植物在生长发育过程中经常会遭遇各种生物胁迫（如虫害等）和非生物胁迫（高温、低温、干旱、高盐等）。为了维持生长,适应各种不利的环境条件,植物已经形成一系列复杂而有效的防御策略[1],其中热激转录因子（heat shock transcription factors, Hsfs）能够特异性结合靶基因启动子区域的热激元件（HSE）,在转录水平上调控抗逆相关基因的表达,提高植物抗逆性[2,3,4]。热激转录因子是信号转导途径的末端组分,通过调节下游基因活性响应高温胁迫和其他非生物胁迫[5,6],在生物体的逆境胁迫中起着重要的调控作用[7,8]。目前,已逐渐揭示了Hsf转录因子在植物应对非生物胁迫中作用。早在2002年,Mishra等[9]就发现,过量表达SlHsfA1番茄植株的耐热性较野生型有显著提高。过表达TaHsfA6f的小麦植株能够改善其耐热性[10]。在拟南芥中异源表达番茄SIHsfA3和小麦TaHsf3,可提高转基因拟南芥的耐热性[11,12]。研究发现,OsHSFA2e增强了转基因拟南芥对高盐胁迫的耐受性[13]。向日葵HaHSFA4a和HaHSFAA9在转基因烟草中的共过量表达对幼苗严重脱水和氧化应激的耐受性产生协同作用[14]。植物Hsf在低温胁迫中同样发挥着重要作用。在低温胁迫下,水稻A类中的OsHsfA3、OsHsfA4d、OsHsfA7、OsHsfA9热激转录因子转录表达水平显著增强[15]。4 ℃低温下小麦TaHsf3过量表达转基因拟南芥存活率提高,表明TaHsf3可能是参与小麦低温响应调控的关键成员[12]。
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）原产南美洲亚马逊河流域,是典型的热带雨林树种[16,17]。我国植胶区位于热带北缘,属于非传统植胶区,橡胶树经常遭受寒害,严重影响了橡胶树产业的可持续健康发展。鉴于此,从橡胶树中挖掘抗寒相关基因,分析其结构特征,阐明其在橡胶树遭受低温逆境时的表达特征,对其功能机制研究提供重要的理论依据。前期对转录组数据进行分析,结果发现有一条Hsf在不同抗寒性种质中差异表达。为了深入研究该基因的功能,本研究采用RT-PCR技术从橡胶树叶片中成功克隆获得该基因,并分析了其编码蛋白序列结构特征及进化关系,同时利用qRT-PCR分析该基因在抗寒性有明显差异的橡胶树种质应对低温胁迫时的表达模式,为进一步解析HbHsfA4a的生物学功能及调控机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.2 试剂 本实验所用植物总RNA提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;反转录试剂盒购自Thermo Scientific公司;pEASY-Blunt Simple Cloning Kit和Trans1-T1大肠杆菌感受态购自北京全式金生物科技有限公司;qRT-PCR荧光染料TB Green™ Premix Ex Taq™II购自TaKaRa公司。
1.2 方法
1.2.1 材料处理 选取处于一蓬叶稳定期长势一致的93-114、GT1、湛试327-13、热垦501、海垦1和热垦515幼苗,28 ℃培养48 h,然后进行4 ℃低温胁迫处理, 每个处理设3个生物学重复,每重复5株幼苗,处理0、4、8、24 h后, 采集离叶蓬10 cm处茎树皮,5株样混合后液氮速冻,提取RNA。
1.2.2 RNA提取及反转录 将上述采集到的样品液氮磨样,以天根生化科技有限公司的RNA prepPur多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取各样品总RNA,使用DNase I（天根生化科技有限公司）去除RNA中的DNA。利用Thermo公司的反转录试剂盒Thermo RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA第一条链,cDNA产物于-20 ℃保存备用。
