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2019 , Vol. 40 >Issue 4: 715 - 723

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.014

Biotechnology and Tissue Cultures

Rapid Propagation of Standard Cut Chrysanthemum ‘Baishan’

  • ZHOU Ting 1, 2 ,
  • YANG Huiting 1 ,
  • HU Jihong 1 ,
  • ZHU Mengzhu 1 ,
  • HONG Rongqin 3 ,
  • PAN Dongming 1 ,
  • SHE Wenqin , 1, ** ,
  • CHEN Guixin , 1, **
Expand
  • 1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China
  • 2. Forest Seedling General Station of Fujian Province, Fuzhou, Fujian 350002, China
  • 3. Youxi Sanye Flower Limited Company, Youxi, Fujian 365100, China

Received date: 2018-06-12

  Request revised date: 2018-11-22

  Online published: 2019-05-21

Copyright

Copyright reserved © 2019. Office of Acta Agronomica Sinica All articles published represent the opinions of the authors, and do not reflect the official policy of the Chinese Medical Association or the Editorial Board, unless this is clearly specified.
Fold

Abstract

Using terminal buds and stems with axillary buds as the explants, the technology of tissue culture and rapid propagation of standard cut chrysanthemum ‘Baishan’ was studied. The best sterilization conditions of apical bud explants and axillary buds was 75% alcohol 30 s+0.1% HgCl2 for 3 min and 4 min. The best primary culture medium of ‘Baishan’ was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L with the best inducing effect rate 100% and average single bud induction 1.69. The optimal proliferation medium was MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L with multiplication coefficient 3.05, effective rate of bud 65.26% and average height 3.22 cm cultivated 30 d after. The 1/2MS medium supplemented with NAA and IBA could induce rooting in bottles, and the rooting rate was 100%. It could root outside bottles. The buds was inserted into the substrate after 5 minutes of immersion in the NAA solution, and the rooting condition was good. The results could be applied directly for production popularization of ‘Banshan’. The results could provide theoretical and technical guidance for the large-scale promotion and industrialization of ‘Baishan’ and standardized production of seedlings.

Key words： standard cut chrysanthemum; Chrysanthemum ‘Baishan’; tissue culture and rapid propagation

Cite this article

ZHOU Ting , YANG Huiting , HU Jihong , ZHU Mengzhu , HONG Rongqin , PAN Dongming , SHE Wenqin , CHEN Guixin . Rapid Propagation of Standard Cut Chrysanthemum ‘Baishan’[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2019 , 40(4) : 715 -723 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.014

‘白扇’（Chrysanthemum‘Baishan’）是优良的白色单头切花菊品种,主要出口至日本和韩国,是上述国家举行葬礼和祭祖拜神的必需品。在6—9月,日本白菊市场基本被夏菊品种‘白扇’占据,因而研究该品种的繁殖和栽培技术,特别是组培快速繁殖技术对于开拓日本夏菊市场具有重要的经济意义。
我国种植的‘白扇’种苗均从日本购入,由于种苗市场垄断,生产成本高,难以进行大规模推广应用。‘白扇’侧芽易萌发开花,且多次扦插繁殖容易造成品种退化,种植者难以长期自主扦插繁殖。目前我国尚没有关于单头切花菊‘白扇’组培与快速繁殖技术的研究,而通过本研究所建立的单头切花菊新品种的组培快繁体系,对打破优质单头菊种苗的垄断、加速引进的单头切花菊优良品种产业化提供优质种苗和技术支持,具有重要的理论意义和实践价值。
王蔚林[1]以2个传统名贵菊花品种的叶片和花蕾为外植体进行研究,获得了高效再生体系。王卉等[2]对13个品种的地被菊进行组织培养,并以不同的部位作为外植体进行试验,发现以茎尖及腋芽作为外植体时,均能直接诱导产生不定芽,而其他部位需要经过脱分化形成愈伤组织,再分化成新的植株。杨玉萍等[3]的研究表明,以根、叶片、叶柄为外植体分化不定芽,不定芽的诱导率最高。菊科植物的无菌系建立和增殖培养通常采用MS培养基或MS改良培养基[4]。Renou等[5]试验结果显示,6-BA和NAA为菊花再生的最适生长调节剂,目前菊花组培中这2种生长调节剂的使用也较多,KT、2, 4-D、TDZ也有一些应用。唐焕伟等[6]将无根的食用菊试管苗用生长素处理后扦插至珍珠岩中,期间注意保持空气湿度和土壤湿度,30 d后成活率达95%。
近年来国内外研究者利用杂交育种、基因工程等技术开发和培育了许多性状优良的菊科花卉新品种[7,8]。优良的新品种既需要数量上的快速增殖,也需要性状上的稳定保持,可以依靠植物组培快繁技术解决这一问题。目前菊科花卉的离体快繁研究日益成熟,但也有大量研究表明,由于每个品种的基因型不同,其离体再生体系没有普遍性[9]。因此启动了本研究,建立单头切花菊‘白扇’的组培快繁体系,内容主要包括外植体的选择和消毒、植物激素的选择与配比、培养条件的调节等方面。

