8-羟基喹啉铜（oxine-copper,简称为喹啉铜）是黄瓜上常用的一种广谱、高效、低毒的有机铜螯合物杀菌剂,喷施后在植物表面形成药膜,释放杀菌的铜离子,可有效抑制病菌的萌发和侵入,对梨、苹果、黄瓜、西瓜和番茄等作物真菌和细菌性病害起到预防和治疗作用[1,2]。喹啉铜的使用虽然可以减少农业病虫害,但过量使用会造成农药残留,通过食物被人体吸收,铜在人体内达到一定浓度时可形成羟基自由基的催化剂,造成人体DNA的损伤,诱发癌细胞的生成[3],世界卫生组织国际癌症研究机构将喹啉铜归为第三类致癌物质[4]。因此建立准确快速的喹啉铜残留检测方法,是评价蔬菜水果中喹啉铜残留风险和监管农产品市场的必要手段。喹啉铜的传统测定方法有氧化-还原滴定法[2],该方法是通过目测颜色变化确定终点,准确度不高,需要大量人力及分析时间,不适于大批量样品的检测。喹啉铜主要检测方法有气相色谱法,姚杰等[5,6]采用气相色谱法测定苹果中喹啉铜的残留量,该方法需要将喹啉铜进行化学衍生反应,通过检测生成的8-羟基喹啉含量计算喹啉铜含量,前处理操作复杂耗时。高效液相色谱法测定喹啉铜残留量有相关报道[7,8,9,10,11],肖浩等[12]和周梦春等[13,14]采用高效液相色谱测定稻田、番茄、黄瓜和土壤样品中喹啉铜残留量,以液液萃取的净化方法进行提取,正相和反相两次萃取之后旋转蒸发浓缩,净化操作繁琐。针对这一点,本研究优化了提取和净化方法,采用乙腈加少量盐酸进行提取,减少了提取剂用量和提取时间;用分散固相萃取替代液液萃取净化的方法,操作简单、净化效率高;同时采用十二烷基硫酸钠离子对磷酸盐缓冲液流动相体系,能使喹啉铜与杂质更好地分离,从而建立了黄瓜中喹啉铜残留量简单、快速、准确的分析测定方法。
1 材料与方法
1.1 材料
Waters e2695高效液相色谱仪和2489紫外检测器,美国沃特世公司;Milli-Q Advantage A10超纯水系统,德国默克密理博公司;CR22N落地式高速冷冻离心机,日本日立公司;AL204电子天平,上海梅特勒•托利多仪器有限公司;KQ-500DE数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;UMV-2多管旋涡混合器,北京优晟联合科技有限公司。
98.2%喹啉铜标准品,德国Dr Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈（色谱纯）,赛默飞世尔科技有限公司;二甲基甲酰胺和85%磷酸（分析纯）,广州化学试剂厂;磷酸二氢钠（分析纯）,汕头市光华化学厂有限公司;十二烷基硫酸钠（分析纯）,Farco Chemical Supplies;盐酸（优级纯）,广州化学试剂厂;多壁碳纳米管（MWCNTs）和C18填料,上海安谱实验科技股份有限公司;PSA填料,深圳蓝色海贝公司;实验用水均为一级水。
1.2 方法
1.2.1 标准曲线的绘制 称取5 mg喹啉铜,以二甲基甲酰胺超声溶解并定容至100 mL,得到50 µg/mL的喹啉铜标准储备液,用乙腈稀释至0.01、0.05、0.1、0.5、1.5 µg/mL 5个浓度;以喹啉铜的浓度为横坐标,对应的色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。
1.2.2 样品的提取与净化 称取10 g黄瓜样品于50 mL塑料离心管,加入14 mL乙腈和1 mL 0.1 mol/L的盐酸,涡旋10 min,加入10 g氯化钠,涡旋1 min,以8000 r/min离心5 min。
称取50 mg C18填料于15 mL塑料离心管,加入上述上清液5 mL,涡旋1 min,以8000 r/min离心5 min,上清液待上机测定。
1.2.3 高效液相色谱检测条件 紫外检测器（UVD）;SunFireC18色谱柱（4.6×150 mm,5 µm）;进样量10 µL,柱温25 ℃,十二烷基硫酸钠磷酸盐缓冲液为2.5 mmol/L磷酸二氢钠+1.25 mmol/L十二烷基硫酸钠溶液,用磷酸调pH至3.0;流动相为十二烷基硫酸钠磷酸盐缓冲液和乙腈（65∶35）体系,流速0.6 mL/min,检测波长250 nm。在此条件下,喹啉铜的保留时间为6~8 min。
1.3 数据处理
以标准系列溶液进样,待测农药的浓度（µg/mL）为横坐标,峰面积为纵坐标制作标准曲线,确定线性范围,根据标准曲线方程计算相关系数,证明在实验条件范围内仪器响应与进样浓度呈线性关系。以保留时间进行定性分析,以外标法进行定量分析。