1.2.3 HbHsfA4a基因的克隆 从课题组前期构建的巴西橡胶树低温胁迫转录组数据库中,挖掘到一条Hsf转录因子,通过在中国热带农业科学院橡胶所橡胶树基因组数据库中比对搜索,获得其参考序列。依据参考序列设计特异性扩增引物（F：5′-TGAATCTTGGAGACTATTGATGTTG-3′;R：5′-CACCAATAGCCCAAAAAGACAAT-3′）进行PCR扩增。扩增体系为50 μL,含PrimeSTAR Max Primix(2×) 25 μL、10 μmol/L Forward primer 1μL、10 μmol/L Reverse primer 1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 22 μL。扩增程序为：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 2 min;35个循环后再72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后,切下目的片段并回收、纯化,然后克隆到pEASY-Blunt Simple Cloning Vctor载体上。用载体转化大肠杆菌感受态,培养后挑取阳性菌株送往上海英潍捷基公司测序。
1.2.4 生物信息学分析 利用在线网站EXPASY中的ProtParam工具对基因的氨基酸组成、疏水性、等电点等理化性质进行分析。在线网站EXPASY中的ProtScale工具预测该蛋白质的疏水性/亲水性;利用SIGNAIP 3.0 Server在线软件对该蛋白信号肽预测;TMHMM Server V 2.0在线软件进行蛋白跨膜螺旋预测。通过PSORT在线软件对该蛋白进行亚细胞定位预测;NCBI中的CD Search分析工具、SMART和MEME软件分析蛋白的保守结构域。SOPMA在线软件预测蛋白的二级结构。从NCBI数据库下载其他植物的HsfA4a蛋白序列,首先用Clustal W进行序列多重比对,再利用MEGA 4.0软件,选择neighbour- joining（NJ）模型, 并进行1000次bootstrap统计学检验,构建系统进化树。
1.2.5 HbHsfA4a基因的表达分析 根据基因序列设计实时荧光定量特异引物（F：5′-CTGAAAGCCCAGCCATCTCT-3′;R：5′-GGGGATCAGGCTCTGGAACT-3′）,内参基因为橡胶树HbActin7a（F：5′-GGCACTTTGGTACTCAAGTC- 3′;R：5′-GAAGCATCCCAATCACTCTC-3′）。取2 μg RNA逆转录合成第一链cDNA,稀释10倍后作为实时定量PCR分析的模板。反应采用10 μL体系：SYBR Premix Ex TaqII 5 μL、10 μmol/L Forward primer 0.3 μL、10 μmol/L Re-verse primer 0.3 μL、1st strand cDNA 1 μL和ddH2O 3.4 μL。反应程序为：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性10 s,60 ℃退火20 s,70 ℃延伸30 s,40个循环。反应结束后,采用2-ΔΔCT方法计算基因相对的表达量。
2 结果与分析
2.1 HbHsfA4a基因的克隆及分析
克隆获得开放阅读框为1215 bp（图1）,编码404个氨基酸残基,根据其与拟南芥Hsfs基因的同源性将其命名为HbHsfA4a（NCBI 序列号：XM_021804017）。该基因编码的蛋白质分子质量约46.40 ku,理论等电点为4.91,共包含6389原子,分子式为C2009H3131N579O652S18;组成该蛋白的氨基酸中,丝氨酸（Ser）所占比例最高,为9.7%,半胱氨酸（Cys）和酪氨酸（Tyr）所占比例最低,均为0.7%。该蛋白不稳定系数为52.03%,属于不稳定类蛋白;亲水性平均值为-0.816,属于亲水性蛋白;ProtScale工具预测该蛋白亲/疏水性,结果显示HbHsfA4a的氨基酸中亲水性氨基酸比例较大（图2A）,其结果与EXPASY理化性质预测结果一致。HbHsfA4a所编码的蛋白没有信号肽（图2B）,无跨膜结构域。亚细胞定位预测结果表明该蛋白定位于细胞核的概率87.0%。HbHsfA4a二级结构由44.06%α-螺旋、6.68%延伸链、3.22%β-转角和46.04%无规则卷曲组成。