1 材料与方法

1.1 材料

单头切花菊‘白扇’原种插穗由福建省尤溪县三叶花卉有限公司从北京延庆县永宁盛世鼎新菊苗场购买,插穗经扦插形成种苗植株,掐取长度10 cm的插穗为实验材料。

1.2 方法

1.2.1 初代培养 将‘白扇’插穗剪去叶片,切成1~1.5 cm的茎段,用1%雕牌洗衣粉溶液浸泡后用流水冲洗90 min,再用蒸馏水冲洗2次;将顶芽和带腋芽茎段分别转移至消毒过的三角瓶中,移到超净工作台,倒入75%酒精浸泡并不断搅动30 s,用无菌水冲洗数次,再加入0.1%升汞溶液进行消毒,设置5个不同时间（2、3、4、5、6 min）的消毒处理,最后用无菌水冲洗5次。将顶芽和带腋芽茎段接种于附加不同浓度6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L）一一组合至含30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂的MS培养基上,培养基的pH为5.8~6.0,培养条件：温度(25±2)℃,光照强度2000~3000 lx,光照时间12 h/d;每瓶接种1个外植体,每个处理接种30瓶,重复3次,于接种后20 d统计污染率和成活率,其中污染率=污染的外植体数/接种总外植体数×100%,成活率=成活的外植体数/接种总外植体数×100%。接种后30 d统计芽诱导率、单芽总数,并观察外植体的生长状况,其中芽诱导率=诱导出芽的外植体数量/接种总外植体数×100%,单芽总数=培养30 d后瓶内有效单芽总数。
1.2.2 增殖培养 由于大田插穗分化较完全,而无菌苗各个部分均十分幼嫩,故增殖培养不再区分顶芽和腋芽。取初代培养中生长状态一致的无菌苗,切成1~1.5 cm左右的带芽茎段,接种至不同激素浓度的增殖培养基中,其中6-BA的浓度为1.0、1.5、2.0 mg/L,NAA为0.05、0.10、0.15 mg/L。培养基分为MS、1/2MS、1/4MS三种,一一组合成L9(34)的正交试验设计。培养条件同1.2.1;每个处理接种30瓶,每瓶接种5个带芽茎段,重复3次,接种后30 d统计增殖系数和苗的生长情况,其中增殖系数=增殖培养后瓶内总芽数/接种时的总芽数,有效芽率=有效芽数（株高≥1.0 cm）/增殖30 d后瓶内总芽数×100%,株高（cm）=试管苗基部至顶芽的长度;用Excel 2003软件和SPSS 17.0软件进行数据处理。将初代培养中生长状态一致的无菌试管苗切成1~1.5 cm左右的带芽茎段,转接至最佳增殖培养基（MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L）中,培养条件同1.2.1;光照时间设置3个处理：8、12、16 h/d,每个处理接种30瓶,每瓶接种5个芽,重复3次;接种后30 d统计增殖系数、有效芽率和平均株高（计算方法同1.2.1）。
1.2.3 瓶内生根培养 生根培养基配方采用两因素（NAA/IBA）四水平设计,基本培养基为1/2MS,仅添加NAA（0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L）4个处理和仅添加IBA（0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L）4个处理以及空白对照;将继代培养中生长状态基本一致的无菌苗切成2 cm左右的切段,接种至生根培养基中,培养条件均同1.2.1;每个处理接种30瓶,每瓶接3个芽,重复3次,接种后20 d观察并统计生根情况,瓶内生根率=生根苗总株数/接种总株数×100%,数据处理同1.2.2。
1.2.4 瓶外扦插生根培养 分别探讨生根剂配方和基质配比对无菌苗生根的影响。选取继代培养基中生长健壮、株高整齐度较高（5~6 cm）的未生根无菌苗,将培养瓶移到自然条件下松开瓶盖,炼苗1 d,再开盖加入少量无菌水,再炼苗7 d。从瓶中小心取出无菌苗,从其基部剪下,基部用NAA（50、100 mg/L）和ABT生根粉（500 mg/L）分别浸蘸5 min后,插入无菌的移栽基质（蛭石、蛭石:珍珠岩=1:1、草炭土:蛭石=2:1、草炭土:蛭石:珍珠岩=2:1:1）中,浇透水,移到温室中。每个处理96株。昼夜温度为25 ℃/20 ℃,空气湿度为90%,基质保持水分充足,每隔3 d观察一次,扦插后7 d统计扦插生根率,扦插生根率=扦插生根总株数/扦插总株数×100%。
1.2.5 生根苗的炼苗与移栽 分别探讨不同炼苗时间和移栽基质对生根苗的移栽效果的影响。对生根培养基培养20 d后的植株进行炼苗,对生根苗先松盖1 d后开盖2、4、6、8 d再移栽的方式进行炼苗,小心清洗无菌苗根部附着的培养基,移栽到无菌基质（草炭土、草炭土:蛭石=2:1、草炭土:珍珠岩=2:1、草炭土:蛭石:珍珠岩= 3:1:1）中,每个处理96株,移栽后15 d统计移栽成活率,移栽成活率=移栽成活总株数/移栽总株数×100%。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 初代培养

