我国是芒果原产地之一,近些年芒果的种植面积不断扩大,产量逐年增加,已成为一些地方的农业支柱产业[1]。随着芒果产业的大规模发展,其生产过程中农药的不合理使用问题日益严峻。多效唑是一种三唑类植物生长调节剂,在芒果园土壤中有较大的施用量,主要用在芒果树的控梢、提高芒果产量[2,3,4]等方面。但多效唑在土壤中的残留期较长,其半衰期在半年到一年[4],土壤中残留的多效唑可能会影响土壤生态系统的平衡[5]。
土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分[6],土壤微生物可以敏感地反映土壤环境质量的变化,同时是土壤中生物活性的具体体现[7]。微生物与土壤健康状况的关系密切,对生态系统的能量流动和物质循环具有重要作用[8]。土壤中微生物以细菌数量最多,占土壤微生物总量的70%以上,细菌群落中含有大量具有特殊功能的生理类群,如固氮菌、氨化细菌、硝化细菌等[9]。细菌种类或丰度的变化,会对这些特定生理类群的数量产生直接影响,从而影响土壤肥力,如放线菌对植物病虫害防治有着重要的作用[10]。并且农药的施用会对土壤微生物产生一定的影响,从而影响农业生产。
目前关于土壤微生物多样性的研究多采用传统的平板培养法[11,12,13,14],但平板培养法具有较大的局限性,通过传统的培养方法得到的微生物只占环境微生物总数极少的一部分[15]。随着分子生物学和生物信息学的发展,PCR-SSCP[16]、PLFA[17]、DGGE和高通量测序技术[18,19,20]等一些新的方法在土壤微生物的研究中得到应用。其中,高通量测序技术可以避免微生物分离培养的过程,能够准确、快速、高通量地解读土壤微生物生态系统的变化情况,与其他方法相比,具有通量大、准确率高、成本低等优点[21],更加适合土壤微生物群落结构和多样性的分析。目前利用高通量测序的方法研究土壤微生物的报道有很多,但是,尚未有通过高通量测序的方法研究多效唑对土壤微生物多样性影响的报道。同时,传统的方法无法对微生物的功能进行研究,16S rRNA高通量测序可以通过PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）软件预测基因序列对应的细菌菌群代谢功能谱。PICRUSt功能预测分析相较于宏基因组研究更加方便且成本也更低,同时预测效果具有较高的可靠性[22]。目前该方法已在珊瑚礁[23]、海水[24]、库区[25]、土壤[26,27,28]等不同生境中得到良好的应用,而关于多效唑对芒果园土壤微生物的研究还未见报道。
海南是我国主要的芒果种植区,据《2017年海南省统计年鉴》,乐东黎族自治县的芒果种植面积达到10 341 hm2,位居海南省第二。本研究以海南省乐东黎族自治县黄流镇某芒果园为研究对象,通过高通量测序技术研究了施用多效唑前后芒果园土壤微生物多样性及其群落结构的变化情况,结合PICRUSt分析预测多效唑对芒果园土壤微生物功能的影响,为合理施用多效唑和评价多效唑对农田土壤生态系统的影响提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 土壤样品采集与处理
土壤样品采集参照《土壤农化分析》[29],在处理前后试验组和对照组各设置3个采样区域,去除表层土壤,每个采样区采集6~8个点的土壤混匀,放置冰盒中带回实验室储存于-80 ℃冰箱,用于DNA提取及细菌16S rRNA测序分析。
1.2 试验设计
试验基地位于海南省乐东黎族自治县黄流镇某芒果园。该地区属于热带季风气候,土壤为砂质壤土,光热充足,年平均气温为25 ℃,年降雨量为1400~1800 mm。在基地内选取未使用过多效唑的幼龄芒果树区域,设置试验组（T）和对照组（C）,试验组施用多效唑量为1.5 g/m2（以多效唑有效成分计）,分多效唑施用前（T0）和施用后30 d （T30）2个时期进行样品采集;对照组采样时期同试验组,分为C0和C30 2个时期。试验前土壤基本参数如表1所示。
表1 供试土壤基本参数Tab. 1 Basic properties of the tested soils |
| 处理 Treatment | pH | 通气孔隙度 Soil aeration porosity/% | 有机质 Organic matters /(g∙kg-1) | 碱解氮 Available N /(mg∙kg-1) | 有效磷 Available P /(mg∙kg-1) | 速效钾 Available K /(mg∙kg-1) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| C | 5.63±0.02a | 48.2±0.6a | 12.396±0.322a | 152.916±3.268a | 54.116±2.003a | 158.497±8.360a |
| T | 5.62±0.14a | 47.9±0.5a | 12.908±0.814a | 148.659±5.844a | 52.962±1.900a | 156.086±4.873a |
