 47.1 |
2.3 乙醇与氯化汞不同时间配合处理对外植体的影响
由表5可知,乙醇与氯化汞结合进行消毒对外植体污染有一定的控制作用,野生黄精的根状茎的污染率随着消毒液浸泡时间的增加而降低,且消毒灭菌时间为15 min时污染率与褐死率之和最低,成活率最高。但使用氯化汞消毒液浸泡时间为20、25 min时,其污染率继续下降,但褐化率均明显升高,推测长时间的氯化汞消毒处理在杀死微生物的同时对外植体也产生了毒害作用。因此,采用处理1的75%乙醇30 s+0.2%氯化汞处理时间15 min,较适宜野生黄精外植体的灭菌消毒。
表5 乙醇与氯化汞不同时间配合处理对外植体的影响Tab.5 Effects of alcohol and mercuric chloride on different time handling of explants |
| 处理 Treatment | 消毒时间 Disinfection time | 污染率 Contamination rate/% | 褐化率 Browning rate/% | |
|---|---|---|---|---|
| 75%乙醇 75% alcohol | 0.2%氯化汞 0.2% mercuric chloride | |||
| 1 | 30 s | 15 min | 20.2 | 38.6 |
| 2 | 30 s | 20 min | 19.3 | 47.0 |
| 3 | 30 s | 25 min | 14.0 | 67.2 |
2.4 不同取材时间对不定芽诱导的影响
表6 不同取材时间对不定芽诱导的影响Tab. 6 Effects of different time on induction of adventitious buds |
| 取材时间 Time of sampling | 外植体个数 Explants number | 污染率 Contamination rate/% | 出芽率 Germination rate/% |
|---|---|---|---|
| 3-4月 | 60 | 4.5 | 65.8 |
| 11-12月 | 60 | 43.2 | 0.0 |
2.5 不同培养基对不定芽诱导的影响
3 讨论
3.1 外植体预处理及消毒方法的筛选有利于三明野生黄精无菌体系建立
野生黄精根状茎长期生长于泥土当中,根茎表面通常附着很多微生物,因此对于野生黄精根状茎的彻底消毒是野生黄精无菌体系建立至关重要的一步。目前还未有文献探讨过关于野生黄精根状茎作为外植体预处理的消毒方法对外植体消毒情况的影响,所以本研究采用3种不同方法对三明野生黄精根状茎进行外植体的预处理消毒,发现野生黄精根状茎离开土壤后,用软毛牙刷在清水下洗去野生黄精根状茎表面的泥土,在加洗衣粉的自来水中冲洗16 h,再用3%多菌灵浸泡2 d,是外植体预处理的最佳方法,外植体污染率仅为34.6%。外植体在消毒剂（0.2%氯化汞或者2.0%次氯酸钠溶液）中浸泡时间的长短对野生黄精的根状茎的褐化率、污染率呈一定的规律性：三明野生黄精根状茎的的褐化率随着消毒剂浸泡时间的增加而増加,而污染率随着消毒剂浸泡时间的増加而降低。
徐忠传等[16]、鲍锦库[19]研究了多花黄精根状茎的灭菌方法,但未说明灭菌效果,刘红美等[14]采用了75%的酒精充分擦洗根茎表面,再使用2.5%次氯酸钠灭菌3次、每次5 min的多次短时灭菌法消毒效果较好,但并未说明消毒灭菌后的污染率等具体的情况。周新华等[10]采用了75%的酒精表面灭菌30 s,再用0.1%的氯化汞深层灭菌10 min,灭菌效果较好,外植体材料无菌保存率可达73.2%。戚华沙等[20]对蓝药睡莲的根状茎以不同浓度的次氯酸钠和氯化汞配合使用对其进行灭菌消毒,结果表明0.1% HgCl2 20 min+5.0% NaClO 5 min是蓝药睡莲根状茎较适宜的消毒方法。宁慧等[21]对与黄精同属百合科的玉竹的外植体进行了相似的外植体预处理及消毒（75%乙醇消毒15~20 s+0.2%氯化汞消毒9~11 min）,发现乙醇和氯化汞配合使用对于地下根茎的消毒效果较好。本实验通过使用0.2%氯化汞对野生黄精外植体进行不同时间的消毒灭菌后,结果表明,选择75%酒精处理30 s,0.2%氯化汞溶液消毒15 min是野生黄精最合适的消毒方式。
