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2019 , Vol. 40 >Issue 2: 314 - 322

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2019.02.015

Biotechnology and Tissue Culture

Establishment of New Protocorm-like Bodies System of Anoectochilus roxburghii by ‘Double Two-steps’ Method

  • JIAO Zhan 1 ,
  • AN Shengjun , 2, * ,
  • SHAO Tiemei 1
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  • 1. Hebei Chemical & Pharmaceutical College / Center of Bioreactor and Protein Drug Research and Development of Hebei Universities, Shijiazhuang, Hebei 050026, China;
  • 2. Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang, Heibei 050091, China

Received date: 2018-08-13

  Request revised date: 2018-10-21

  Online published: 2019-05-16

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Copyright reserved © 2019
Fold

Abstract

In this study, the stem sections of Anoectochilus roxburghii in vitro were used as the material, and the method of ‘double two-step’ was discussed. The ‘two-step-induction’ had the etiolation stem sections induced by dark culture and the protocorm-like bodies induced by etiolation stem sections, and the ‘two-step-proliferation’ had the new PLBs cultured on induction medium for 3 weeks and proliferative culture program optimized by the orthogonal experimental design of L16(4 5). The effects of source and treatment method of explants, dark culture time, medium and additional elements on induction of PLBs, and the effects of culture time, light intensity, and UV irradiation time on proliferation culture were studied. The results showed that, medium which was suitable for the etiolation stem sections to induce PLBs was MS +2.5 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA +1.0 mg/L S3307. The best explant was the etiolation stem sections from leaf axil in dark culture, and most suitable treat method was the whole stem sections horizontally onto the medium. Three weeks dark treatment could improve the induction frequency of PLBs from the tiolation stem sections significantly. The order of effects of the five factors was NH4 +/NO3 ->concentration of NAA>concentration of 6-BA> concentration of S3307>concentration of sucrose. The optional experimental conditions were MS+0.5 mg/L S3307+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+ NH4 +/NO3 -(15 mmol∶45 mmol)+ 40 g/L sucrose, which could get the proliferation fresh weight 246.90 g/L. The optimal proliferation culturing time was 6 weeks. Light intensity 500 lx, and UV irradiation 253.7 nm for 6 h per day for 6 weeks were suitable for PLBs proliferation and accumulation of total flavonoids. New protocorm-like bodies system of A. roxburghii was established by the ‘double two-step’ method. The inducing rate, amplification of initial materials, and proliferation multiple of the method were higher than the index of the traditional single step method. 92% of the PLBs could keep the state of steady proliferation, and not to differentiate nor to formate callus.

Key words： Anoectochilus roxburghii; protocorm-like bodies (PLBs); efficient system; induction; total flavonoids

Cite this article

JIAO Zhan , AN Shengjun , SHAO Tiemei . Establishment of New Protocorm-like Bodies System of Anoectochilus roxburghii by ‘Double Two-steps’ Method[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2019 , 40(2) : 314 -322 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.02.015

