阿希蕉（Musa velutina）,又名朝天蕉,是姜目芭蕉科芭蕉属的植物。关于阿希蕉的拉丁文名,有些国内的报道认为是Musa rubra Wall. ex Kurz,但综合国外多个文献对Musa rubra及Musa velutina植株形态的描述,阿希蕉的阿拉丁文名应该为Musa velutina[1,2,3,4]。芭蕉属（Musa）植物一般分为5个组：分别Eumusa（2n=22）、Rhodochlamys（2n=22）、Callimusa（2n=20）、Australimusa（2n=20）、Ingentimusa（2n=14或18）[5]。Rhodochlamys组植物的特征是花序直立或下垂,果序直立指向花序顶端,具有观赏价值[6],Rhodochlamys分布区域有限,仅在印度-老挝、柬埔寨-中国一带[7],阿希蕉属于Rhodochlamys一类,起源于印度阿萨姆的亚热带常绿森林,分布于印度、缅甸、泰国等地,多生长在阴湿沟谷底和半沼泽地[8]。阿希蕉假茎细且矮,约高1.1~1.6 m,叶片间生长紧凑,花序直立或上举,花苞色红鲜艳,果序亦为直立状,果实小巧饱满,呈紫红色,果内有不规则多棱形种子[9]。
目前关于阿希蕉的研究报告大多集中在资源收集、利用、分类和形态描述[10,11,12,13]。虽然野生香蕉大多有种子,但是大多野生香蕉种子发芽率很低,不能形成长期稳定的大群落或只能形成小群落,甚至不能在自然环境里形成群落,只能零星生长几株[14],因此很难依靠阿希蕉种子进行大面积繁殖,目前也尚无人工繁育或组织培养的报道。随着热区种植业的发展,珍贵的野香蕉资源已经日益稀少,甚至濒临灭绝。阿希蕉作为野生资源,一方面可用作遗传育种材料[15],另一方面其花序直立苞片鲜艳,果实冲天长出色呈紫红,具有观赏价值[16],可进一步开发和推广。本研究拟以阿希蕉合生花为植物材料,进行愈伤组织诱导及组培快繁技术研究,以期为阿希蕉的资源利用、繁育和推广打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
选取琼海东红农场和定安黄竹一带野外生长的阿希蕉断蕾期合生花为植物材料。
1.2 方法
1.2.1 外植体消毒 首先将大的花苞片逐个剥除至剩余花苞长度为9~10 cm时,在超净工作台前用75%酒精喷洒表面进行消毒后,转入超净工作台,用尖嘴镊子继续剥除花苞片,至花苞长度为2 cm左右,将花苞片横切成厚度均一的薄片（约1~2 mm）,用手术刀轻轻将薄片转移至愈伤组织诱导培养基上。
1.2.2 愈伤组织诱导 愈伤组织培养基参考张建斌等[17]在巴西蕉未成熟雄花组培快繁的配方：MS+TDZ（0.2 mg/L）+ZT（0.2 mg/L）+生物素（1.0 mg/L）+谷氨酰胺（100 mg/L）+糖（40 g/L）。26 ℃黑暗条件培养,每2周继代一次。
1.2.3 芽分化培养 待愈伤组织诱导完成后,将愈伤组织分成均一小块,转移至芽分化培养基上。为了研究不同激素浓度对芽分化的影响,选用6-BA和NAA,设立不同的浓度梯度,6-BA设1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L,4个处理;NAA设0.1、0.2 mg/L,2个处理,共8个处理组合。26 ℃光周期16 h/8 h（光/暗）培养,每2周继代一次,待长出多芽体后统计结果。
1.2.4 芽增殖培养 将多芽体切割成均一的小块芽并转移至芽增殖培养基上。为了研究不同激素浓度对芽增殖的影响,选用6-BA和NAA,设立不同的浓度梯度,6-BA设1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L,4个处理;NAA设0.1、0.2 mg/L,2个处理,共8个处理组合。26 ℃光周期16 h/8 h（光/暗）培养,每2周继代一次,待多芽体上的长出较多的不定芽且长至2~3 cm后统计结果。
1.2.5 生根诱导培养 不定芽经过芽诱导和增殖培养长至2~3 cm后,将不定芽切下,转移至生根培养基进行生根诱导培养。生根培养基选用IBA和NAA,设立不同的浓度梯度,IBA设2.0、3.0、4.0 mg/L,3个处理;NAA设计0.1、0.3、0.5 mg/L,3个处理,共9个处理组合。28 ℃光周期16 h/8 h（光/暗）培养,待根系长出并伸长后统计结果。
待长成健壮的生根苗后,将培养瓶打开瓶盖,放置于温室炼苗1周左右,取出生根苗用自来水清洗去掉根系上所黏附的培养基,栽入含有50%椰糠的基质中,用保鲜膜覆盖,每天定期喷水保湿,约1周后去掉保鲜膜进行正常栽培管理。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织诱导情况
花苞薄切片在愈伤组织诱导培养基上,约1周左右开始膨大,由白色薄切片转成黑褐色,然后逐渐长出白色的细小愈伤,随着培养时间增加愈伤组织增多颜色由白色转成白绿色,30 d左右长出的结构紧密愈伤组织可转入下一步的芽分化培养。除了极个别污染和褐化坏死,愈伤组织诱导率较高,达到90%。
2.2 不同激素组合对芽分化的影响
将诱导出的愈伤组织切成均一小块,接种到8种芽诱导培养基上,约30 d左右陆续分化出芽点,形成多芽体状态（图1A）。观察发现阿希蕉芽分化于培养基上面部分的新芽点较密集且小,而培养基下面部分的芽少且长较大。8个处理出芽结果比较发现7号培养基芽分化诱导率最高,同时3号培养基与7号培养基的芽分化诱导率无显著差异,其他配方培养基与7号培养基芽分化诱导率差异显著。根据结果得出最优化的芽分化诱导培养基配方为MS+6-BA（3.0 mg/L）+NAA（0.1~0.2 mg/L）。
