吡虫啉（imidacloprid）属新烟碱类内吸性杀虫剂,具有高效、广谱、低毒等优点,对蚜虫、蓟马等害虫有特效[1,2]。高效氯氰菊酯（beta-cypermethrin,β-CP）是拟除虫菊酯类高效杀虫剂中的一种,具有极高的胃毒和触杀作用[3,4]。由于这2种农药杀虫效果显著,近年来被广泛应用于香蕉种植中。但在当前农业生产中,由于管理水平不一、监管不足,蕉农质量安全意识淡薄,擅自增加施药次数和加大施药剂量,导致农药残留风险增加。为了保证香蕉质量安全,建立快速准确测定香蕉中吡虫啉和高效氯氰菊酯残留的方法显得尤为重要。
目前,已报道的吡虫啉和高效氯氰菊酯的检测方法主要有气相色谱法[5,6]、高效液相色谱法[7]、高效液相色谱-串联质谱[8]、气相色谱-串联质谱[9]等,涉及的基质有西红柿、韭菜、水、虾等。但是这些研究均为单一农药的测定方法,同时测定香蕉中吡虫啉和高效氯氰菊酯的分析方法尚未见报道。超高效液相色谱-串联质谱（UPLC- MS/MS）检测技术具有灵敏度高、检出限低、抗干扰能力强和定性定量准确等特点,使其成为香蕉中农药残留检测的常用技术。QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）前处理方法因具有快速、简单、价廉、有效、实用、安全等优点,在农产品农药残留检测中得到广泛应用。本研究采用改进的QuEChERS前处理技术,结合UPLC-MS/MS法建立了香蕉中吡虫啉和高效氯氰菊酯同时测定的方法,以期为香蕉中吡虫啉和高效氯氰菊酯的残留检测提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 香蕉,采自海口市澄迈县香蕉园,采收时7~8分熟。
标准品吡虫啉（纯度为99.8%,德国Dr. Ehrenstorfer）、高效氯氰菊酯（纯度为99.1%,美国Cato Research Chemical Inc.）;甲醇、乙腈（色谱纯,赛默飞世尔科技有限公司）;甲酸、乙酸、乙酸铵、氯化钠、无水硫酸镁（分析纯AR,广州化学试剂厂）;N-丙基乙二胺（PSA,深圳逗点生物技术有限公司）、石墨化炭黑（GCB,上海安谱实验科技股份有限公司）。
1.1.2 仪器与设备 AB 4000+超高效液相色谱-串联质谱,美国AB SCIEX公司;电子天平,梅特勒-托利多仪器有限公司;多管涡旋混合器,北京优晟联合科技有限公司;超纯水仪,成都超纯科技有限公司;IKAT25高速匀浆机,上海万捷科技有限公司;落地式高速冷冻离心机,日本Hitachi Koki Co., Ltd;氮吹仪,美国Organomation Associates Inc.。
1.2 方法
1.2.1 样品前处理 准确称取10.0 g均质良好的香蕉样品于50 mL离心管中,加20 mL 1%乙酸乙腈,以12 000 r/min匀浆2 min,2500 r/min涡旋5 min,8000 r/min离心5 min;将全部上清液转入已加有2.0 g氯化钠的50 mL离心管中,2500 r/min涡旋5 min,8000 r/min离心5 min;取10 mL上清液转入已加有PSA（200 mg）+GCB（100 mg）+无水硫酸镁（800 mg）的15 mL离心管中,2500 r/min涡旋5 min,8000 r/min离心5 min,取1.5 mL上清液过0.22 µm有机系滤膜后收集于自动进样瓶中,待进样。
1.2.2 检测条件 （1）超高效液相色谱条件。色谱柱：Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm,1.7 µm,Waters公司）;柱温：40 ℃;流动相：A为2 mmol/L乙酸铵,B为甲醇;流速：0.25 mL/min;进样量：10 µL;运行时间：5 min。梯度洗脱程序：0~0.1 min,90%~40% A;0.1~ 1.5 min,40%~20% A;1.5~1.6 min,20%~10% A;1.6~4.0 min,10% A;4.0~4.1 min,10%~90% A;4.1~5.0 min,90% A。
（2）质谱条件。离子源：电喷雾正离子电离源（ESI+）;扫描方式：多重反应监测（MRM）;离子源温度：600 ℃;碰撞气：6 psi;雾化器GS1：50 psi、GS2：50 psi;离子喷雾电压：5500 V;气帘气：20 psi。