本研究使用2%次氯酸钠对野生黄精外植体进行不同时间的消毒灭菌后,结果发现2%的次氯酸钠对野生黄精的外植体消毒效果不是很明显,与刘红美等[14]对多花黄精所消毒后的结果相差较大,推测可能是由于品种的差异或者取材时间不同引起的消毒效果的差异。此外,本研究采用相同浓度的氯化汞对野生黄精外植体进行处理,发现随着处理时间的延长,外植体的污染率不断下降,但褐化程度越来越严重,且氯化汞处理25 min污染率最低,褐化率却最高,推测氯化汞在灭杀微生物的同时对野生黄精外植体也产生一定的毒害,氯化汞处理的时间越长对外植体损伤越严重,无菌外植体就越脆弱。因此,本研究认为75%酒精处理30 s,0.2%氯化汞浸泡15 min处理外植体是比较适宜的,其外植体的存活率和出芽率均较高。用次氯酸钠消毒灭菌处理比氯化汞处理的污染率和褐化率明显高很多,说明利用氯化汞消毒灭菌的方法更适宜。而通过提高次氯酸钠的浓度对野生黄精外植体进行消毒灭菌,是否能提高其消毒效果,有待进一步研究。
3.2 一定浓度的6-BA能促进三明野生黄精不定芽的诱导
植物组织离体培养过程中,外植体不定芽的诱导不仅仅和植物生长调节剂的种类和浓度有关,还和植物品种、外植体生长环境、取材时间等因素的不同有关。在黄精组织离体培养过程中,细胞分裂素和生长素对不定芽的诱导起着至关重要作用,而6-BA具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点,因此被广泛采用,是植物组织培养中最常见的细胞分裂素[22]。6-BA能诱导不定芽的产生,促进侧芽生长,促进细胞分裂,大多数材料都可以在细胞分裂素和生长素配合使用的情况下诱导形成不定芽。此外,研究表明不同植物生长调节剂组合诱导多花黄精的效果不同[23,24,25],本研究采用MS培养基,通过添加固定浓度的NAA浓度,同时单一改变6-BA浓度来研究诱导野生黄精不定芽的产生,发现当6-BA浓度为2.0~ 10.0 mg/L时均能诱导出不定芽。而前人还采用其他种类的激素来对黄精的不定芽进行诱导,如李莺等[26]从黄精的愈伤组织中也能诱导出不定芽,且在培养基MS +6-BA 3.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L中诱导率最高;刘红美等[14]在MS培养基中添加0.2 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L 6-BA诱导出不定芽,且与本研究6-BA的浓度相同;牟小翎等[27]对泰山野生黄精进行了不定芽的诱导,结果为MS+6-BA 4.0 mg/L,说明6-BA浓度为4.0 mg/L是较适宜黄精诱导出不定芽的,且单一使用细胞分裂素也可能诱导出不定芽,这可能与植物体本身含有的内源激素有关;李莺等[28]诱导鸡头黄精丛生芽激素组合是MS+6-BA 4.0 mg/L+IAA 0.5mg/L,增殖倍数达2.40;孙俊威等[29]在MS培养基中添加ZT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L诱多花黄精根状茎不定芽效果最好,诱导率为87.9%。此外,徐忠传等[16]都是使用了MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L诱导出黄精的不定芽,这与本研究的结果一致。
后续我们还将深入进行野生黄精不定芽增殖、生根壮苗最适培养基筛选等研究,以完善野生黄精不定芽再生途径组织离体培养体系。