图1 阿希蕉合生花组培快繁过程A：分化诱导多芽体;B：芽增殖伸长;C：生根诱导。 Fig. 1 The tissue culture and rapid propagation process of hopson flower of Musa velutina A: Differentiation and induction of multiple buds; B: Bud proliferation and elongation; C: Rooting induction. |
表1 不同浓度6-BA和NAA组合对芽分化诱导的影响Tab. 1 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on bud induction |
| 培养基 Medium | 6-BA /(mg∙L-1) | NAA /(mg∙L-1) | 芽分化诱导率 Bud inducing rate/% |
|---|---|---|---|
| 1 | 1.0 | 0.1 | 60.0c |
| 2 | 2.0 | 0.1 | 63.3c |
| 3 | 3.0 | 0.1 | 83.3a |
| 4 | 4.0 | 0.1 | 66.7b |
| 5 | 1.0 | 0.2 | 60.0c |
| 6 | 2.0 | 0.2 | 76.7b |
| 7 | 3.0 | 0.2 | 90.0a |
| 8 | 4.0 | 0.2 | 53.3c |
Note: The lowercase letters in the same column indicate significant differences between treatments at 0.05 level (P<0.05). | |
注：同列不同小写字母表示不同处理间存在显著差异(P<0.05)。 |
2.3 不同激素组合对芽增殖的影响
将多芽体转至芽增殖培养基上,芽点逐渐增多,变绿变粗并伸长成不定芽（图1B）,统计结果表明,不同的细胞分裂素和生长素配比对芽增殖有影响,8个处理组合的芽增殖系数在5%~30%之间,差异较大。其中3号、4号和8号培养基的增殖系数较低,多芽体在培养基上随着培养时间的增加多芽体增大但多为白色蓬松状且渐趋玻璃化,芽点难以变绿和伸长,不定芽数少;2号、7号培养基的增殖系数较高,不定芽数多,且生长粗壮,其中2号培养基MS+6-BA（2.0 mg/L）+ NAA（0.1 mg/L）为最优化增殖培养基。
表2 不同浓度6-BA和NAA组合对芽增殖的影响Tab. 2 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on bud proliferation |
| 培养基 Medium | 6-BA /(mg∙L-1) | NAA /(mg∙L-1) | 增殖系数 Proliferation rate/% |
|---|---|---|---|
| 1 | 1.0 | 0.1 | 15 |
| 2 | 2.0 | 0.1 | 30 |
| 3 | 3.0 | 0.1 | 5 |
| 4 | 4.0 | 0.1 | 5 |
| 5 | 1.0 | 0.2 | 10 |
| 6 | 2.0 | 0.2 | 18 |
| 7 | 3.0 | 0.2 | 20 |
| 8 | 4.0 | 0.2 | 5 |
2.4 不同激素组合对生根诱导的影响
将不定芽接种到不同生根诱导培养基上,约10 d左右基部开始膨大,并逐渐长出凸起状的根原基,随着培养时间的推进,继而长出白色根并逐渐伸长,约40 d左右可长出较长的根系（图1C）,生根率均较高,达到86%以上,其中以培养基MS+IBA（3.0 mg/L）+NAA（0.3 mg/L）生根效果最好,其根原基诱导较早,且生根及根毛生长较快,生根诱导率100%,平均每株大约可长出5~6条根。将根系良好的生根苗进行炼苗并移栽至基质,进行良好的水肥护理,成活率可达95%以上。
3 讨论
阿希蕉的种子直接萌发具有延迟和间歇性,萌发耗时9个月,萌发率为78%[18],因此靠常规的播种繁育效率较低。组织培养技术的应用可以突破种子萌发效率低的瓶颈。将阿希蕉合生花薄切片在已报道的巴西蕉愈伤诱导培养基上培养,可诱导出愈伤组织,并能进一步分化出不定芽。在愈伤组织分化出不定芽阶段,已报道的巴西蕉最佳胚性分化培养基为MS+6-BA（4.0 mg/L）+ NAA（0.3 mg/L）,而在本研究阿希蕉芽分化诱导培养基的优化筛选中得出的最优化培养基为MS+ 6-BA（3.0 mg/L）+NAA（0.1~0.2 mg/L）,过高的激素浓度不适宜阿希蕉的芽分化诱导。分化出多芽体后,随着培养时间的增加,多芽体会逐渐增大但多为白色蓬松状且渐趋玻璃化,芽点难以变绿和伸长,因此需要在芽分化诱导后还需要增加芽增殖诱导步骤,对芽增殖培养基配方进行优化筛选,最优化的配方为MS+6-BA（2.0 mg/L）+ NAA（0.1 mg/L）。芽分化培养中的激素浓度较芽增殖培养基中的高,表明在芽诱导前期需要高浓度的激素来触发多芽体的萌发,而随着生长时间的推进,对外源激素浓度的需求降低,高浓度的激素反而不利于不定芽的伸长。
外植体选择、激素种类和配比是植物组培再生体系的关键因素。由于野生香蕉种子大多结实率低,通过吸芽繁殖效率也不高,选用阿希蕉合生花作为材料,对芽分化诱导和增殖培养基激素浓度进行优化筛选,从取材到获得大批量的根系完整的组培苗,大约需要100 d,繁殖效率可达到100株/花苞以上,增殖效率高,可达到快速增殖繁育的目的。