2.1.1 消毒时间对外植体消毒效果的影响 不同消毒时间对顶芽和腋芽外植体的消毒效果有明显差异。顶芽以0.1%升汞溶液消毒3 min消毒效果最好,消毒3 min和消毒4 min的污染率均为2.2%,其中消毒3 min后顶芽的成活率最高,达到96.7%。用0.1%升汞溶液消毒6 min后,污染率为0,但由于消毒时间过长造成毒害,成活率仅为30%。用0.1%升汞溶液消毒带腋芽茎段4 min为最佳消毒时间,此时成活率达92.2%,污染率为4.4%。消毒5 min时的污染率为1.1%,但成活率仅为82.2%。消毒6 min时的污染率为0,但成活率迅速下降至55.5%。因此,以0.1%升汞溶液为消毒剂,顶芽外植体的最佳消毒时间为3 min,带腋芽茎段的外植体最佳消毒时间为4 min。具体情况见表1。
表1 不同消毒时间对顶芽和腋芽外植体的消毒效果

Tab. 1 Effects of sterilizing time on sterilizing of terminal buds and lateral buds as explants

消毒部位
Sterilization site		 消毒时间
Disinfection time/min		 平均污染率
Average pollution rate/%		 平均成活率
Average survival rate/%
顶芽
Terminal buds		 2 25.6a 74.4b
3 2.2b 96.7a
4 2.2b 86.7a
5 1.1c 57.8c
6 0.0c 30.0d
腋芽
Axillary buds		 2 37.8a 61.1b
3 14.4b 85.6a
4 4.4c 92.2a
5 1.1c 82.2a
6 0.0c 55.5b

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences between treatments (P<0.05).