2 结果与分析
2.1 检测条件优化
表1 吡虫啉和高效氯氰菊酯的质谱条件参数Tab. 1 UPLC / MS-MS parameters for imidacloprid and β-cypermethrin |
| 化合物 Compound | 保留时间 Retention time/min | 离子对 Ion pair / (m∙z-1) | 去簇电压 Decluster voltage/V | 碰撞能量 Collision energy/V |
|---|---|---|---|---|
| 吡虫啉 Imidacloprid | 0.96 | 256.0/209.0* | 60.50 | 23.29 |
| 256.0/175.1 | 60.50 | 24.39 | ||
| 高效氯氰菊酯 β-cypermethrin | 2.90 | 433.0/191.0* | 70.98 | 19.96 |
| 433.0/119.0 | 70.98 | 20.14 |
Note: * stands for quantitative ion pairs. | |
注：*为定量离子对。 |
2.1.2 色谱条件优化 采用Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（50 mm×2.1 mm,1.7 µm）,在流速为0.25 mL/min条件下,考察了乙腈-水、乙腈- 2 mmol/L乙酸铵水溶液、甲醇-水、甲醇-2 mmol/L乙酸铵水溶液4种流动相体系对吡虫啉和高效氯氰菊酯检测结果的影响。结果表明,以甲醇- 2 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相时,目标化合物离子化效率高、峰形良好、灵敏度高。在此检测条件下,吡虫啉的保留时间为0.96 min,高效氯氰菊酯的保留时间为2.90 min。
2.2 样品前处理
图1 吡虫啉和高效氯氰菊酯的定量离子色谱图（0.01 µg/mL）Fig. 1 Quantitative ion chromatography of imidacloprid and β-cypermethrin (0.01 µg/mL) |
表2 不同提取剂对吡虫啉和高效氯氰菊酯的回收率Tab. 2 Recoveries of imidacloprid and β-cypermethrin with different extracts % |
| 提取剂 Extracting agent | 吡虫啉 Imidacloprid | 高效氯氰菊酯 β-cypermethrin | ||
|---|---|---|---|---|
| 蕉肉 Banana pulp | 全蕉 Whole banana | 蕉肉 Banana pulp | 全蕉 Whole banana | |
| 乙腈 Acetonitrile | 74.34±0.22 | 77.74±0.21 | 93.73±5.39 | 106.77±6.40 |
| 0.1%甲酸乙腈 0.1% formic acid acetonitrile | 76.57±0.68 | 77.08±0.85 | 101.24±3.20 | 106.35±3.76 |
| 1%甲酸乙腈 1% formic acid acetonitrile | 110.06±2.16 | 111.01±2.73 | 93.40±3.86 | 95.05±3.42 |
| 0.1%乙酸乙腈 0.1% acetonitrile acetate | 80.60±2.37 | 82.83±1.03 | 86.22±3.69 | 99.83±1.61 |
| 1%乙酸乙腈 1% acetonitrile acetate | 89.59±0.88 | 100.31±1.96 | 89.77±3.96 | 100.41±9.70 |
Note: Data=Recovery±RSD, n=3. | |
注：数据为回收率±相对标准偏差,n=3。 |
