唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）是中国传统中药的重要组成,丹参味苦,微寒,有活血祛瘀、痛经止痛、清心除烦、凉血消痈的功效,主要用于胸痹心痛、脘腹胁痛,心烦不眠、痛经闭经、疮疡肿痛等的治疗[1]。丹参是我国传统医药中应用极为广泛的中药之一,在活血化瘀药方面有着公认的独特疗效,临床上主要用于治疗冠心病、心绞痛、缺血性中风等疾病[1]。近年来,以青蒿素研制获得科学界最高奖项诺贝尔奖为标志,随着欧美国家对中国传统中医药的认可度的逐步提高,以及大量丹参复方制剂的成分确定,中国药典丹参质量标准与欧盟、美国药典比较接近,丹参在国际、国内市场上的需求量越来越大[2]。野生丹参品种资源开发受限,丹参人工栽培后,各品种间的生物学性状及生产力、抗病性、商品产量特性等分化明显,生态适应性、植株特征、花粉粒、染色体、同功酶和品质特性均有显著差别[3],丹参新品种培育已经得到较快发展[4]。
远缘杂交和多倍体化是植物遗传改良的主要方法。人工栽培丹参的新品种培育过程中,运用这些技术手段,创造特异的新品种,是丹参新品种培育的重要途径。丹参一般依靠营养繁殖,尤其以茎段扦插、分根为主,有些丹参不能进行有性繁殖[4]。这些特点为丹参远缘杂交带来一定困难。多倍化是高等植物进化的重要力量,通过染色体加倍,基因重组,带来新的变异,形成新的物种。研究表明,约有15%的被子植物在其物种形成过程中经历了多倍化[5],超过70%的有花植物是多倍体[6]。多倍体植株具有营养器官体积大,营养成分增多,抗逆性强等特点[7],尤其在以收获根茎叶营养器官为目的的中草药种植中具有重要意义。
陈力等[8]采用未成熟的二倍体丹参种子,生长在1/2 MS+100 mg/L秋水仙碱的培养基中处理后,诱导四倍体并鉴定,再将四倍体丹参与二倍体丹参正、反交（4x♀×2x♂或2x♀×4x♂）,结实率都很高,收获种子播种后获得三倍体。染色体倍性鉴定结果显示,丹参染色体基数x为8,二倍体（2n=2x=16）、三倍体（2n=3x=24）、四倍体（2n=4x=32）。田间观察发现,三倍体丹参地上部分（茎、叶）均比二倍体丹参对照增加1~1.5倍,地下部分（芦头、根）比二倍体丹参增加2倍以上。进一步分析结果显示,三倍体丹参在侧根数目明显增加,三倍体丹参主要活性成分测定显示,样品中的丹参酮IIA、丹酚酸B、丹参酮I、隐丹参酮等的含量均超过《中国药典》规定的水平。
三倍体（3x）是倍数最低的多倍体,一般是由四倍体（4x）与二倍体（2x）杂交产生的,具有多倍体和杂交种产生的双重优势,在药用植物中具有巨大的生产潜力。从理论上讲,三倍体高度不育[8],只能依靠无性繁殖继代。然而,生产实践中发现大多数三倍体具有部分可育性,其育性机制不清。本研究以丹参三倍体为材料,通过解剖学、细胞遗传学的方法,分析了育性相关的细胞学特点,为阐明三倍体育性的机制提供实验依据,在丹参远缘杂交和多倍体育种生产实践中具有一定的实用价值。
1 材料与方法
1.1 材料
丹参三倍体材料由南开大学生命科学学院陈力教授馈赠,植物材料为三倍体组培苗,经炼苗后移栽至天津农学院试验田,常规大田管理,由于是组培苗移栽,在生长季植株陆续开花。
1.2 方法
1.2.1 细胞学压片 丹参三倍体花蕾生长早期,根据花蕾生长的长短不同进行取材,经卡诺氏固定液固定24 h后转入70%乙醇溶液中,4 ℃条件下保存备用。采用常规压片法进行减数分裂染色体压片,选取未成熟的花药（长度在1~3 mm之间）,用自来水浸泡、清洗20 min以上,然后用2.5%纤维素酶和2.5%果胶酶的混合酶液（2:1）在28 ℃对材料酶解30 min,水洗后用1 mol/L HCl 60 ℃水解10 min,自来水冲洗3次,浸泡20 min,卡宝品红染色10 min。Olympus BX53显微镜镜检,Spot Idea CCD相机拍照。
1.2.2 石蜡切片制作和解剖结构观察 以丹参三倍体不同发育时期的花药为试材,用常规石蜡制片法将固定好的材料,分别进行石蜡包埋、制片,显微结构观察。梯度乙醇脱水,二甲苯透明,爱氏苏木精整染,Leica RM2265切片机切片,切片厚度8~10 μm,Leica DM 4000B显微镜镜检,观察丹参三倍体不同发育时期的花药解剖结构,Leica DFC450 C相机拍照。
1.2.3 花粉显微观察和萌发试验 参考张志良等[9]的方法;取即将开放的花朵,用镊子夹出花药使之铺展在硫酸纸上阴干,待花粉自然散出后收集备用。离体萌发法采用培养基为0.1 g/L硼酸+10%蔗糖+0.5%琼脂,倒入适量培养基于载玻片中央,待其稍凝固后用玻璃棒蘸取少量花粉均匀地抖落在上面,再放入湿培养皿中,保鲜膜封皿后置于恒温培养箱中培养,培养温度为(25±2)℃,培养8 h后统计数据。所有处理均重复3次,每个重复选择10个视野计数。Leica DM 4000B显微镜镜检,Leica DFC450 C相机拍照。
