枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是我国农业部公布允许使用的15种微生态制剂菌种之一,已经越来越多的被研制成微生物制剂[1,2,3],应用于饲料主要有以下几方面的作用：保持肠道菌群正常化;抑菌、杀菌作用;抑制肠毒素;防止产生有害物质-氨和胺;免疫刺激作用等。其制剂是无毒、无污染的环保产品,具有广阔的发展前景,已经广泛应用于畜牧、水产养殖业、饲料行业,显示出巨大的经济、社会效益和生态效益[4,5,6]。已有一些芽孢杆菌液体发酵条件优化的相关研究,如枯草芽孢杆菌[7]、解淀粉芽孢杆菌[8]、纳豆芽孢杆菌[9]等,但针对枯草芽孢杆菌应用于饲用微生物菌剂方面进行发酵条件优化的研究还较少。
实验室培养枯草芽孢杆菌大多选用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏等价格偏高的原料作为培养基配方,不适于工业化大规模生产。本文以实验室前期分离鉴定的枯草芽孢杆菌CS27作为出发菌株研制饲用的微生物菌剂,以降低发酵生产成本为目的,采用单因素试验和正交试验方法,对CS27菌株的液体培养基和工艺条件进行优化,确定最佳培养基配方和发酵条件,为更高层次的发酵水平及生产应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验菌株 枯草芽孢杆菌CS27由福建省农业科学院土壤肥料研究所分离保存,中国科学院微生物研究所鉴定。
1.1.2 试验试剂 蛋白胨、七水合硫酸镁、氯化钠、牛肉膏、碳酸钙、氯化铵、柠檬酸钠,均为分析纯,购自上海国药集团。黄豆粉和糖蜜由福建省华龙饲料有限公司提供。
1.1.3 试验仪器 SKY-200B型恒温培养振荡器,上海苏坤实业有限公司;SW-CJ-1FD型无菌超净工作台,苏州净化设备有限公司。
1.1.4 培养基 平板计数培养基[10]：1.0%蛋白胨,0.5%氯化钠,2.0%琼脂,0.3%牛肉膏, pH 7.0。种子培养基：蛋白胨5 g,牛肉膏10 g,氯化钠5 g,pH 7.0。基础培养基：1%黄豆粉,1%糖蜜,pH 7.0。
1.2 方法
1.2.1 种子液的制备 活化枯草芽孢杆菌株,斜面刮取二环接入50 mL液体种子培养基,在37 ℃、180 r/min条件下摇瓶培养12 h,制备种子液。
1.2.2 发酵菌数测定 取1 mL发酵液加入到9 mL无菌水中,依次做10倍梯度稀释,选取两个适当的梯度稀释倍数,吸取0.1 mL涂平板,每个梯度3次重复。置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h,选取30~300的培养皿计菌落数[10]。
1.2.3 单因素试验 （1）碳源。以1%大豆蛋白胨为氮源,分别添加1%糖蜜、葡萄糖、蔗糖、玉米粉、玉米淀粉、麦芽糖为碳源,CK为不加任何碳源的1%大豆蛋白胨（CK1）。按10%的接种量,将种子液接入装有50 mL培养基的250 mL的三角瓶中,摇床震荡培养（温度37 ℃、转速180 r/min）24 h后,稀释涂布测活菌数（下同）,检测碳源对CS27生长的影响。
（2）有机氮源。保持1%最佳碳源不变,分别用1%的牛肉膏、大豆蛋白胨、豆粕、蛋白胨、黄豆粉、酵母粉, CK为1%糖蜜（CK2）。按照上述条件接种培养后检测细胞生物量,测定有机氮源对CS27生长的影响。
（3）无机氮源。向基础培养基中分别添加0.5%的硝酸钾、硫酸铵、脲、硝酸铵、草酸铵,CK为1%黄豆粉、1%糖蜜（CK3）。按照上述条件接种培养后检测细胞生物量,测定无机氮源对CS27生长的影响。
（4）无机盐。向基础培养基（1%的糖蜜、1%黄豆粉）中分别添加0.1%的磷酸二氢钾、七水合硫酸亚铁、氯化钙、七水合硫酸锌、磷酸氢二钾、柠檬酸钠、碳酸钙、七水合硫酸镁,CK为不加无机盐的1%的糖蜜、1%黄豆粉。按照上述条件接种培养后检测细胞生物量,测定无机盐对CS27生长的影响。
（5）最佳浓度试验。将确定好的碳源、有机氮源、无机氮源、无机盐分别按照一定的浓度梯度进行试验,其他成分不变。按照上述条件接种培养后检测细胞生物量,确定CS27生长的最佳浓度。
1.2.4 正交试验 选择合适的碳源、氮源,在最佳浓度基础上,采用L9(33)正交表,3因素3水平安排试验,按照上述条件接种培养后测定细胞生物量,确定最佳碳源和氮源组合。在最佳碳源、氮源和无机盐浓度基础上,采用L9(34)正交表,4因素3水平,按照上述条件接种培养后测定细胞生物量,确定最佳无机盐组合。
1.2.5 发酵条件优化 用优化的培养基进行单因素试验,测定不同接种量、温度、初始pH、黄豆粉目数和装液量对CS27生长的影响。
1.3 数据处理
数据采用Excel软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 培养基筛选