图1 HbHsfA4a RT-PCR扩增电泳结果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of the RT-PCR amplification product of HbHsfA4a M: DL2000 Marker; 1: HbHsfA4a. |
2.2 HbHsfA4a多重序列比对与系统进化分析
以HbHsfA4a基因推导的氨基酸序列为探针,在NCBI数据库中搜索并下载拟南芥（Arabidopsis thaliana,NP_193623）、木薯 （Manihot esculenta,XP_021599108.1）、蓖麻（Ricinus communis,XP_002522270.1）、麻疯树Jatropha curcas,XP_012091841.1）、胡杨（Populus euphratica,XP_011039379.1）、柚子（Citrus sinensis,XP_006467597.1）、可可（Theobroma cacao,XP_007025290.1）等8种植物HsfA4a氨基酸序列,利用DNAMAN软件进行序列多重比对（图3）发现,该基因编码的蛋白与其他植物的HsfA4a蛋白的氨基酸序列的相似性较高,具有植物HsfA亚家族特征的保守结构域。在N端第9~119氨基酸残基位置含有高度保守的HSF-DNA结合结构域,N端第125~202位还有一个保守的寡聚化结构域,在氨基酸序列中部第206~223氨基酸含有核输入信号（NLS）,C端第392~404氨基酸含有核输出信号（NES）,此外C端第329~366、369~385氨基酸有转录激活结构域AHA1和AHA2。
图3 HbHsfA4a蛋白与其他植物HsfA4a蛋白多序列比对Hsf-DBD：热激转录因子DNA结合结构域;HR-A/B：寡聚化结构域;NLS：核定位信号;AHA：以芳族、大的疏水和酸性氨基酸为特征的激活结构域;NES：核输出信号。 Fig. 3 Alignment of the putative amino acid encoded by HbHsfA4a and its homologous proteins from other species Hsf-DBD: Heat shock factor DNA-binding domain; HR-A/B: Oligomerization domain; NLS: Nuclear localization signal; AHA: Activation domains rich in aromatic, hydrophobic and acidic amino acids; NES: Nuclear export signal． |
系统进化分析结果显示,橡胶树的HbHsfA4a与木薯MeHsfA4a聚在一组（图4）,两者的遗传距离最为接近,氨基酸序列相似性为91%。该蛋白与蓖麻的RcHsfA4a、麻风树的JcHsfA4a和胡杨的PeHsfA4a亲缘关系较高,序列相似性分别为86%、83%和78%,与拟南芥的AtHsfA4a序列相似性为60%。
2.3 低温胁迫对HbHsfA4a基因表达的影响
低温胁迫下,HbHsfA4a在抗寒性强的橡胶树无性系93-114树皮中受低温诱导显著上调表达,并且表达丰度始终维持在较高的水平,而抗寒性弱的橡胶树无性系热垦501中无显著变化。HbHsfA4a在橡胶树无性系93-114树皮中的本底表达量和在低温胁迫24 h内的表达量均显著高于橡胶树无性系热垦501（图5）。