Note: C and T represent control group and treatment group. The same lowercase letter indicates that the difference is not significant among treatments at the 0.05 level. | |
注：C和T表示对照组和处理组。同一列数据后的相同小写字母表示在0.05水平差异不显著。 |
1.3 检测方法
土壤DNA采用MOBIO土壤DNA提取试剂盒（PowerSoil® DNA Isolation kit）进行提取,细菌PCR扩增采用V4-V5可变区的细菌通用引物515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和907R（CCGTCAATTCMTTTRAGTTT）。PCR扩增体系及扩增条件参照文献[30]进行。土壤DNA样品经过PCR质量验证合格后,送至广州赛哲生物科技股份有限公司利用Illumina Miseq测序平台进行16S rRNA序列测定。
1.4 数据处理
采用FLASH v1.2.7软件进行序列拼接,对拼接得到的序列进行过滤。采用UCHIME v4.2软件,鉴定并去除嵌合体序列,得到最终有效数据。测序得到的序列经拼接过滤后,提交到美吉云平台进行数据处理分析。采用SPSS 24.0软件对数据进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 样品信息统计
通过Illumina高通量测序平台对芒果园土壤细菌16SrRNA 的V4-V5区进行序列测定,12个样品测序共获得454 320条原始序列,经过滤后共产生445 976条有效序列,每个样品至少产生36 557条有效序列,平均产生37 165条有效序列。对测序结果基于97.00%的相似度进行聚类,共得到3586个OTUs。
根据样品稀释曲线可以看出,12个样品的曲线均有趋于平坦的趋势（图1）,表明样品测序量合理,OTUs的覆盖度高,测序深度可以满足试验要求。
采用Venn图2展示4组样品所含OTUs,4组样品共有的核心OTUs个数为1841个。C0共有2468个OTUs,C30共有3143个OTUs;T0共有2439个OTUs,T30共有2877个OTUs。4组样品中的细菌在OTUs水平上存在差异;施用多效唑后,土壤中总物种类别和特有物种类别减少。与对照组（C30）相比,经多效唑处理后（T30）,土壤中OTUs个数减少。
2.2 Alpha多样性分析
Alpha多样性可用来反映样本中微生物的丰度和多样性。采用群落丰富度指数Sobs、Ace和Chao以及群落多样性指数Shannon和Simpson对施用多效唑后芒果园土壤细菌多样性和群落结构的变化情况进行评估,结果见表2。结果表明,试验样品具有丰富的群落组成,施用多效唑后,样本细菌群落丰富度和多样性有显著的变化。C0和T0的丰富度指数和多样性指数没有显著差异。但T30的群落丰富度指数Ace显著高于C30,T30的物种多样性指数Shannon和Simpson显著低于C30。Ace指数越大,表明土壤中细菌的数目越多;多样性指数越大,表明土壤中每个物种的个数越平均,物种分布越均匀。施用多效唑后,土壤细菌总数目增多,但各物种的数目差异较大,不同种类的细菌分布不均匀。
表2 土壤细菌丰度指数和多样性指数Tab. 2 Bacterial abundance index and diversity index in soils |
| Sobs | Ace | Chao | Shannon | Simpson | |
|---|---|---|---|---|---|
| C0 | 1961.67±14.79b | 2216.81±13.31c | 2067.10±79.14b | 5.98±0.22a | 0.01±0.01a |
| T0 | 1893.67±25.55b | 2137.07±21.18c | 1959.42±12.56b | 5.94±0.04a | 0.01±0.00a |
| C30 | 2592.67±28.99a | 2823.89±25.95b | 3056.10±45.8a | 6.16±0.02a | 0.01±0.00a |
| T30 | 2536.33±76.51a | 3351.23±22.82a | 3113.32±85.68a | 5.80±0.25b | 0.00±0.00b |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatments at 0.05 level. C0 and C30 represent the two periods of the control group before and after test. T0 and T30 represent the two periods before and after treatment. | |
注：同列数据后的不同小写字母表示在0.05水平差异显著。C0和C30表示对照组前后2个时期;T0和T30表示处理组前后2个时期。 |
2.3 物种组成分析