注：同列数据不同小写字母表示处理间差异显著（P <0.05）。

2.1.2 激素配比对无菌苗诱导的影响 以顶芽作为外植体接种至不同激素配比的初代培养基中,以探讨激素的种类和浓度对无菌苗诱导的影响,结果见表2。接种后30 d,在所有组合培养基中外植体基部均会产生愈伤组织,但分化情况出现差异。当NAA浓度为0.2、0.3 mg/L时,诱导的愈伤组织数量较多,说明NAA浓度较高不利于顶芽的萌发和不定芽的诱导,容易产生畸形芽或玻璃化;当NAA浓度为0.1 mg/L时,6-BA浓度在0.5~1.5 mg/L之间时,均能诱导出大量无菌苗,当6-BA浓度为1.0、1.5 mg/L时,芽诱导率均为100%,产生的无菌苗健壮、叶色浓绿,基部的愈伤组织呈浅绿色,并能分化出数量较多的不定芽,其中6-BA浓度为1.0 mg/L时芽诱导率（100%）和单芽总数（1.69个）均达到最大。为了进一步说明激素配比对外植体无菌苗诱导的影响,利用SPSS软件对初代培养中芽诱导率及单芽总数的数据进行方差分析。经过整理运算,P<0.05,即在a=0.05水平上,各组的方差具有显著性差异。综上所述,切花菊‘白扇’的最佳初代培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。
表2 6-BA和NAA配比对无菌苗诱导的影响

Tab. 2 Effects of different combinations of 6-BA and NAA on induction of sterile plantlets

处理
Treatment		 6-BA/
(mg·L-1)		 NAA/
(mg·L-1)		 平均芽诱导率Average shoot induction rate/% 平均单芽总数
Average number of single buds		 生长状况
Growth status
1 0.5 0.1 98.9a 1.16b 无菌苗较细弱,叶片黄绿色,基部有浅绿色愈伤组织
2 0.5 0.2 23.3d 0.27e 无菌苗诱导时间长,大部分分化为愈伤组织,苗生长缓慢,无菌苗出现部分玻璃化,基部较多愈伤组织
3 0.5 0.3 3.3e 0.08f 大量愈伤组织,部分轻微褐化,大部分分化为愈伤组织,无菌苗数量稀少,且出现畸形,玻璃化严重
4 1.0 0.1 100.0a 1.69a 无菌苗健壮,叶片浓绿,生长速度快,基部有黄绿色愈伤组织
5 1.0 0.2 36.7c 0.40d 芽少,无菌苗诱导慢,长势较差,基部大量愈伤组织
6 1.0 0.3 23.3d 0.26e 芽少,无菌苗长势差,部分畸形,基部大量愈伤组织
7 1.5 0.1 100.0a 1.24b 无菌苗健壮,叶片浓绿,生长速度较快,基部较少黄绿色愈伤组织
8 1.5 0.2 45.6b 0.52c 芽较少,无菌苗较低矮,愈伤组织较多
9 1.5 0.3 32.2c 0.37de 芽少,无菌苗生长缓慢,小部分叶片畸形,基部有愈伤组织
CK 0 0 1.3e 0.03f 无菌苗长势差,极少数产生不定芽

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between treatments (P<0.05).

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

2.2 增殖培养

2.2.1 培养基配方对无菌苗外植体增殖培养的影响 由表3可见和图1,在所有不同配方的培养基中,外植体基部均产生少量愈伤组织,但各处理间外植体的生长情况差异明显。处理1（6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L）、处理6（6-BA 1.5 mg/L+ NAA 0.15 mg/L）、处理8（6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L）生长速度较快,植株健壮,叶片较大且叶色浓绿,其中以处理6的长势最好。处理3（6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L）、处理5（6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L）、处理7（6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L）的无菌苗生长速度较慢,植株低矮,且部分无菌苗底部叶片变黄。综上所述,以‘白扇’无菌苗切段作为外植体进行增殖培养,接种至MS+6-BA 1.5 mg/L+ NAA 0.15 mg/L中增殖系数最高,为3.05。
表3 培养基配方对无菌苗外植体增殖培养的影响

Tab. 3 Effects of different formula of media on multiplication of sterile plantlets