金线莲（金线兰）,学名花叶开唇兰[Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.],是兰科开唇兰属珍稀药用植物。近年来,其保肝护肝、抗氧化、抗衰老、提高机体免疫力等药用价值,已引起人们的广泛关注[1,2,3]。自然环境的恶化和人们的过度采挖,使得野生金线莲资源严重匮乏,药材资源供不应求。原球茎是兰科等科属的植物繁殖过程中的一种特殊的胚状结构,组织培养可培育类似原球茎的结构,称为“类原球茎”（protocorm-like bodies,PLBs）。类原球茎培养具有繁殖效率较高,培养周期短的优点。利用组织培养的方法培养类原球茎并从中提取药用植物有效成分是扩大药材资源,拓展药材利用的有效手段。
金线莲类原球茎组织培养已有部分研究[4,5,6],研究内容局限于类原球茎的诱导与增殖的培养基配方[7],以及不同添加物和不同培养条件对类原球茎诱导的影响[8,9],近年来拓展到用类原球茎生产次生代谢产物的研究[10]。以往研究都是通过单步直接诱导,大致分为两种途径：一种是从种子直接获得原球茎[6,7]再进行增殖,但金线莲资源不足,种子量有限,大量应用难以满足生产需求;第二种是从组培苗茎段或茎节直接诱导类原球茎[5, 8]。此途径应用较广,但仍存在许多问题：如初代诱导困难,诱导率低[8, 11-12]。王建勤等[12]利用茎节做接种材料诱导率仅为66%。封应丽等[8]的研究中诱导率提升至73%。韩晓红等[13]以茎段切片为外植体,初步提高材料利用率,诱导率为81%,但仍不够理想。此外,类原球茎增殖培养中常遇到“类原球茎稳定性较差,易分化,易愈伤组织化”的问题[11, 13-14],严重降低其增殖效率,限制类原球茎培养体系在生产次生代谢产物领域的应用。因此,本研究拟探索一种新的方法,即“两步诱导”加“两步增殖”的方法,简称“二加二”法,先诱导白化茎段再诱导类原球茎并使其高效增殖,以期提高诱导率,同时数倍提高初始材料利用率,并进一步构建能够稳定增殖的类原球茎培养系统,为金线莲类原球茎生产药用成分的研究奠定基础,也作为兰科植物的原球茎培养等相关研究的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 金线莲品种为“福建尖叶”,带根组培植株采购于福建金草公司,切取茎段后在本实验室经过连续1 a的继代培养,获得长势基本一致的金线莲组培继代植株。
1.1.2 试剂 植物生长调节剂6-苄氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine,6-BA）、萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid,NAA）、玉米素（Zeatin,ZT）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4- Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D）、激动素（Kinetin,KT）、噻苯隆（Thiazuron,TDZ）、烯效唑（Uniconazole, S3307）,购自上海生工生物工程有限公司。对照品为芦丁（BBI）,化学试剂亚硝酸钠（科密欧）,硝酸铝（科密欧）。
1.1.3 仪器 苏净安泰SW-CJ-2FD型超净台,苏州安泰空气技术有限公司;SJC-Ⅱ型紫外线杀菌车,北京好特光紫外线科技有限公司;SPX-250I-G型微电脑人工气候箱,上海博讯实业有限公司;ZHWY-1102C型恒温培养振荡器,上海智诚分析仪器制造有限公司;UV-5200型紫外-可见分光光度计,上海元析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 “两步诱导”法诱导类原球茎 第一步：外植体的获得。切取金线莲组培继代植株的茎段（外植体来源实验除外）,每茎段带1至2个节,放置于B1培养基（MS + 6-BA 2.0 mg/L +NAA 1.0 mg/L,蔗糖30 g/L,琼脂8 g/L）中,温度27 ℃,黑暗培养3周后（黑暗培养时间试验除外）,收获白化茎段。
第二步：类原球茎的诱导。切取长度为1 cm的白化茎段（每茎段带一个节）,放置于培养基Y1~Y9（待筛选）中,每瓶放置外植体14个,每处理6瓶,重复3次。光照500 lx,光照时间12 h,培养4周,收获类原球茎。Y培养基的筛选：比较9种不同的诱导培养基（表1）,4周后比较类原球茎的诱导率和诱导个数。诱导率=每处理诱导出类原球茎的外植体数/接种外植体数×100%;平均诱导PLB个数=每处理诱导类原球茎的个数/接种外植体数。
表1 金线莲类原球茎诱导培养基筛选

Tab. 1 Selection of induction medium induction medium of PLBs of A. roxburghii mg/L

Medium 6-BA NAA ZT 2,4-D KT TDZ S3307
Y1 2.50 0.20 0.50
Y2 2.50 0.20 0.50 2.00
Y3 2.50 0.20 0.20
Y4 2.50 0.20 0.40
Y5 0.20 0.40 1.00
Y6 0.20 0.40
Y7 0.20 0.20 0.40
Y8 2.50 0.20 1.00
Y9 0.20 1.00
1.2.2 “两步增殖”法使类原球茎增殖 第一步,将“两步诱导”法得到的类原球茎切分为单个小球,接种到新的诱导培养基（Y）中培养3周;第二步,将增殖培养第一步得到的类原球茎切割为直径5 mm左右的小块,将其放置于液体培养基中,每150 mL三角瓶接种50 g,每处理6瓶,采用L16(45)正交试验设计对培养基中激素含量、蔗糖含量以及N素比（NH4+∶NO3-）进行比较,筛选适宜的增殖培养基配方。6周后统计类原球茎的鲜重增长量,鲜重增长量（g）=[每处理获得的类原球茎质量（g）-每处理起始类原球茎接种质量（g）]/每处理样本数。正交试验的表头设计见表2。
表2 L16(45)正交试验设计

Tab. 2 Factors in orthogonal experimental design of L16 (45)