2 结果与分析
2.1 方法的线性关系、灵敏度、准确度和精密度
在上述条件下以喹啉铜质量浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标,在0.01~1.5 µg/mL范围内的线性关系为y=221 000x-3 700,r2=0.998。通过在黄瓜空白样品添加喹啉铜0.02、0.2、2 mg/kg 3个浓度、每个浓度5个平行的加标回收实验,加标回收率和相对标准偏差（RSD）结果见表1,色谱图见图1。结果表明,喹啉铜不同添加浓度的回收率在92.3%~107.7%,相对标准偏差在2.0%~7.7%,用添加法测定喹啉铜的最低含量,得出黄瓜中喹啉铜的检出限（LOD）为0.08 mg/ kg,最大残留限量（MRL）为2 mg/kg,因此该方法的灵敏度、准确度和精密度均符合农药残留分析要求。
表1 喹啉铜的加标回收率和精密度Tab. 1 Recovery and precisions of oxine-copper spiked in samples |
| 添加浓度 Spiked level/(mg∙kg-1) | 回收率 Recovery/% | 平均回收率 Average recovery/% | 相对标准偏差RSD/% | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0.02 | 107.7 | 92.3 | 107.7 | 100.0 | 92.3 | 100.0 | 7.7 |
| 0.2 | 95.5 | 96.2 | 92.5 | 92.5 | 92.5 | 93.8 | 2.0 |
| 2 | 92.9 | 99.8 | 100.6 | 101.1 | 97.7 | 98.4 | 3.4 |
2.2 提取条件的优化
喹啉铜不溶于多数有机溶剂,微溶于稀酸、吡啶等,在水中溶解度也很小,仅为0.0001%。因此本方法采取在乙腈中加入酸的方式对黄瓜中喹啉铜进行提取率的实验,结果见图2。从图2可以看出,用乙腈提取的黄瓜空白样品,在目标物保留时间处有杂峰干扰,而用盐酸乙腈溶液提取的无杂峰干扰,说明加入一定浓度的盐酸可去除部分杂质,从而提高了准确度。同时考察了乙腈中加入不同浓度盐酸对回收率的影响,结果见图3。当样品中喹啉铜添加水平为0.1 mg/kg,浓度较高时,直接用乙腈和乙腈加入0.1 mol/L盐酸提取没有太大的差别,回收率均为94.5%,乙腈加入0.5 mol/L和2 mol/L盐酸提取,回收率偏低,分别为45.0%和39.0%;当样品中喹啉铜添加水平为0.02 mg/ kg,浓度较低时,直接用乙腈提取,回收率偏高,为135.4%,在乙腈中加入0.1 mol/L盐酸提取,回收率为92.3%,加入0.5和2 mol/L盐酸提取,回收率偏低,分别为69.2%和38.5%（图3）。这可能是由于杂峰面积小,喹啉铜浓度高时其影响不大,但浓度低时影响较大;而盐酸添加浓度过高,不仅会影响喹啉铜的提取,进入仪器之后还会造成C18柱和仪器损伤,影响其使用寿命。从结果可知,加入适量的酸会提高回收率,有去除部分杂质的作用,但盐酸浓度过高可能引起喹啉铜降解,从而使回收率降低,因此选择乙腈加入0.1 mol/L盐酸作为提取剂。
图2 不同提取方式下的黄瓜空白样品色谱图喹啉铜保留时间为6~8 min;A：乙腈加入0.1 mol/L盐酸提取;B：直接用乙腈提取。 Fig. 2 Chromatogram of blank cucumber sample with different extraction The retaintion time of oxine-copper was 6-8 min; A: Extracted by acetonitrile and hydrochloric acid (0.1 mol/L);B: Extracted by acetonitrile. |
本研究考察了不同体积的乙腈-0.1 mol/L盐酸（14∶1,V/V）溶液进行提取,用量分别为15、30和60 mL。结果表明,3个处理的回收率分别为99.5%、103.0%和92.5%,符合农药残留分析要求,考虑到提取剂用量越大,上机液浓度越小,杂峰的影响越大,其结果的灵敏度也越低,并且试剂消耗大,因此选择15 mL提取剂进行提取。
2.3 流动相的优化
本研究考察了乙腈-水、乙腈-磷酸盐缓冲液、乙腈-十二烷基硫酸钠磷酸盐缓冲液3个不同体系的流动相,色谱图见图4。乙腈-水流动相体系中喹啉铜响应很小,乙腈-磷酸盐缓冲液流动相体系中喹啉铜保留时间在2 min左右,无法与黄瓜基质中的杂峰分开。