2.1.1 不同有机碳氮源对CS27细胞生物量的影响 由筛选结果（表1）可以看出,6种碳源中,CS27最易利用糖蜜,细胞生物量显著高于其他5种碳源,可选用糖蜜作为培养基的碳源。氮源中,有机氮源豆粕和黄豆粉发酵后的细胞生物量较大,其中黄豆粉发酵后的细胞生物量显著高于豆粕,可以选择黄豆粉作为培养基的有机氮源。
表1 不同碳、氮源下CS27菌株的细胞生物量Tab. 1 Cell biomass of CS27 strain with different C and N sources |
| 碳源种类 Carbon source | 细胞生物量 Cell biomass/ (×108 cfu∙g-1) | 有机氮源种类 Organic nitrogen source | 细胞生物量 Cell biomass/ (×108 cfu∙g-1) | 无机氮源种类 Inorganic nitrogen source | 细胞生物量 Cell biomass/ (×108 cfu∙g-1) |
|---|---|---|---|---|---|
| 麦芽糖 | 4.40cBC | 大豆蛋白胨 | 11.3bBC | 氯化铵 | 18.00aA |
| 蔗糖 | 7.10bB | 蛋白胨 | 0.600dD | 硫酸铵 | 14.50bB |
| 玉米淀粉 | 6.90bB | 黄豆粉 | 20.3aA | 草酸铵 | 6.50cC |
| 葡萄糖 | 3.80cBC | 豆粕 | 14.5bB | 脲 | 4.27dD |
| 玉米粉 | 6.80bB | 酵母粉 | 12.5bB | 硝酸铵 | 0.367eE |
| 糖蜜 | 11.9aA | 牛肉膏 | 7.50cC | 硝酸钾 | 0.100eE |
| CK1 | 2.40cC | CK2 | 2.90dD | CK3 | 14.10bB |
Note: Different upper and lower case letters indicate extremely significant difference (P<0.01) and significant difference (P<0.05) between treatments, respectively. | |
注：不同大、小写字母分别表示处理间差异极显著（P<0.01）和差异显著（P<0.05）。 |
2.1.2 不同无机氮源对CS27细胞生物量的影响 由筛选结果（表1）可以看出,以硫酸铵、氯化铵作为无机氮源发酵后的细胞生物量均高于对照,以氯化铵作为无机氮源时CS27菌株的细胞生物量极显著高于对照,因此选择氯化铵作为培养基的无机氮源。
图1 不同糖蜜浓度对CS27菌株的细胞生物量Fig. 1 The cell biomass of CS27 strain cultured at different concentrations of molasses |
图2 不同黄豆粉浓度下CS27菌株的细胞生物量Fig. 2 The cell biomass of CS27 strain cultured at different concentrations of soybean powder |
2.1.4 碳源、氮源正交试验 以细胞生物量作为指标,通过正交实验筛选出最佳碳源、氮源组合。碳源、氮源正交实验选择L9(33)正交设计表,即以糖蜜（A）、黄豆粉（B）、氯化铵（C）分3水平进行实验研究,正交试验结果与分析见表2。
表2 L9(33)正交实验设计和结果分析Tab. 2 L9(33) orthogonal experimental design and results analysis |
| 试验号 No. | 因素 Factors | 细胞生物量 Cell biomass /(×108cfu∙g-1) | ||
|---|---|---|---|---|
| (A)黄豆粉 Soybean powder/% | (B)糖蜜 Molasses /% | (C)氯化铵 Ammonium chloride /% | ||
| 1 | 1(1.0) | 1(0.5) | 1(0.3) | 8.40 |
| 2 | 1(1.0) | 2(1.0) | 2(0.5) | 10.10 |
| 3 | 1(1.0) | 3(1.5) | 3(0.8) | 5.40 |
| 4 | 2(1.5) | 1(0.5) | 3(0.8) | 12.90 |
| 5 | 2(1.5) | 2(1.0) | 1(0.3) | 12.30 |
| 6 | 2(1.5) | 3(1.5) | 2(0.5) | 1.51 |
| 7 | 3(2.0) | 1(0.5) | 2(0.5) | 6.80 |
| 8 | 3(2.0) | 2(1.0) | 3(0.8) | 5.90 |
| 9 | 3(2.0) | 3(1.5) | 1(0.3) | 9.20 |