水平
Level		 因素A
Factor A		 因素B
Factor B		 因素C
Factor C		 因素D
Factor D		 因素E
Factor E
S3307/
(mg·L-1)		 6-BA/
(mg·L-1)		 NAA/
(mg·L-1)		 NH4+∶NO3- (mmol : mmol) Sucrose
/(g·L-1)
1 0.50 1.00 0.10 1∶1 (30∶30) 30
2 1.00 2.00 0.20 1∶3 (15∶45) 40
3 1.50 3.00 0.30 1∶5 (10∶50) 50
4 2.00 4.00 0.40 1∶7 (7.5∶52.5) 60
1.2.3 外植体的不同来源比较试验 分别选用普通组培苗茎段,经暗处理3周的组培苗茎段,光照条件下腋生茎段,黑暗3周后腋生的白化茎段,4种不同的外植体来源进行比较,按照1.2.1第二步的培养基Y进行培养,再4周后,统计类原球茎的诱导率。
1.2.4 诱导培养中黑暗处理时间试验 采用0、1、2、3、4、5周的暗培养,诱导出白化茎段,将白化茎段放置于培养基为Y1,再4周后比较各处理的诱导效率和总黄酮得率。
1.2.5 外植体不同处理方式试验 将外植体分别采用整个茎段平放、整个茎段斜插、整个茎段埋入、茎段纵切半平放、茎段纵切半斜插、茎段纵切半埋入、茎片平放、茎片斜插、茎片埋入9种方法,放入培养基,按照1.2.1第二步的方法进行诱导,4周后统计诱导率。
1.2.6 增殖培养时间的确定 分别在0、1、2、3、4、5、6、7、8周,每周统计类原球茎的鲜重和干重增长量,确定最适宜生物量增长的培养时间。
1.2.7 光强对金线莲类原球茎增殖培养和总黄酮得率的影响 增殖培养中使用黑暗、弱光（500 lx）、较强光（1000 lx）和强光（2000 lx）4种处理,比较光照强度对类原球茎增殖和总黄酮得率的影响。
1.2.8 紫外光不同处理时间试验 在增殖培养过程中,在光周期中光培养阶段紫外灯（SJC-Ⅱ型,60 w,波长253.7 nm）每天照射6 h,分别照射7、14、21、28、35、42、48、56 d。紫外灯不照射的光培养时段日光灯照射（光照时间和强度同1.2.1）。接种量为150 mL三角瓶中接种50 g鲜重类原球茎,8周后测定所得材料的总生物增长量和总黄酮含量,总生物量增长量分为鲜重增长量（g）和干重增长量（g）。干重增长量（g）=[每处理获得的类原球茎干重（g）-每处理接种时类原球茎干重（g）]/每处理样本数。总黄酮得率=样品中总黄酮质量（g）/样品质量（g）×100%。
1.2.9 总黄酮的测量 将培养好的金线莲类原球茎收集,在烘箱60 ℃干燥3 h后,80 ℃干燥0.5 h,并研成粉末。总黄酮的测量采用亚硝酸钠-硝酸铝法[15]。分别精确量取芦丁标准溶液（0.12 g/L）0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL,用30%的乙醇溶液补充至5.0 mL。依次加入0.5%亚硝酸钠溶液0.5 mL,10%硝酸铝溶液0.3 mL,1.0 mol/L NaOH溶液4.0 mL,每加入新的试剂混匀后静置10 min。取混合溶液4.0 mL,分光光度计510 nm测定吸光度。空白溶液为对照,以质量浓度为横坐标,以吸光度纵坐标,绘制标准曲线。得出线性方程。将金线莲类原球茎干燥粉末过40目筛,取0.5 g溶于95%乙醇浓度,提取时间24 h,料液比1∶100。取上清液2.0 mL,用30%乙醇补充至5.0 mL,按照标准品同样的反应程序,最终取反应完的溶液4.0 mL测定510 nm处吸光度。代入线性方程即可得到总黄酮的含量。总黄酮得率=样品中总黄酮质量（g）/样品质量（g）×100%。
1.2.10 与传统单步诱导法效率比较 将本研究所用的“二加二”法获得的诱导率、初始材料扩大倍数、增殖倍数、增殖鲜重、总效率和稳定率分别与传统单步法获得的数据进行比较。初始材料扩大倍数=每处理获得的白化茎段个数/接种外植体数×100%,增殖倍数=每处理获得的类原球茎个数/起始接种类原球茎个数×100%,总效率=诱导率×初始材料扩大倍数×增殖倍数。稳定率=每处理未分化、未愈伤组织化的类原球茎个数/收获的类原球茎总个数×100%。

1.3 数据处理

数据采用Excel 2010软件和DPS7.05软件进行统计分析,采用Duncan’s新复极差法检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 外植体来源对金线莲类原球茎诱导的影响

结果表明,4种不同的外植体,以黑暗腋生白化茎段的平均诱导率最高,可达88.33%,与其他处理差异显著（p<0.05）。经过黑暗培养的两个处理比光照条件下的2个处理的诱导率都高,并且差异显著（图1）。结果说明,黑暗培养3周能够显著促进金线莲类原球茎的诱导。
图1 不同外植体来源的金线莲类原球茎诱导率

不同小写字母表示处理间差异显著（p<0.05）。1：普通组培苗茎段;2：经暗处理的组培苗茎段;3：光照腋生茎段;4：黑暗腋生白化茎段。

Fig. 1 Inducing rate of PLBs of A. roxburghii of different origin of explants

Different lowercase letters mean significant difference (p<0.05).