处理
Treatment		 6-BA
/(mg·L-1)		 NAA
/(mg·L-1)		 基本培养基
Basic
medium		 生长状况
Growth Status		 平均有效芽率
Average effective germination rate/%		 增殖系数均值
Mean value of
proliferation coefficient
1 1.0 0.05 MS 无菌苗较健壮,茎干较细,叶片浓绿,生长速度较快,基部少量愈伤组织 57.48b 2.81b
2 1.0 0.10 1/2MS 无菌苗叶片较小,呈翠绿色,生长速度较快,基部少量愈伤组织 48.69c 2.13e
3 1.0 0.15 1/4MS 无菌苗生长十分缓慢,叶片窄小,部分底部叶片变黄,基部少量愈伤组织 36.30e 1.79f
4 1.5 0.05 1/2MS 无菌苗茎干细长,叶片翠绿,生长速度较慢,基部少量愈伤组织 41.88d 2.60c
5 1.5 0.10 1/4MS 无菌苗低矮细弱,生长十分缓慢,部分底部叶片变黄,基部少量愈伤组织 35.97e 1.64g
6 1.5 0.15 MS 无菌苗健壮,叶片浓绿,生长速度快,基部少量愈伤组织 65.26a 3.05a
7 2.0 0.05 1/4MS 无菌苗低矮,生长十分缓慢,部分底部叶片变黄,基部有愈伤组织 27.98f 1.55g
8 2.0 0.10 MS 无菌苗健壮,叶片浓绿,生长较快,基部少量愈伤组织 56.53b 2.43d
9 2.0 0.15 1/2MS 无菌苗较健壮,叶片呈翠绿色,生长速度一般,基部少量愈伤组织 56.63b 2.11e

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between treatments (P<0.05).

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

图1 不同增殖培养基中第45天的生长状态

A：处理1;B：处理3;C：处理5;D：处理6。

Fig. 1 Growth status of different value-added media after 45 days

A: Proliferation culture 1; B: Proliferation culture 3; C: Proliferation culture 5; D: Proliferation culture 6.

2.2.2 培养基配方对无菌苗有效芽率的影响 由表3可见,在各处理间有效芽率差异较大,其中处理6的平均有效芽率最高,高达65.26%,处理7的有效芽率最低,仅为27.98%。通过比较R值发现,培养基中的3个因素对有效芽率的影响大小依次为：基本培养基>NAA>6-BA。
用SPSS软件对有效芽率进行分析,P>0.05,即在a=0.05水平上9组配方之间不存在显著性差异,方差具有齐次性,因此接下来采用LSD法进行数据分析。NAA和基本培养基对‘白扇’有效芽的诱导率具有显著性差异（P<0.05）,6-BA对有效芽的诱导率不具有显著性差异（P>0.05）。对F值进行对比可知,3个因素的影响力大小依次为：基本培养基>NAA>6-BA。
综合以上结果,MS+6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.15 mg/L、MS+6-BA 1.5 mg/L+ NAA 0.15 mg/L和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L均有利于切花菊‘白扇’有效芽的诱导。因此,根据经济性原则MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L最有利于获得增殖系数最大的‘白扇’增殖无菌苗。
2.2.3 光照时间对无菌苗增殖培养的影响
将初代培养得到的无菌苗切成1~1.5 cm左右的带芽茎段,接种至最佳激素组合的增殖培养基中（MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L）,光照时间处理为8、12、16 h/d,接种后30 d统计增殖系数、有效芽率及平均苗高。由表4可知,在3个处理中,处理2（光照12 h/d）与处理3（光照16 h/d）的无菌苗最为健壮,生长速度较快,其中处理3的增殖系数和有效芽率均达到最大值,其平均苗高达3.44 cm,与处理1（光照8 h/d）之间极差达到2.02 cm,有效芽率与处理1之间极差达23.01%。
表4 光照时间对无菌苗增殖的影响

Tab. 4 Effects of lighting time on multiplication of sterile plantlets

处理
Treatment		 光照时间Illumination time/(h·d-1) 平均增殖系数
Average proliferation coefficient		 平均有效芽率Average effective germination rate/% 平均苗高
Average seedling height/cm		 生长状况
Growth status
1 8 2.38b 47.08c 1.42c 无菌苗叶片翠绿,生长速度缓慢
2 12 3.05a 65.26b 3.22b 无菌苗健壮,叶片浓绿,生长速度较快
3 16 3.17a 70.09a 3.44a 无菌苗健壮,叶片较大,生长速度快
极差 0.79 23.01 2.02

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between treatments (P<0.05).