| K1 | 2.39×109 | 2.81×109 | 2.99×109 | |
| K2 | 2.67×109 | 2.83×109 | 1.84×109 | |
| K3 | 2.19×109 | 1.61×109 | 2.42×109 | |
| R | 2.14×109 | 1.70×108 | 7.40×108 | |
对正交实验结果进行直观分析,从极差R的大小可以看出,黄豆粉是影响CS27细胞生物量的重要因素,其次是氯化铵和糖蜜,糖蜜是三因素中相对不重要的因素。综合分析可知其最佳碳源、氮源组合为：A2B1C3,即1.5%黄豆粉、0.5%糖蜜、0.8%氯化铵。
表3 不同无机盐CS27菌株的细胞生物量Tab. 3 The cell biomass of CS27 strain with different inorganic salt |
| 无机盐种类 Inorganic salt | 细胞生物量 Cell biomass /(×108 cfu∙g-1) |
|---|---|
| 柠檬酸钠 | 19.60aA |
| MgSO4·7H2O | 17.60bB |
| 碳酸钙 | 15.90cBC |
| CK | 14.10dCD |
| FeSO4·7H2O | 12.80dD |
| 氯化钙 | 9.80eE |
| ZnSO4·7H2O | 9.53eE |
| 磷酸氢二钾 | 5.43fF |
| 磷酸二氢钾 | 2.80gG |
Note: Different upper and lower case letters indicate extremely significant difference (P<0.01) and significant difference (P<0.05) between treatments, respectively. | |
注：不同大小写字母分别表示处理间差异极显著（P<0.01）和差异显著（P<0.05）。 |
图4 不同氯化钠浓度下CS27菌株的细胞生物量Fig. 4 The cell biomass of CS27 strain cultured at different concentrations of sodium chloride |
图5 不同七水合硫酸镁浓度CS27菌株细胞生物量Fig. 5 The cell biomass of CS27 strain cultured at different concentrations of magnesium sulfate |
图6 不同柠檬酸钠浓度下CS27菌株的细胞生物量Fig. 6 The cell biomass of CS27 strain cultured at different concentrations of sodium citrate |
2.1.6 无机盐正交试验 以细胞生物量作为指标,通过正交实验筛选出最佳的无机盐组合,无机盐正交试验选择L9(34)正交设计表,即以氯化钠（A'）、七水合硫酸镁（B'）、柠檬酸钠（C'）、碳酸钙（D'）分3 水平进行实验研究,正交试验结果与分析如表4所示。
表4 L9(33)正交实验设计和结果分析Tab. 4 L9(33) Orthogonal experimental design and results analysis |
| 试验号 No. | 因素 Factors | 细胞生量 Cell biomass /(×108 cfu∙g-1) | |||
|---|---|---|---|---|---|
| （A'）柠檬酸钠 Sodium citrate/% | （B'）七水合硫酸镁 Magnesium sulfate/% | （C'）碳酸钙 Calcium carbonate /% | （D'）氯化钠 Sodium chloride /% | ||
| 1 | 1(0.05) | 1(0.1) | 1(0.2) | 1(0.6) | 12.60 |
| 2 | 1(0.05) | 2(0.3) | 2(0.5) | 2(0.8) | 7.00 |
| 3 | 1(0.05) | 3(0.5) | 3(0.8) | 3(1.0) | 6.90 |
| 4 | 2(0.10) | 1(0.1) | 2(0.5) | 3(1.0) | 22.90 |
| 5 | 2(0.10) | 2(0.3) | 3(0.8) | 1(0.6) | 9.60 |
| 6 | 2(0.10) | 3(0.5) | 1(0.2) | 2(0.8) | 7.30 |
| 7 | 3(0.15) | 1(0.1) | 3(0.8) | 2(0.8) | 14.00 |
| 8 | 3(0.15) | 2(0.3) | 1(0.2) | 3(1.0) | 12.40 |
| 9 | 3(0.15) | 3(0.5) | 2(0.5) | 1(0.6) | 11.40 |