图5 低温（4 ℃）胁迫下HbHsfA4a基因在抗寒强的橡胶树无性系93-114和抗寒性弱的无性系热垦501中的差异表达t检验：*表示差异显著（P<0.05）,**表示差异极显著（P<0.01）。 Fig. 5 Differential expression of HbHsfA4a in response to cold stress (4 ℃) in the bark tissues of cold-tolerant rubber tree clone 93-114 (black bars) and cold-sensitive rubber tree clone Reken501 (hollow bars) t-test: * indicates significant difference (P<0.05), ** indicates extremely significant difference (P<0.01). |
2.4 低温胁迫下HbHsfA4a在抗寒性有明显差异的种质中的表达
进一步分析结果显示,低温胁迫下HbHsfA4a在GT1和湛试327-13两个抗寒性强的橡胶树无性系及海垦1和热垦515两个抗寒性弱的橡胶树无性系树皮中的表达模式存在明显差异。总体上（图6）,在GT1和湛试327-13中的表达呈先升后降的变化趋势,在海垦1和热垦515中呈逐渐上升的趋势。HbHsfA4a基因在2个抗寒性强的橡胶树无性系树皮中的本底表达量和在低温胁迫4 h和8 h时的表达量均显著高于2个抗寒性弱的橡胶树无性系,24 h时GT1仍高于海垦1和热垦515,湛试327-13低于海垦1和热垦515。
3 讨论
植物Hsf基因属于多基因家族,依据其结构可分为3个家族A、B和C。与B类和C类Hsf转录因子相比,植物A类Hsf转录因子的特有的基序是C端具有富含芳香族（W、F、Y）、疏水性（L、I、V）和酸性（D、E）氨基酸的转录激活结构域（AHA）[24]。本研究克隆获得HbHsfA4a基因,开放阅读框为1215 bp,编码404个氨基酸。氨基酸序列分析表明,该基因蛋白序列具有典型的HsfA亚家族保守结构域,即在N端含有高度保守的Hsf-DNA结合结构域和寡聚化结构域、在氨基酸序列的中部含有核输入信号（NLS）、C端含有核输出信号（NES）和转录激活结构域（AHA）。系统发育分析表明,HbHsfA4a蛋白与木薯、蓖麻等HsfA4a亲缘关系较近,与拟南芥AtHsfA4a氨基酸序列一致性为60.00%。因此,可以确定该基因为橡胶树HsfA4a。
目前,对A类Hsfs在逆境胁迫中的作用已有大量深入研究和报道。如拟南芥AtHsfA1a和AtHsfA1b在热响应早期阶段调控相关基因转录表达及热激蛋白的合成,以减轻高温对细胞造成的损害[25];Li等[11]发现番茄热激转录因子SlHsfA3可直接调控SlHsp26.1-P和SlHsp21.5-ER的表达,使其表达量显著增加,过表达SlHsfA3的拟南芥植株耐热性增强并且花期推迟;AtHsfA6a在正常条件下的表达非常低,但可被NaCl和干旱高度诱导表达,在种子萌发和幼苗阶段,过表达AtHsfA6a的植物会增强对盐和干旱胁迫的耐受性[26]。种子特异性HaHSFA9在烟草中的过表达赋予了对营养生长期干旱的耐受性[27]。对A类中HsfA4a成员的抗逆功能也有了一定研究,但主要集中在对重金属耐受性[28,29]、对高光和氧化胁迫反应的调控[30]、对热激反应性[31]及耐盐性[32],而对低温胁迫中的功能研究报道极少。本研究为了探索HbHsfA4a在低温胁迫下橡胶树中的作用,利用qPCR分析HbHsfA4a在不同抗寒性种质中的转录水平,结果显示抗寒性强的橡胶树无性系93-114树皮中受低温诱导显著上调表达,并且表达丰度始终维持在较高的水平,而抗寒性弱的橡胶树无性系热垦501中无显著变化,暗示着HbHsfA4a可能在橡胶树抵御低温胁迫途径中发挥着重要作用。进一步分析发现,抗寒性强的GT1和湛试327-13中受低温诱导显著上调表达,且在低温处理4 h和8 h时的表达量均显著高于海垦1和热垦515两个抗寒性弱的橡胶树无性系,24 h时表达量稍有下降,但仍保持较高水平。Hu等[33]研究草莓Hsf基因家族成员在低温胁迫应答时也发现FvHsfA4a在4 ℃低温处理后2~8 h间其表达量上调达10倍。由此可见,HbHsfA4a基因可能在橡胶树冷响应早期阶段调控相关基因的转录表达和热激蛋白的合成,以减轻低温对细胞造成伤害。HbHsfA4a基因在低温逆境应答中的功能及调控机制仍需进一步的研究。