1: common stem sections in light tissue culture; 2: stem sections in dark tissue culture; 3: stem sections from leaf axil in light tissue culture; 4: tiolation stem sections from leaf axil in dark culture.

2.2 类原球茎的诱导过程

金线莲组培茎段经暗培养3周,获得腋生白化茎段（图2A）。白化茎段接种后2周,已有部分茎段萌发出直径1~2 mm的白色小球（图2B）。3周后,白色小球逐渐膨大成为球状或椭圆形的类原球茎,直径约3 mm;原球茎个数逐渐增多,并且继续有新的类原球茎萌发（图2C）。4周后,类原球茎的萌发量最多,以后基本不再有新的类原球茎形成（图2D）。
图2 金线莲类原球茎的诱导过程

A：黑暗腋生白化茎段; B：黑暗腋生茎段接种后2周; C：黑暗腋生茎段接种后3周; D：黑暗腋生茎段接种后4周; E：球形类原球茎的高效增殖; F：普通组培苗茎段接种后2周; G：普通组培苗茎段接种后3周; H：普通组培苗茎段接种后4周。

Fig. 2 Induction procedure of PLBs of A. roxburghii

A: etiolation stem sections from leaf axil in dark culture; B: etiolation stem sections from leaf axil in dark culture 2 weeks after inoculation; C: etiolation stem sections from leaf axil in dark culture 3 weeks after inoculation; D: etiolation stem sections from leaf axil in dark culture 4 weeks after inoculation; E: efficiency proliferation of spherical PLBs; F: common stem sections in vitro 2 weeks after inoculation; G: common stem sections in vitro 3 weeks after inoculation; H: common stem sections in vitro 4 weeks after inoculation.

有的类原球茎为比较规则的球形,有的为椭圆形,有的为棒状,有的为不规则形。后续观察发现,黑暗腋生茎段诱导的类原球茎为球形,颜色洁白,生长速度快,增殖率高,质量最好（图2E）。椭圆形的类原球茎颜色偏黄,多数带有小芽,可用于诱导类原球茎再生植株;而棒状和不规则形的,在生长后期多数为膨大增殖,而且类原球茎生长拥挤变形,有些还发生了玻璃化,不利于后续增殖培养。
与普通组培苗茎段诱导的类原球茎相比,利用腋生白化茎段诱导类原球茎,诱导速度快（2周已有50%以上外植体萌发出类原球茎,而普通茎段此时只有1/3萌发）,质量好（图2B~图2D,图2F~图2H）。

2.3 诱导培养培养基的确定

供试的9种培养基中,以Y5和Y8的培养基类原球茎诱导率和平均诱导PLB个数显著高于其他处理。Y8培养基诱导出的类原球茎呈圆形,质量好,后期增殖速度快;Y5培养基诱导率虽然较高,但是长出的原球茎“球”状不明显,不够典型,个别后期培养时增殖缓慢,增殖方式多为膨大,而原球茎个数增加不显著,并且初期诱导的原球茎体积越大后期越不圆,有伸长分化的趋势,并且有些发生了玻璃化。因而,Y8培养基最适于诱导类原球茎,效率高,效果好。比较Y1、Y2两种培养基,两者在诱导率和平均出芽数方面均没有明显差异,说明Y2添加2.0 mg/L KT没有提高Y1的诱导效果。比较Y1与Y3培养基,Y3的2个指标都低于Y1培养基,可以推测在与6-BA、ZT配比时,NAA比2,4-D更利于类原球茎的诱导。比较培养基Y1、Y2、和Y7、Y9,在没有6-BA的作用下,Y7和Y9中细胞分裂素ZT的诱导效果明显降低,即使在Y9中将ZT浓度提升至1.0 mg/L也没有达到好的诱导效果,推测6-BA较为适宜诱导金线莲类原球茎,而ZT并不适宜其诱导。比较Y4、Y5、Y6、Y7发现,TDZ作为细胞分裂素加入培养基,与6-BA配合（Y4）不能提高诱导效果;TDZ单独使用,只有在加入1.0 mg/L S3307（Y5）时显著提高了诱导效果,而其余3种效果均不理想。诱导效果较好的Y5和Y8中的都含有1.0 mg/L S3307,说明添加1.0 mg/L S3307能够显著提高类原球茎诱导效率（图3）。
图3 不同培养基中金线莲类原球茎的诱导率和诱导数

不同小写字母表示平均诱导率的差异显著（p<0.05）,不同大写字母表示平均诱导个数的差异显著（p<0.05）。

Fig. 3 Inducing rate and inducing number of PLBs of A. roxburghii on different medium

Different lowercase letters mean significant difference of average inducing rate (p<0.05). Different capital letters mean significant difference of average inducing number.