| K1 | 26.50 | 49.50 | 32.30 | 33.60 | |
| K2 | 39.80 | 29.00 | 41.30 | 28.30 | |
| K3 | 37.80 | 25.60 | 30.50 | 42.20 | |
| R | 13.30 | 20.50 | 9.00 | 8.80 | |
对无机盐正交实验结果进行直观分析,从极差R的大小可以看出,七水合硫酸镁是影响CS27细胞生物量的重要因素,其次是碳酸钙和柠檬酸铵,氯化钠是四因素中相对不重要的因素。综合分析,最佳无机盐组合为A'2B'1C'2D'3,即0.1%柠檬酸钠、0.1%七水合硫酸镁、0.5%碳酸钙、1.0%氯化钠。
2.2 发酵条件的优化
2.2.1 温度对发酵菌数的影响 对CS27菌株分别设定30、32、34、36 ℃进行摇瓶培养并测定菌数。结果如图8所示,菌株在32~34 ℃之间发酵最佳,34 ℃发酵菌数略低于32 ℃,在低于32 ℃和超过34 ℃条件下菌数明显下降,因此32 ℃为最佳发酵温度。
2.2.2 初始pH对发酵菌数的影响 对CS27菌株分别设定初始pH为5、6、7、8、9五个梯度进行摇瓶培养并测定菌数。结果如图9所示,发酵菌数随初始pH的增加而增加,在初始pH大于7时,发酵菌数开始下降,由此可见最适初始pH为7。
2.2.3 装液量对发酵菌数的影响 在250 mL三角瓶内分别按照30、50、70、100、120 mL装液量进行摇床培养并测定菌数。结果如图10所示,发酵菌数随装液量的增加而增加,装液量在50 mL以上时发酵菌数开始下降,因此50 mL为最佳装液量。
2.2.4 接种量对发酵菌数的影响 对CS27菌株分别按照3%、5%、7%、10%、12%的接种量进行摇瓶培养并测定菌数。结果如图11所示,当接种量在3%~7%时发酵菌数基本没有变化,接种量大于7%时菌数随接种量的增加而增加,接种量大于10%的情况下菌数随接种量的增加而下降,因此可以选择10%接种量为最佳接种量。
2.2.5 黄豆粉目数对发酵菌数的影响 培养基为1%黄豆粉和1%糖蜜。黄豆粉分别设定为20、40、60、80目进行试验,接种后培养24 h测定活菌数,考察不同目数黄豆粉对CS27菌株生长的影响。结果如图12所示,黄豆粉的目数对CS27的影响较大,过40目和60目的黄豆粉培养CS27菌株生长较好,60目的黄豆粉较40目对CS27菌株生长的影响更好,所以60目的黄豆粉更适合发酵生产CS27菌株。
3 讨论
本文所用的菌种枯草芽孢杆菌CS27是由本实验室分离获得的。枯草芽孢杆菌是工业酶制剂生产的常用菌种,符合益生菌菌种要求。本实验室前期的试验已经完成了对CS27菌株的产酶、抑菌和急性毒性等测试,结果表明该株枯草芽孢杆菌具有蛋白酶和淀粉酶活性,其代谢产物对肠道病原菌抑制作用明显,并且急性毒性实验安全无毒副作用[11]。因此枯草芽孢杆菌CS27符合作为益生菌的条件,在开发饲用微生物菌剂方面具有较大的潜力。
微生物的生长不仅仅决定于外部条件,内部条件也在起作用,微生物的生长繁殖是一个相当复杂的过程,由内外部条件共同决定的[12,13,14,15],不同枯草芽孢杆菌菌株的最适发酵培养基组分及培养条件差异很大,因此需要对特定的菌株筛选适宜的培养基配方及发酵条件。本研究出于降低发酵生产成本的考虑,对枯草芽孢杆菌CS27发酵培养基进行筛选优化。首先在三角瓶中进行单因素试验,筛选出发酵培养基的基础成分为糖蜜、黄豆粉、氯化铵、柠檬酸钠、氯化钠、碳酸钙、七水合硫酸镁,采用正交试验对筛选培养基配方进行优化,最终确定最佳培养基为0.5%糖蜜、1.5%黄豆粉、0.8%氯化铵、0.1%柠檬酸钠、1.0%氯化钠、0.5%碳酸钙、0.1%七水合硫酸镁,优化后发酵的细胞生物量可达1.75×109 cfu/mL[16]。
磷是微生物生长必须的元素之一,许多研究已经证明培养基中添加一定量磷可以促进微生物的生长。本文在无机盐筛选试验中发现,向基础培养基中分别添加0.1%磷酸二氢钾和0.1%磷酸氢二钾摇瓶培养24 h后,发酵液中的细胞生物量与对照组相比显著减少。相关报道中,卢耀俊等[17]发现向枯草芽孢杆菌培养基中加入2.33 g/L磷酸氢二钠和0.52 g/L磷酸二氢钠能够促进其生长,除此以外,至今鲜有培养基中加入磷元素抑制枯草芽孢杆菌生长的相关报道。出现上述情况可能存在以下原因：加入培养基中的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的浓度过低或者过高;钾离子对CS27菌株生长有一定的抑制作用;有机氮源黄豆粉中的磷含量比较充分,培养基中磷含量过高会抑菌菌株生长,具体原因还有待研究。
本文通过摇瓶培养对枯草芽孢杆菌CS27发酵条件进行研究,确定最佳发酵条件为;发酵温度32 ℃,初始pH 7.0,最适接种量10%,最佳装液量50 mL ,为后续枯草芽孢杆菌CS27利用5 L发酵罐高密度培养的发酵条件优化提供了一定的理论依据。