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

进一步对数据进行方差分析和多重比较得出,各组数据方差均具有齐次性,不同光照时间对增殖系数、有效芽率及平均芽高均有显著性影响。切花菊‘白扇’增殖培养的最佳光照时间为16 h/d。综上所述,切花菊‘白扇’的最佳增殖培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L,增殖培养的最佳光照时间为16 h/d。

2.3 瓶内生根

将增殖培养产生的无根苗,切成2 cm左右的切段,接种至不同激素配比的生根培养基中,接种20 d后观察并统计生根情况（图2）。由表5可见,培养基中添加生长素,对促进无根苗生根具有良好效果,在生根率、生根根数、根长及根系粗细程度上,均起到促进作用,对照组CK的生根率为96.67%,而添加了生长素的培养基中生根率均达100%,且根系生长粗壮。对以上数据用SPSS软件进行分析,结果表明：不同浓度的NAA之间,生根率、根数、根长均没有显著性差异;不同浓度的IBA之间,上述各个指标亦均不存在显著性差异。添加NAA的培养基上,根系较添加IBA的处理组粗壮,但生根根数、根长均略低于IBA处理组。综上所述,NAA和IBA均适合进行‘白扇’无根苗的生根。
图2 不同生根培养基第20天的生根情况

A：对照组;B：处理2;C处理6。

Fig. 2 Rooting situation of different rooting media after 20 days

A: Rooting culture CK; B:Proliferation culture 2; C: Proliferation culture 6.

表5 激素配比对瓶内生根的影响

Tab. 5 Effects of combinations of plant regulators on rooting of root-free plantlets in vitro

处理
Treatment		 NAA/
(mg·L-1)		 IBA /
(mg·L-1)		 生根率
Rooting rate/%		 平均根数
Average number of roots		 平均根长
Average root length/cm		 根系粗细
Root thickness
CK 0 0 96.67 5.3 1.3 细
1 0.05 0 100 15.2 2.2 粗
2 0.10 0 100 15.2 2.3 粗
3 0.15 0 100 15.0 2.3 粗
4 0.20 0 100 15.4 2.2 粗
5 0 0.05 100 15.9 2.9 较粗
6 0 0.10 100 16.2 2.7 较粗
7 0 0.15 100 16.1 2.6 较粗
8 0 0.20 100 16.0 2.7 较粗

2.4 瓶外生根培养

从表6可看出,无菌苗用50、100 mg/L的NAA溶液处理5 min后,扦插的成活率和生根率均达为96.9%,平均生根数分别为18.7和19.0根,用ABT生根粉500 mg/L浸蘸后,成活率和生根率均为93.8%,平均生根数为12根,略低于其他两组处理。因此,‘白扇’无菌苗的最佳瓶外扦插生根剂为NAA 50 mg/L和NAA 100 mg/L。
表6 生根剂对无菌苗瓶外生根的影响

Tab. 6 Effect of root ingredient on the roots outside sterile bottle

处理
Treatment		 生根率
Rooting rate/%		 平均生根数
Average number of roots
NAA 50 mg/L 96.9 18.7a
NAA 100 mg/L 96.9 19.0a
ABT生根粉500 mg/L 93.8 12.0b

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between treatments (P<0.05).