2.4 外植体处理和接种方式对金线莲类原球茎诱导的影响

整个茎段平放是类原球茎诱导率最高的处理方式,诱导率为81.67%,显著高于其他处理。而3种茎片的诱导处理方式诱导率在9种处理中显著低于其他处理,说明将茎段切片的处理方式不适宜诱导类原球茎（图4）。
图4 不同外植体处理和接种方式的类原球茎诱导率

不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。1：整个茎段平放;2：整个茎段斜插;3：整个茎段埋入;4：茎段纵切半平放;5：茎段纵切半斜插;6：茎段纵切半埋入;7：茎片平放;8：茎片斜插;9：茎片埋入。

Fig. 4 Inducing rate of PLBs of A. roxburghii by different method of operation and inoculation of explants

Different lowercase letters mean significant difference (p<0.05).

1: lying the whole stem segments on the surface on the medium; 2: insert the whole stem segments obliquely into the medium; 3: embed the whole stem segments completely into the medium; 4: lying the half stem segments by length cutting on the surface of the medium; 5: insert the half stem segments by length cutting obliquely into the medium; 6: embed the half stem segments by length cutting completely into the medium; 7: lying the stem slices by length cutting on the surface on the medium; 8: insert the stem slices by length cutting obliquely into the medium; 9: embed the stem slices by length cutting completely into the medium.

2.5 暗培养时间对金线莲类原球茎诱导的影响

与对照相比3周以上的暗培养能够显著促进类原球茎的诱导效率。然而,对培养出的类原球茎的总黄酮得率进行测定,发现暗培养4、5周,类原球茎总黄酮得率有所降低。因而推测,“两步诱导”阶段,适宜类原球茎诱导的初始暗培养时间为3周（图5）。
图5 不同暗培养时间的类原球茎诱导率和总黄酮得率

不同小写字母表示平均诱导率的差异显著（p<0.05）,不同大写字母表示总黄酮得率的差异显著（p<0.05）。

Fig. 5 Inducing rate and total flavonoids yield of PLBs of A. roxburghii of different dark culture time

Different lowercase letters mean significant difference of average inducing rate (p<0.05). Different capital letters mean significant difference of total flavonoids yield (p<0.05).

2.6 增殖培养培养基的确定

结果表明供试的16个处理中,处理13的鲜重增长量为35.91 g,且与其他处理差异显著（表3）。本研究初始接种量为鲜重50 g/150 mL,理论上可获得类原球茎增殖鲜重239.4 g/L。根据正交试验极差分析结果显示,对类原球茎增殖培养中鲜重的增加,培养基中NH4+/NO-3是影响最大的因素,其次是NAA浓度,再次是6-BA浓度、S3307浓度,影响最小的是蔗糖浓度。最佳实验配比为：A1B4C4D2E2,即MS+0.5 mg/L S3307+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA + NH4+/NO3-（15 mmol∶45 mmol）+蔗糖40 g/L（表4）。经验证,按最佳实验配比得到的类原球茎增殖鲜重为246.90 g/L。正交试验方差分析结果显示,对于鲜重的增加,5个因素对结果的影响大小顺序与极差分析结果一致。并且,各因素p值均小于0.01,各因素对实验结果的影响均达到极显著水平（表5）。
表3 金线莲类原球茎液体增殖培养L16(45)正交试验

Tab. 3 Proliferation procedure of PLBs of A. roxburghii in Liquid based on orthogonal experimental design of L16(45)

处理Treatment S3307
/(mg·L-1)		 6-BA
/(mg·L-1)		 NAA
/(mg·L-1)		 NH4+/NO3-
(mmol︰mmol)		 Sucrose
/(g·L-1)		 鲜重增长量
Increment of fresh weight/g		 差异显著性
Significance of difference (p<0.05）
1 0.50 1.00 0.10 30︰30 30.00 20.67 e
2 0.50 2.00 0.20 15︰45 40.00 18.82 f
3 0.50 3.00 0.30 10︰50 50.00 9.16 g
4 0.50 4.00 0.40 7.5︰52.5 60.00 23.20 cd
5 1.00 1.00 0.20 10︰50 60.00 0.65 i
6 1.00 2.00 0.10 7.5︰52.5 50.00 5.15 h
7 1.00 3.00 0.40 30︰30 40.00 31.24 b
8 1.00 4.00 0.30 15︰45 30.00 22.81 d
9 1.50 1.00 0.30 7.5︰52.5 40.00 1.35 i
10 1.50 2.00 0.40 10︰50 30.00 0 i
11 1.50 3.00 0.10 15︰45 60.00 24.41 c
12 1.50 4.00 0.20 30︰30 50.00 6.69 h
13 2.00 1.00 0.40 15︰45 50.00 35.91 a
14 2.00 2.00 0.30 30︰30 60.00 8.64 g
15 2.00 3.00 0.20 7.5︰52.5 30.00 5.35 h
16 2.00 4.00 0.10 10︰50 40.00 20.65 e

Note: Different lowercase letters indicate significant difference (p<0.05).