2.2.2 净化剂的选择 QuEChERS方法中常用的净化剂有PSA、C18、GCB等[16,17],其中PSA主要用于去除样品中的糖类、有机酸、金属离子等,C18用于去除样品中的脂类和蛋白质等成分,GCB对样品中色素有较强的吸附净化能力[18,19]。分别以香蕉全蕉和蕉肉为基质,对净化过程中不同净化剂用量进行优化（表3）。结果表明,当PSA用量为200 mg时,2种农药的回收率在93.09%~ 98.15%;随着GCB用量的增加,提取液净化效果逐渐提高,颜色逐渐变浅。当GCB用量为100 mg时,吡虫啉和高效氯氰菊酯的回收率在93.83%~ 99.62%。同时加入一定量无水硫酸镁,用于去除提取液中残留的少量水分。最终确定的净化剂组合为PSA（200 mg）+GCB（100 mg）+无水硫酸镁（800 mg）。
表3 不同净化剂对吡虫啉和高效氯氰菊酯的回收率Tab. 3 Recoveries of imidacloprid and β-cypermethrin with different purifiers % |
| 化合物 Compound | 基质 Matrix | PSA/mg | GCB/mg | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 100 | 200 | 300 | 10 | 50 | 100 | ||
| 吡虫啉 Imidacloprid | 蕉肉 Banana pulp | 93.27 | 98.15 | 98.46 | 93.77 | 95.99 | 93.83 |
| 全蕉 Whole banana | 93.70 | 95.99 | 96.30 | 94.44 | 94.44 | 94.04 | |
| 高效氯氰菊酯 β-cypermethrin | 蕉肉 Banana pulp | 89.22 | 93.09 | 88.53 | 88.69 | 93.77 | 98.94 |
| 全蕉 Whole banana | 88.15 | 93.85 | 83.14 | 91.12 | 96.51 | 99.62 | |
2.3 方法的线性相关性、检出限（LOD）和定量限（LOQ）
采用外标法定量。将配制好的100 µg/mL的吡虫啉和高效氯氰菊酯标准贮备液,用甲醇逐级稀释制成0.001、0.01、0.02、0.05、0.1 µg/mL标准溶液。取适量浓度一定体积的标准溶液,加入2 mL容量瓶中,氮气吹干,按照1.2.1中所述方法,对空白香蕉全蕉和果蕉肉样品进行处理,制得空白基质溶液。用空白样品基质稀释成0.001、0.01、0.02、0.05、0.1 µg/mL标准溶液,过0.22 µm有机膜,进样。以峰面积对进样浓度制作标准曲线（表4）,结果表明,吡虫啉和高效氯氰菊酯的溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线在0.001~ 0.1 µg/mL质量浓度范围内线性关系良好（r > 0.9991）。
表4 吡虫啉和高效氯氰菊酯的线性方程、相关系数、检出限和定量限Tab. 4 Linear equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of imidacloprid and β-cypermethrin |
| 化合物 Compound | 基质 Matrix | 线性方程 Linear equation | 线性范围 Linear range /(µg∙mL-1) | r | 检出限 LOD/pg | 定量限 LOQ /(mg∙kg-1) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 吡虫啉 Imidacloprid | 溶剂 Solvent | y=2.15×104x+5.48×103 | 0.001~0.1 | 0.9992 | 1 | 0.01 |
| 蕉肉 Banana pulp | y=7.17×103x-8.2×103 | 0.001~0.1 | 0.9994 | 1 | 0.01 | |
| 全蕉 Whole banana | y=2.17×104x+3.98×104 | 0.001~0.1 | 0.9991 | 1 | 0.01 | |