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

移栽后5 d,观察到4种不同配比的扦插基质中,无根苗均开始生根;移栽后7 d统计成活率及生根率。由表7可见,无根苗在4种扦插基质中的生根情况存在一定差异。其中,扦插到蛭石、蛭石:珍珠岩=1:1的无根苗成活率和生根率最高,均为96.9%,但蛭石:珍珠岩=1:1这个组合的平均生根根数较多,达14根。因此,‘白扇’无菌苗的最佳扦插基质为蛭石:珍珠岩=1:1。
表7 基质配比对无菌苗瓶外生根的影响

Tab. 7 Effect of matrix ratio on rooting outside sterile bottle

处理
Treatment		 成活率
Survival rate/%		 平均生根数
Average number of roots
蛭石 96.9 12.7
蛭石:珍珠岩=1:1 96.9 14.0
草炭土:蛭石=2:1 87.5 11.3
草炭土:蛭石:珍珠岩=2:1:1 93.8 12.0
综上所述,瓶外扦插生根的最佳处理为将5 cm左右的无根苗基部用生根剂NAA 50 mg/L或NAA 100 mg/L处理浸蘸5 min后,扦插至蛭石:珍珠岩=1:1的组合基质中进行培养。

2.5 炼苗移栽

2.5.1 炼苗时间对生根苗移栽效果的影响 将生根培养20 d左右的无菌苗移到自然条件下,分别进行不同时间的炼苗后,移栽至草炭土:蛭石:珍珠岩=3:1:1的基质组合中,移栽后25 d统计成活率。从表8中可知,松盖1 d后开盖6 d的炼苗效果最好,移栽成活率达100%,松盖1 d后开盖2 d的成活率最低,为88.54%,这可能是由于炼苗时间过短,无菌苗没有充足的时间适应复杂的外界环境,导致移栽后部分小苗出现萎蔫,最终枯死。松盖1 d后开盖8 d的成活率为91.67%,在炼苗过程中部分培养基发生污染,植株根系较绵软,移栽时易发生断根。因此,生根苗的最佳炼苗方式为：松开瓶盖炼苗1 d,再开盖炼苗6 d。
表8 炼苗时间对生根苗移栽效果的影响

Tab. 8 Effect of time of domestication on transplantingof rooted plantlets

炼苗天数
Days of
refining/d		 移栽株数
Number of
transplanted plants		 成活株数
Number of living plants		 成活率
Survival rate/%
2 96 85 88.54
4 96 93 96.90
6 96 96 100.00
8 96 88 91.67
2.5.2 基质配比对生根苗移栽效果的影响 将生根培养20 d左右的无菌苗移到自然条件下进行松盖炼苗1 d,再开盖炼苗6 d后,移栽至4种基质配比的基质中,移栽后20 d统计成活率和观察小苗的生长状态（图3）。由表9可见,生根苗在草炭土:蛭石=2:1、草炭土:珍珠岩=2:1和草炭土:蛭石:珍珠岩=3:1:1这3种移栽基质中的成活率均为100%,其中草炭土:蛭石:珍珠岩= 3:1:1这个组合小苗的生长情况最佳,恢复迅速,且顶端有新叶长出,叶片大,叶色翠绿。4种移栽基质中,草炭土的移栽效果最差,成活率为93.75%,在移栽过程中出现无菌苗易倒伏的情况。因此,生根苗的最佳移栽基质为草炭土:蛭石:珍珠岩=3:1:1。
表9 不同基质配比对生根苗移栽效果的影响

Tab. 9 Effect of combinations of media on transplanting of rooted plantlets

移栽基质
Transplanting matrix		 移栽株数
Number of transplanted plants		 成活株数
Number of living plants		 成活率
Survival rate/%		 生长情况
Growing situation
草炭土 96 90 93.75 小苗恢复较慢,长势较差
草炭土:蛭石=2:1 96 96 100.00 小苗恢复良好,长势较好
草炭土:珍珠岩=2:1 96 96 100.00 小苗恢复良好,长势较好
草炭土:蛭石:珍珠岩=3:1:1 96 96 100.00 小苗恢复迅速,长势良好
图3 炼苗及移栽

A：开盖炼苗;B：4种移栽基质;C：移栽后20 d。

Fig. 3 Plantlet acclimatization and transplant

A: Seedling hardening; B: Four types of substrates; C: 20 days after transplanted.