注：不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。

表4 金线莲类原球茎增殖培养基L16(45)正交试验极差分析结果

Tab. 4 Results of range analysis of L16(45) orthogonal experiment for multiplication medium of PLBs of A. roxburghii

指标
Index		 因子
Factor		 水平1
Level 1		 水平2
Level 2		 水平3
Level 3		 水平4
Level 4		 极差R
Range R		 优水平
Optimal level
鲜重增长量
Increment of fresh weight/g
 S3307 17.96 14.96 8.11 17.63 9.85 1
6-BA 14.65 8.15 17.54 18.34 10.19 4
NAA 17.72 7.88 10.49 22.59 14.71 4
NH4+/NO3- 16.81 25.48 7.62 8.77 17.87 2
蔗糖Sucrose 12.2092 18.0158 14.2292 14.2258 5.81 2
表5 金线莲类原球茎增殖培养基L16(45)正交试验方差分析结果

Tab. 5 Results of variance analysis of L16(45) orthogonal experiment for multiplication medium of PLBs of A. roxburghii

指标
Index		 变异来源
Variation source		 平方和
Sum of squares		 自由度
Degree of freedom		 均方
Mean square		 F值
F value		 p-值
p-value
鲜重增长量
Increment of
fresh weight/g		 S3307 752.61 3 250.87 274.48** 0.0001
6-BA 770.33 3 256.78 280.94** 0.0001
NAA 1626.64 3 542.21 593.24** 0.0001
NH4+/NO3- 2474.28 3 824.76 902.38** 0.0001
蔗糖Sucrose 211.70 3 70.57 77.21** 0.0001
误差Error 29.25 32 0.91
总和Total 5864.81

Note：** means extremely significant correlation (p<0.01).

注：**表示极显著相关（p<0.01）。

2.7 增殖培养时间的确定

每周统计类原球茎的鲜重和干重增长量,0~6周生物量增长量显著增高,7~8周较6周有所下降,所以6周是最适宜生物量增长的培养时间（图6）。
图6 不同增殖培养时间的类原球茎生物量增长量

Fig. 6 Biomass increment of PLBs of A. roxburghii of different time of multiplication culture

2.8 光强对金线莲类原球茎增殖培养和总黄酮得率的影响

对于鲜重增长量和干重增长量,光照处理的结果均显著高于黑暗处理;对于总黄酮得率,弱光（500 lx）和较强光（1000 lx）处理显著高于黑暗培养处理和强光处理（2000 lx）（表6）。而弱光和较强光处理的3个指标差异均不显著（表6）。因此,根据经济原则选择500 lx的弱光培养有助于类原球茎增殖过程中总黄酮的积累。
表6 不同光强度的金线莲类原球茎生物量增长量和总黄酮得率

Tab. 6 Biomass increment and total flavonoids yield of PLBs of A. roxburghii under different light intensity

光照强度UV intensity/lx 鲜重增长量Increment of fresh weight/g 干重增长量Increment of dry weight/g 总黄酮得率 Total flavonoids yield /%
0 10.05±1.00c 1.65±0.11c 1.03±0.11b
500 31.33±2.56b 3.85±0.12b 1.32±0.05a
1000 32.25±1.21b 3.98±0.16b 1.35±0.09a
2000 36.47±0.74a 4.46±0.08a 1.12±0.03b

Note: Different lowercase letters in the same column mean significant difference (p<0.05).