将测序得到的3586个OTUs与silva128/16s_ bacteria物种分类数据库进行比对,可注释到38个门、89个纲、195个目、378个科、673个属、1353个种。在门水平上对细菌群落结构组成进行分析,结果表明样品丰度大于1%的有变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）以及1个未分类菌门（unclassified k-norank）,这10个细菌门为样品土壤中的优势菌群。施用多效唑的土壤T30和对照组C30在细菌门的相对丰度有了明显的变化,而C0和T0在细菌门水平上的相对丰度没有显著差异,说明所选试验区域的对照组和试验组土壤细菌无显著差异（图3A）。施用多效唑的土壤T30中,变形菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门和硝化螺旋杆菌门等的相对丰度显著高于对照组土壤C30;放线菌门和厚壁菌门的相对丰度显著低于C30（图3B）。
图3 门水平上的物种差异分析*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001。C0和C30表示对照组前后2个时期,T0和T30表示处理组前后2个时期。 Fig. 3 The differences of relative abundance of bacteria at the phylum level * represents P<0.05, ** represents P<0.01, *** represents P<0.001. C0 and C30 represent the two periods of the control group before and after test. T0 and T30 represent the two periods before and after treatment. |
2.4 Beta多样性分析
Beta多样性分析是通过微生物群落构成的比较,考虑物种丰度和均匀度,评估不同微生物群落间的差异情况。主成分分析（PcoA）用来反映不同处理样本群落组成的相似性或差异。在属水平上对物种丰度进行主成分分析,在第一个时期,C0与T0的距离较近,表明试验进行前C组和T组样本组成较为类似;在第二个时期,T30与C30的样点较为分散,在图中的距离较远,表明经多效唑处理后土壤的细菌群落结构有了较大的改变（图4）。
2.5 PICRUSt功能预测分析
为了探究施用多效唑后土壤细菌的功能变化情况,本研究采用PICRUSt软件进行菌群预测分析。基于KEGG数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）预测的结果表明：在一级功能层共获得6类生物代谢通路功能分析：代谢（metabolism）、遗传信息处理（genetic information processing）、环境信息处理（environmental information processing）、细胞过程（cellular processes）、有机系统（organismal systems）和人类疾病（human diseases）。其中代谢、遗传信息处理和环境信息处理为其主要组成,占比分别为51.73%~52.36%、15.28%~15.39%和13.11%~13.71%。
同时对预测基因二级功能层进行分析,发现其由细胞生长与死亡（cell growth and death）、折叠、分类和降解（folding,sorting and degradation）、碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）、次生产物代谢的生物合成（biosynthesis of other secondary metabolites）、氨基酸代谢（amino acid metabolism）等43个子功能组成。对二级功能层预测基因拷贝数进行分析,发现T30和C30共有25个二级功能层预测基因的拷贝数存在显著差异（图5）。施用多效唑的处理组T30中有细胞生长与死亡（cell growth and death）、折叠、分类和降解（folding,sorting and degradation）、内分泌代谢疾病（endocrine and metabolic diseases）、细胞运动（cell motility）、膜运输（membrane transport）、能量代谢（energy metabolism）、循环系统（circulatory system）、辅助因子和维生素的代谢（metabolism of cofactors and vitamins）、全局和概览地图（global and overview maps）、免疫系统（immune system）和传染病：细菌（infectious diseases: Bacterial）11个子功能预测基因的拷贝数大于空白对照组C30;T30中的碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）、次生产物代谢的生物合成（biosynthesis of other secondary metabolites）、氨基酸代谢（amino acid metabolism）、神经系统（nervous system）、多糖生物合成和代谢（glycan biosynthesis and metabolism）、运输和分解代谢（transport and catabolism）、免疫系统疾病（immune diseases）、物质依赖（substance dependence）、类脂化合物代谢（lipid metabolism）、传染病：寄生（infectious diseases: Parasitic）、心血管疾病（cardiovascular diseases）、环境适应（environmental adaptation）、排泄系统（excretory system）和内分泌系统（endocrine system）14个子功能预测基因的拷贝数小于C30。