综合以上分析,生根苗的最佳移栽方式为：先松开瓶盖炼苗1 d,再开盖炼苗6 d,清洗掉根系上附着的琼脂,最后移栽到草炭土:蛭石:珍珠岩=3:1:1的基质中。

3 讨论

组培快繁具有繁殖速度快、培养周期短、保持母本优良性状且不受地域、季节限制的优点,被广泛应用到花卉种苗的工厂化生产中,对于一些繁殖系数低或新引进培育的花卉品种进行组培快繁,可以短期内获得大量基因型一致的优质苗木[10,11]。
菊科植物常用的再生体系有2种,分别为诱导外植体直接分化不定芽成为新植株和诱导愈伤组织再分化这2种途径。大多数的研究者认为,由茎段或叶片作为外植体直接诱导不定芽,能较好的保持原有的遗传性状,避免变异和嵌合体的发生。Shinoyama等[12]研究表明通过愈伤组织途径建立再生体系需要143~180 d,而不定芽直接诱导再生体系仅需80~120 d,且愈伤诱导体系比不定芽诱导体系的再生率低。本研究采用直接分化不定芽的方法,以‘白扇’的顶芽和腋芽为外植体建立无菌株系,得出如下结果：顶芽外植体的最佳消毒条件为75%酒精30 s+0.1%升汞溶液消毒3 min;带腋芽茎段的最佳消毒条件为75%酒精30 s+0.1%升汞溶液消毒4 min;在初代培养中,以顶芽诱导无菌苗或不定芽的效果比带腋芽茎段更好,因此,顶芽为初代培养的最佳外植体;‘白扇’的最佳初代培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L。
在植物组织培养中将不同的植物生长调节剂进行组合搭配使用,会比单独使用效果更佳。程蕾洁[13]研究发现,在对外植体的诱导过程中,用不同浓度的6-BA和NAA进行组合比单一的采用6-BA对芽的萌发率影响更大。本研究结果表明,‘白扇’无菌苗的增殖培养的最佳增殖培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L。并且随着光照时间的延长,无菌苗的株高也随之增加,当光照时间为16 h/d时,平均株高均高于8 h/d和12 h/d,且无菌苗生长健壮、叶面积增大,这一结果与Adams等[14]和Kurilčik等[15]的研究结果一致。
菊科植物为较易生根的草本植物,生根周期较短,在组培快繁中一般将无根试管苗接种至添加了NAA、IBA或IAA生长素的培养基中,诱导试管苗不定根产生,再进行驯化移栽。陈燕梅[16]、王丽华[17]等研究表明,1/2MS培养基较MS培养基、1/4MS培养基更利于菊科花井的生根培养。本研究得出,只要添加了生长素的1/2MS培养基均能诱导‘白扇’无根苗生根,生根率达100%。无菌苗的驯化炼苗对其出瓶成活率起到关键作用,炼苗可以使无菌苗植株从恒温、恒湿、无菌、高养分的环境逐渐过渡到复杂的自然环境中。经炼苗移栽,即将‘白扇’生根的无菌苗经松盖1 d,开盖6 d进行炼苗,移栽到基质为草炭土:蛭石:珍珠岩=3:1:1的穴盘中,移栽15 d后成活率达100%;草炭土:蛭石:珍珠岩=3:1:1为最佳移栽基质,移栽20 d后成活率达100%,小苗恢复迅速,长势良好。
本研究不仅开展了有根试管苗的露地移栽,还尝试了无根苗的瓶外生根试验。结果表明,瓶外扦插生根的最佳处理为将5 cm左右的无根苗基部用生根剂NAA 50 mg/L或NAA 100 mg/L处理浸蘸5 min后,扦插至蛭石:珍珠岩=1:1的组合基质中进行培养。无根苗直接生根可以进一步减少移苗步骤和移栽成本,可以快速的生产‘白扇’种苗,并且在实际应用中可以将瓶苗直接交给切花菊生产企业,由生产者自主安排扦插时间,减少运输成本和能源消耗,做到种植季节种苗的持续供应。
本研究的不足之处在于诱导的试管苗没有经过变异检测,因此下一步的研究需要进行田间观察和分子鉴定,以确保繁育过程中种苗的一致性与高质量。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

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