注：同列不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。

2.9 紫外光处理时间对金线莲类原球茎增殖培养和总黄酮得率的影响

紫外光处理7~42 d,鲜重增长量与对照没有显著性差异,而随着紫外光处理时间的延长,48 d和56 d的紫外光处理明显降低了鲜重的增长量（表7）。而对于干重的增长量,紫外光处理只有一个相对降低的趋势,但差异并不显著。总黄酮得率受紫外光处理的影响呈现升高的趋势,42、48、56 d的紫外光照射有利于总黄酮的积累,显著高于其他处理。因而,为获得较高的生物量和较高的总黄酮得率,选择42 d的紫外光照射综合效果较好（表7）。
Fig. 7 Biomass increment and total flavonoids yield of PLBs of A. roxburghii of different UV light time
UV处理时间
UV treatment time/d		 鲜重增长量Increment of fresh weight/g 干重增长量Increment of dry weight/g 总黄酮得率 Total flavonoids yield/%
0 34.47±2.02a 4.46±0.18a 1.22±0.03cd
7 34.72±1.70a 4.35±0.21a 1.19±0.04d
14 34.25±2.03a 4.42±0.27a 1.25±0.05bcd
21 33.77±0.22a 4.32±0.19a 1.26±0.04bcd
28 33.15±0.92a 4.38±0.05a 1.29±0.04bc
35 32.38±1.27a 4.31±0.04a 1.32±0.03b
42 33.47±0.72a 4.56±0.14a 1.40±0.02a
48 29.18±0.92b 4.28±0.14a 1.42±0.05a
56 28.74±0.60b 4.29±0.11a 1.39±0.03a

Note: Different lowercase letters in the same column mean significant difference (p<0.05).

注：同列不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。

2.10 “二加二”法和传统单步诱导增殖法的培养效果比较

“二加二”法获得的诱导率、初始材料扩大倍数、增殖倍数、增殖鲜重、总效率和稳定率均比传统单步法获得的数据有显著提升（表8）。诱导率提升至88%的同时,初始材料扩大8.9倍,总效率可提升至27.76。增殖培养中92%的类原球茎不会发生分化和愈伤组织化（表8）。
表8 “二加二”法与传统单步法培养效果比较

Tab. 8 Comparison of ‘double two-step’ method and traditional single step method

方法Method 诱导率
Inducing rate/%		 初始材料扩大倍数
Amplification
of initial materials		 增殖倍数
Proliferation multiple		 增殖鲜重
Proliferation of fresh weight /(g·L-1)		 总效率
Total efficiency		 稳定率
Stable rate/%
传统单步法 0.80±0.02 1.00±0.00 2.18±0.09 221.30±0.79 1.68±0.08 0.72±0.06
“二加二”法 0.88±0.03 8.90±0.50 3.53±0.13 246.90±3.95 27.76±2.64 0.92±0.03

3 讨论

本研究是在普通单步诱导法茎段诱导途径的基础上进行改进。其优势和创新点包括：诱导培养第一步,每个组培茎段可萌发出多个白化茎段作为诱导材料;诱导培养第二步,与传统单步法所用的普通组培苗茎段相比,黑暗腋生白化茎段诱导效率更高（88.33%）,类原球茎发生早,特征典型,质量更好,本方法在提高诱导率的同时数倍提高初始材料利用率（8.9倍）,这也是本方法与传统单步法的本质区别;增殖培养第一步,将诱导出的类原球茎在原诱导培养基上继代一次,保证了稳定的生长增殖环境,同时,不需要多次继代即可达到较好的状态,缩短了继代周期;增殖培养第二步,液体悬浮培养增加了类原球茎与培养液和空气的接触面积,使生物量显著增加。正交设计优选的培养基成分配比保证了分化和愈伤组织化的类原球茎比例显著下降,92%的类原球茎能够保持稳定增殖。
经暗处理获得白化茎段的方式,能够显著提高类原球茎的诱导效率。前人在不定芽再生研究中也有类似结论[6, 16-17]。但要在第二步诱导培养时转入光下,因为持续黑暗处理则会影响类原球茎次生物质的积累,总黄酮含量会受到抑制。而弱光下能够促进总黄酮的积累,这和郑连金等[18]的研究结果一致。前期暗处理能够促进诱导率,提高类原球茎的获得效率,而后期必须要一定强度的光照才能实现类原球茎的生物量和总黄酮的积累。这就要求后期继续探讨如何找到合适的临界点,使得诱导率和总黄酮积累达到最大化,从而高效获得总黄酮。本研究得到的适宜类原球茎增殖的光照强度低于文献[19]中适宜金线莲组培植株光照强度,推测原因可能是类原球茎本身的生理特点决定的,类原球茎组织材料相比完整组培植株较为幼化,因而诱导类原球茎所需的光照强度较弱。不同类型的光照对金线莲的生长和总黄酮等药用成分的积累有显著影响[20,21]。在周一鸣的研究中发现,C区紫外光（波长200~280 nm）显著促进苦荞总黄酮的积累[22]。而本研究使用的紫外灯车发射的紫外光正是C区紫外光（波长253.7 nm）,每天6 h,连续42 d,同样对总黄酮积累达到了良好的促进效果。
对于外植体来源,以往研究中采用的有：种子、组培苗的茎段、茎段切半、茎段切片等[4]。本研究采用的是黑暗处理的腋生茎段,取材方便,获得率高,而且与种子直接诱导类原球茎相比,材料更多,诱导效率更高。与腋芽诱导的侧芽茎尖外植体相比,材料的获得率高（一个侧芽只有一个茎尖,而白化茎段的茎节具有多个）。与茎片相比,操作简便,并且效率高,获得的类原球茎质量好。这和韩晓红等[13]的茎片诱导研究结果不同,其原因可能是,本研究中虽然茎段切片与培养基的接触面积增加,但破坏了茎段功能的完整性,反而抑制了类原球茎的萌发。此外,产地来源对金线莲组织培养效果有较大影响[4]。本研究材料为“福建尖叶”,仅比较了该品种利用传统单步诱导法和“二加二”法的培养效果。今后的研究可扩展到其他品种。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