图5 预测功能基因在不同样品间的差异（二级功能层）图中数字代表一级功能层分布：1 细胞过程;2 环境信息处理;3 遗传信息处理;4 人类疾病;5 代谢;6 有机系统。C0和C30表示对照组前后2个时期;T0和T30表示处理组前后2个时期。 Fig. 5 The variation of predicted functional profiles in different samples (hierarchy level 2) The figure numbers represent the first-level functional layer distribution: 1 cellular processes; 2 environmental information processing; 3 genetic information processing; 4 human diseases; 5 metabolism; 6 organismal systems. C0 and C30 represent the two periods of the control group before and after experiment. T0 and T30 represent the two periods before and after treatment. |
3 讨论
土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分,在生态系统的物质和能量循环中起着不可或缺的作用。土壤中大部分的生物化学转化过程是微生物活动引起的,凡能改变微生物数量或活性的任何化合物都会影响土壤的生化过程,最终影响土壤肥力和植物生长[31]。农药的施用会对土壤
现有关于多效唑对土壤微生物的影响的研究报道多采用平板培养法进行,赵秀芬等[11]、袁志华等[12]、Gonçalves等[13]、Silva等[14]等均采用此方法研究了多效唑对土壤微生物多样性、生物量的影响,由于试验方法的限制均未对土壤细菌群落组成进行研究。本研究采用高通量测序技术研究了多效唑对芒果园土壤细菌的影响,发现施药后的土壤细菌多样性显著降低,这与前人[11, 13-14]的研究结果一致。Alpha多样性分析表明施用多效唑后,土壤细菌的丰富度降低,与Silva等[14]的报道一致;细菌群落多样性降低,这可能与多效唑减少了芒果园中土壤细菌的种类有关。本研究的结果与Kuo等[36]的研究结果一致,与同时期未施用多效唑的芒果园土壤相比,施用多效唑的土壤细菌群落结构有了较大的改变。通过物种群落组成分析,发现多效唑对土壤中变形菌门和放线菌门的细菌影响最大,施用多效唑后,土壤中变形菌门的丰度显著提高,放线菌门的丰度显著降低,放线菌对植物病害具有十分明显的防治作用,放线菌含量的降低可能会导致植物病害发生[10]。本研究结果表明施用多效唑会减少土壤细菌的物种种类,打破土壤微生态平衡,可能使原本供给某类细菌的养分被其他细菌利用,增大了其他细菌的数量,虽然提高了土壤中细菌总体的丰富度,但减少了土壤中的细菌种类,导致土壤的细菌多样性降低。
之前关于多效唑对芒果园细菌群落结构的研究主要关注土壤微生物量的变化情况,对其功能的研究开展较少。农药残留会使土壤中的功能微生物含量发生改变,具有降解污染物功能的微生物含量增多[37,38,39]。PICRUSt分析通过与数据库比对,将微生物的变化情况和生物功能联系起来[40]。施用多效唑前后土壤微生物的相对丰度发生改变,其功能也发生相应的变化,本研究将高通量测序结果进行PICRUSt功能预测分析,发现施用多效唑后,在一级功能层和二级功能层的预测基因拷贝数整体趋势低于对照组。该结果初步揭示了施用多效唑后芒果园土壤细菌功能的差异,但鉴于PICRUSt功能预测分析的局限性,后续需要结合宏基因组测序等技术进一步分析。
4 结论
本研究初步探明了施用多效唑后芒果园土壤细菌多样性和群落结构的变化情况,施用多效唑会减少土壤OTUs的数目,降低土壤细菌的多样性;多效唑会改变芒果园土壤的细菌相对丰度,施用多效唑后,变形菌门的丰度显著提高,放线菌门的丰度显著降低;通过PICRUSt功能预测分析,发现施用多效唑后,土壤细菌的功能有一定的改变,土壤的预测基因拷贝数在一级功能层和二级功能层上均低于对照组。本研究采用高通量测序技术研究了多效唑对芒果园土壤微生物的影响,对评价多效唑对芒果园土壤微生物生态系统的影响进而指导合理施用多效唑具有重要意义。