| 高效氯氰菊酯 β-cypermethrin | 溶剂 Solvent | y=4.98×103x+8×103 | 0.001~0.1 | 0.9992 | 1 | 0.01 |
| 蕉肉 Banana pulp | y=6.22×103x+4.97×103 | 0.001~0.1 | 0.9991 | 1 | 0.01 | |
| 全蕉 Whole banana | y=7.19×103x-8.43×103 | 0.001~0.1 | 0.9993 | 1 | 0.01 |
2.4 方法的精密度和加标回收率
称取空白样品加入一定量吡虫啉、高效氯氰菊酯混合标准溶液,每个添加浓度重复5次。按照1.2节所述方法进行实验,采用基质匹配标准曲线进行定量。吡虫啉和高效氯氰菊酯在全蕉和蕉肉中的回收率为84.91%~104.78%;相对标准偏差（RSD）为1.23%~9.69%（表5）。该方法的准确度和精密度符合农药残留分析要求。
表5 吡虫啉和高效氯氰菊酯的回收率和精密度（n=5）Tab. 5 Recoveries and precisions of imidacloprid and β-cypermethrin (n=5) |
| 化合物 Compound | 添加水平 Spiked level/(mg∙kg-1) | 蕉肉 Banana pulp | 全蕉 Whole banana | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 回收率 Recovery/% | 相对标准偏差 RSD/% | 回收率 Recovery/% | 相对标准偏差 RSD/% | ||
| 吡虫啉 Imidacloprid | 0.01 | 101.69 | 4.36 | 96.64 | 2.32 |
| 0.05 | 96.81 | 3.25 | 84.91 | 1.93 | |
| 0.10 | 104.78 | 1.28 | 104.37 | 2.39 | |
| 高效氯氰菊酯 β-cypermethrin | 0.01 | 99.54 | 1.23 | 101.22 | 6.01 |
| 0.05 | 89.20 | 6.94 | 103.67 | 9.69 | |
| 0.10 | 104.00 | 3.28 | 99.27 | 1.58 | |
3 讨论
基质效应即样品中其他组分对目标化合物测定结果的影响,是UPLC-MS/MS检测过程中影响方法精密度、准确度和灵敏度的主要原因[20]。本研究中,采用基质匹配标准溶液制作曲线对样品中的农药残留进行定量,最大限度的减少了基质效应对实验结果带来的影响。
QuEChERS是目前果蔬农药残留分析中最常用的前处理方法,其原理是利用净化剂与样品中杂质间的相互作用,吸附杂质而达到净化的目的。其主要操作步骤为：样品经乙腈提取,氯化钠和无水硫酸镁盐析分层,PSA吸附净化,过膜得待测液。本研究基于香蕉全蕉和蕉肉基质对QuEChERS方法进行优化：首先,在提取剂中加入少量酸性溶液,结果表明农药的回收率显著提高。李俊芳等[14]运用该法测定苹果中农药残留时,发现1%乙酸乙腈为提取剂,农药的回收率和相对标准偏差均优于原创方法（乙腈为提取剂）。主要是因为1%乙酸乙腈与加入的醋酸盐形成醋酸-醋酸钠缓冲溶液,使得提取液pH控制在5左右,有利于农药的提取。其次,对净化剂进行选择,并对其用量进行优化。净化时加入一定量PSA和GCB,能有效去除样品中糖类、有机酸、色素等成分,干扰物质的去除有利于降低方法检出限,提高试验结果准确度。
本研究建立了一种利用改进的QuEChERS为前处理方法,样品经1%乙酸乙腈提取,PSA和GCB混合吸附剂净化,结合UPLC-MS/MS对香蕉全蕉和蕉肉中吡虫啉和高效氯氰菊酯同时进行定性定量分析。采用基质匹配标准曲线进行定量,在0.001~0.1 µg/mL范围内,吡虫啉和高效氯氰菊酯线性关系良好,相关系数r > 0.9991。方法平均回收率为84.91%~104.78%,RSD为1.23%~9.69%;检出限为1 pg,定量限为0.01 mg/kg。该法前处理操作简单、溶剂用量少,方法的精密度、准确度和灵敏度均符合残留试验要求,为香蕉中吡虫啉和高效氯氰菊酯残留分析研究提供参考。