图4 不同流动相体系下喹啉铜标准溶液（1 µg/mL）色谱图A：乙腈-水;B：乙腈-磷酸盐缓冲液;C：乙腈-0.625 mmol/L十二烷基硫酸钠酸盐缓冲液;D：乙腈-1.25 mmol/L十二烷基硫酸钠酸盐缓冲液。 Fig. 4 Chromatogram of oxine-copper standard (1 µg/mL) with different mobile phase A: Acetonitrile and water; B: PBS-acetonitrile; C: PBS and SDS (0.625 mmol/L)-acetonitrile; D: PBS and SDS (1.25 mmol/L)-acetonitrile. |
乙腈-十二烷基硫酸钠磷酸盐缓冲液体系中分离效果好,响应高,其主要原因是十二烷基硫酸钠为离子对试剂,加入到流动相后与喹啉铜生成不带电荷的中性离子,增加喹啉铜与固定相的作用,使分配系数增加,喹啉铜的保留时间由此前的2 min延长为7 min左右,从而达到更好的分离效果。但是十二烷基硫酸钠对C18柱有一定程度的损伤,影响其使用寿命,浓度越高,损伤越大。本研究同时考察了pH为3时2.5、1.25、0.625 mmol/L 3个浓度的十二烷基硫酸钠磷酸盐缓冲液流动相,以期得到喹啉铜峰形较好,十二烷基硫酸钠浓度较低的流动相。结果表明,十二烷基硫酸钠浓度为2.5 mmol/L时,流动相易产生乳白色沉淀,难以抽滤;浓度为0.625 mmol/L时,喹啉铜出峰较早,保留时间为4 min左右,受杂峰干扰;浓度为1.25 mmol/L时,喹啉铜峰形较好,响应较高,周围无杂峰干扰,因此选择1.25 mmol/L十二烷基硫酸钠磷酸盐缓冲液流动相体系。
2.4 净化条件的选择
本研究比较了多壁碳纳米管、C18和PSA填料净化对回收率的影响,结果见图5。多壁碳纳米管具有较高比表面积和较强的物理吸附能力[15],有利于色素类和极性物质的去除。多壁炭纳米管不同用量下的回收率表明,多壁碳纳米管用量超过10 mg时,回收率低于70.0%,达不到农药残留分析要求。C18填料是一种硅胶基质吸附剂,通过疏水作用吸附非极性和弱极性化合物。C18填料不同用量下的回收率表明：C18填料用量50 mg时回收率为100.4%,用量100 mg时回收率为97.0%,当用量超过300 mg时,回收率低于70.0%,达不到农药残留分析要求。PSA填料为乙二胺基-N-丙基硅烷,极性比C18填料强,对中等极性的多种化合物具有较好的吸附能力。PSA填料不同用量下的回收率表明：PSA填料用量对回收率的影响不明显,均在95.9%~102.2%之间。从净化效果来说,多壁碳纳米管用量超过10 mg,色素去除较为干净,上机液澄清,C18和PSA填料用量增加,上机液颜色变化不大;从色谱图来看,50 mg C18填料净化后杂峰更少,因此选择50 mg C18填料进行净化。
3 讨论
本研究以分散固相萃取-高效液相色谱法进行分析,快速、简单、准确度高,目前喹啉铜尚无检测方法标准,据文献报道,喹啉铜分析方法现在主要有气相色谱法[5,6]和高效液相色谱法,气相色谱法需要将喹啉铜衍生化为8-羟基喹啉,前处理操作繁琐,易引起目标物的损耗。液相方法无需衍生,其方法准确度更高,王志新等[5]用气相色谱法检测了苹果中喹啉铜,其回收率在79.8%~98.3%之间,本方法回收率在92.3%~ 107.7%之间。同时我们对提取和净化方法进行了优化,目前喹啉铜的提取方法有超声、振荡和匀浆,王志新等[5]用30 mL提取剂振荡60 min提取,肖浩等[12]用80 mL提取剂超声30 min提取,提取剂用量大,提取时间长,本研究以15 mL盐酸乙腈溶液涡旋10 min提取,节省了提取剂用量和提取时间。本研究采用分散固相萃取法进行净化,相比现有的固相萃取法[7]和液液萃取法[10]净化,前处理操作简单,节省人力和时间。在色谱分离方面,肖浩、周梦春等人用高效液相色谱法[12,13,14]测定水稻、土壤、番茄和黄瓜中喹啉铜,均采用5 mmol/L十二烷基硫酸钠磷酸盐缓冲液流动相体系,本方法采用1.25 mmol/L的十二烷基硫酸钠磷酸盐缓冲液流动相体系,十二烷基硫酸钠浓度低,分离效果好,并且对C18柱及色谱系统的损伤更小。通过回收率试验证明,本方法精密度和准确度高、检出限低、结果重现性好,回收率和相对标准偏差均达到农药残留分析要求,可用于大批量黄瓜样品中喹啉铜残留的分析检测。