2 结果与分析
2.1 丹参三倍体植株及花器形态正常
为了解三倍体丹参植株的生长状况,本研究对栽培丹参三倍体植株进行了生长发育观测。丹参三倍体植株生长健壮,从侧根繁殖开始,营养生长期约3个月,植株茎叶繁茂,长势旺盛,株高可达80 cm,进入生殖生长后,植株正常开花,轮伞花序具多朵花,密集组成长及15 cm的顶生总状花序,花冠蓝紫色,唇形,2枚雄蕊形态正常,未出现失水、干瘪等萎缩现象（图1）,说明三倍体植株经营养生长后,能够适时开花,雄蕊2枚正常状,另外2枚退化不显著;雌蕊2心皮,形态表现正常,但不收缩而分裂为4枚裂片。我们观察了丹参二倍体的植株和花器官形态,与三倍体比较,无明显差异。
2.2 丹参三倍体花粉母细胞减数分裂异常
图2 丹参三倍体花粉母细胞减数分裂染色体行为A：终变期染色体构型2III+6II+6I,箭头示二价体,*示单价体,#示三价体;B：落后染色体;C：染色体不均等分向两极;D：染色体桥。 Fig. 2 Chromosome behavior during meiosis of triploid Salvia miltiorrhiza A: Trivalent, two valent and univalent, arrows indicate bivalent, *indicate monovalent, # indicate trivalent; B: Lagging chromosome; C: Asymmetrical separation; D: Chromosome bridges. |
2.3 丹参三倍体花粉母细胞减数分裂结果产生多分体异常
2.4 丹参三倍体花药切片显示花粉粒形态异常
花粉母细胞减数分裂产生四分体,再发育形成单核花粉粒,进而形成2或3细胞成熟花粉粒。石蜡切片结果显示,丹参三倍体成熟花药中花粉粒的形态结构产生变异,与正常发育花药中的花粉粒形态比较,这些花粉粒中的一部分呈椭圆形、边缘规整,而另外一部分则形状不规则,边缘凹陷,产生畸形,呈败育状态（图4）。统计结果显示,约54.5%的花粉粒为畸形花粉粒,约占花粉粒总数的一半。
2.5 丹参三倍体花粉萌发率极低
鉴于丹参三倍体花粉粒部分形态畸变,我们进行了花粉萌发试验。由于无法区分在上述石蜡切片中观察到的畸形花粉粒和正常形状花粉粒,我们采集正常形状的花药,对其中的花粉粒进行了萌发试验。试验结果表明,丹参三倍体的花粉粒基本不萌发,极个别从萌发孔产生萌发迹象,但并不长出花粉管,其长度过小,无测量意义（图5）。我们的花粉萌发试验没有区分出畸形花粉粒,但结果是所有花粉粒均不萌发。
3 讨论
由于在减数分裂过程中配子染色体数目不平衡,三倍体是高度不育的。但也有例外,如风信子、马铃薯、苹果、草莓百合、玉米、番茄、还阳参等[12]。此外,百合三倍体虽为雄性不育,但可以作为母本与二倍体和四倍体杂交,产生后代[13]。可见,三倍体的育性具有一定的物种特性,其机理仍不清楚。减数分裂过程紊乱是人们公认的三倍体不育的主要原因,但减数分裂的过程和结果会产生不同的染色体和细胞行为表现类型。我们的结果表明,丹参三倍体在减数分裂过程中产生了多种异常染色体和细胞行为表现,如出现落后染色体、染色体不均等分向两极、染色体桥等,减数分裂结果产生三分体、微核等。这些结果与已有的其他三倍体减数分裂观察相似[14,15]。试验结果还表明,丹参三倍体花粉粒形态异常,产生畸变,且其萌发率极低。以此推断,丹参三倍体在生长发育过程中,由于减数分裂过程中染色体数目不平衡,在减数分裂过程中产生各种畸变、异常的染色体和细胞的行为表现,是造成其不育的主要原因。此外,通过观察、检测、分析可见,丹参三倍体雄配子产生过程中,存在各个发育环节的异常,从减数分裂过程到减数分裂结果,从花粉粒形态到花粉萌发,这些异常表现导致了雄性不育,由于雄性不育,丹参三倍体无法进行有性生殖,只能通过营养繁殖来繁衍后代。在生产实践中可以通过根系分枝来进行营养繁殖,同时保留三倍体的营养生长特性。
三倍体是由四倍体和二倍体杂交获得的,在多倍化和杂交过程中,整合了两个倍性不同的基因组,会由于三倍体阻遏（triploid block）而导致杂交种子不能正常发育或产生无活力的种子[16]。本研究表明丹参三倍体植株生长正常,但由于其花粉母细胞减数分裂中产生落后染色体、染色体不均等分向两极、染色体桥、三分体、微核等异常情况,使得部分花粉粒形状不规则,边缘凹陷,产生畸形,进而败育,这是丹参三倍体不育的主要因素,但丹参三倍体减数分裂过程中基因表达的遗传调控机制仍不清楚,需要进一步证实。