References

Publishing order | Descend order by publishing year | Descend order by cited within
[1]
Ye S Y, Shao Q S, Zhang A L . Anoectochilus roxburghii: A review of its phytochemistry, pharmacology, and clinical applications[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2017,209(14):184-202.

DOI

[2]
Refish N M R, Fu C H, Wang M G . Comparative study of the chemical components of Anoectochilus roxburghii and Anoectochilus formosanus tissue culture[J]. International Journal of Life Sciences Research, 2015,3(2):81-87.

[3]
Giap D D, Thai T D, Thang D D , et al. Effects of several organic extracts on the growth, yield and quality of Anoectochilus formosanus biomass[J]. International Journal of Agricultural Technology, 2018,14(2):171-182.

[4]
杨成行, 李晓婷, 袁建振 , 等. 金线莲组织培养技术研究进展[J]. 草业科学, 2018,35(5):1047-1056.

[5]
何碧珠, 何官榕, 黄铭星 , 等. 福建野生金线莲快速繁育技术[J]. 农业工程, 2013,3(2):72-76, 39.

[6]
王建明, 王松良, 詹巧杰 , 等. 金线莲组织培养的条件优化研究[J]. 中国现代中药, 2013,15(1):45-49.

[7]
韩晓红, 罗明英, 欧阳志成 , 等. 金线莲原球茎增殖研究[J]. 北方园艺, 2012,36(24):144-146.

[8]
封应丽, 余元涛, 杨春桃 , 等. 植物生长物质对金线莲离体再生的影响[J]. 北方园艺, 2010,34(7):136-138.

[9]
黄敏, 梁春辉, 李秀平 , 等. 应用正交设计优化金线莲继代增殖和生根培养的研究[J]. 北方园艺, 2015,39(1):96-98.

[10]
吕志伟, 吴文平, 毕丽伟 , 等. 建立金线莲原球茎悬浮体系生产次生代谢产物[J]. 中国生物工程杂志, 2012,32(5):43-50.

[11]
陈钢, 林兰英, 王建勤 . 药用金线莲组培类原球茎研究初报[J]. 福建中医药, 1994,25(4):23.

[12]
王建勤, 林兰英, 陈钢 . 金线莲原球茎诱导与植株再生[J]. 植物学通报, 1996,13(4):54-55.

[13]
韩晓红, 王春龙, 段春红 . 不同激素水平对金线莲组织培养的影响[J]. 广东农业科学, 2012,39(18):94-97.

[14]
邱玥, 龚宁, 张奎一 . 金线兰种子萌发及其原球茎的增殖培养[J]. 广西植物, 2010,30(4):555-559.

[15]
崔仕超 . 金线莲活性物质的提取及生理活性的研究[D]. 汕头: 汕头大学, 2010.

[16]
王贵章, 徐凌飞, 马锋旺 , 等. 富士苹果黄化茎段再生不定芽的研究[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2006,34(6):79-81.

[17]
师校欣, 杜国强, 高仪 , 等. 黑暗培养对苹果组培快繁及叶片再生的影响[J]. 河北农业大学学报, 2004,27(4):18-21.

[18]
郑连金, 马增强, 肖玉兰 . 不同光照强度对台湾金线莲生长发育和次生代谢物合成的影响[J]. 安徽农学通报, 2016,22(16):25-26, 39.

[19]
魏翠华, 谢宇, 秦建彬 , 等. 光照强度对金线莲生长及产量的影响[J]. 北方园艺, 2015,39(12):139-141.

[20]
李杰, 王再花, 刘海林 , 等. 不同光质的LED对2种金线莲组培苗增殖、生根及生长的影响[J]. 热带作物学报, 2017,38(9):1666-1670.

[21]
王伟苏, 明华, 李惠华 , 等. 蓝光补光对福建金线莲生长及药用成分的影响[J]. 热带作物学报, 2018,39(5):894-899.

[22]
崔琳琳, 周一鸣, 季红斌 , 等. 不同光质对苦荞萌发过程中的总黄酮类化合物及其抗氧化活性的影响[J]. 食品工业科技, 2016,37(6):104-108.

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