植物体内基因表达受到精密的调控,涉及到启动子、终止子、UTR序列等调控元件,其中启动子序列具有主导作用[1]。启动子是位于结构基因5′端上游区的DNA序列,是能与RNA聚合酶及转录因子特异性结合的一段特异的DNA序列[2],在基因转录调控中占有核心地位。
MADS-box基因家族是一类重要的调控植物发育的转录因子,对MADS-box基因的研究最早始于对金鱼草和拟南芥的花形态突变体的研究,随着后期的不断研究,发现绝大多数植物MADS-box基因（APETALA2除外）都与花的形态发生密切相关[3-4]。该基因是一个多基因家族,包括Ⅰ型和Ⅱ型两类,Ⅱ型MADS-box基因又称为MIKC基因,13个MIKC基因亚家族中,AGL6（AGMOUS LIKE 6）、AP1（APETALA1）和SEP（SEPALLATA）基因均属于MIKC亚家族的AP1/AGL9（SEP3）组[5]。AGL6基因在300万年以前已经出现在裸子植物和被子植物的共同祖先中[6],近年来在多种植物中发现了该基因的存在。前人研究结果表明AGL6基因在花的生长发育过程中起着至关重要的作用,矮牵牛AGL6基因研究表明PhAGL6具有E类基因的部分功能,参与调控花瓣和雄蕊的发育[7];水稻中AGL6基因OsMADS6在花分生组织、内稃、浆片和胚珠中都有表达,同样具有E类基因的部分功能,影响多轮器官和花分生组织的发育[8];玉米AGL6直系同源基因ZAG3也显示出花特异的表达模式[9];在文心兰花分生组织、唇瓣和心皮中检测到AGL6类基因O-MADS1的表达[10]。
近年来已有多种高等植物转录因子的启动子被克隆并进行功能表达分析。大豆GmERF9基因响应低温胁迫诱导,克隆得到其启动子GmERF9P,该基因具有多种响应逆境胁迫的顺式作用元件,将GmERF9P转化烟草,发现低温胁迫下转基因烟草叶片GUS活性较强,说明GmERF9P具有低温诱导启动活性[11]。白桦BpSPL6基因启动子可能参与了植物的叶片、根发育以及对盐和干旱胁迫的响应[12]。银杏GbMYBF2基因可能参与逆境胁迫信号的转导过程,在银杏逆境胁迫应答过程中具有重要功能[13]。丹参SmMYB7基因启动子在盐胁迫、水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸处理下表达均上调,推测该基因参与调控植物防御和花的发育[14]。
目前,已有许多学者对多种植物的基因启动子缺失分析进行了广泛的研究,但兰科植物的启动子分段表达研究少之又少,因此,克隆铁皮石斛DoAGL6基因及其启动子并进行生物信息学分析,探究其启动活性,对兰科植物基因的研究具有十分重大的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
拟南芥和铁皮石斛均来自于本实验室。
1.1.2 菌株及载体
植物表达载体pCAMBIA1300购于武汉伯远生物科技有限公司;pMD18-T载体购于宝生物工程有限公司;大肠杆菌TOP10感受态、根癌农杆菌EHA105感受态为实验室保存的菌株。
1.1.3 主要试剂
DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒均购于北京擎科生物技术有限公司;Axygen DNA凝胶回收试剂盒购于北京科恩堡生物科技有限公司;快速质粒小提试剂盒（DP105）购于天根生化科技（北京）有限公司、GUS染色试剂盒购于北京华越洋生物科技有限公司;Taq DNA聚合酶、T4连接酶、Eco31Ⅰ（BsaⅠ）限制性核酸内切酶均购自NEB公司。
1.2 方法
1.2.1 铁皮石斛DoAGL6基因及启动子的克隆
提取铁皮石斛的总DNA、RNA,将RNA反转录成cDNA,根据课题组数据库中AGL6基因序列利用Primer6.0软件设计特异性引物。分别以铁皮石斛cDNA和总DNA为模板,DoAGL6-F/R和DoAGL6-pro-F/R（表1）为引物进行PCR扩增,其中50℃退火45 s,72℃延伸2 min,30个循环,胶回收目的片段,连入克隆载体pMD18-T并转入大肠杆菌TOP10中,将重组子分别命名为pMD18- T-DoAGL6和pMD18-T-A1,经菌落PCR鉴定,选取阳性克隆送北京擎科生物技术有限公司测序。
表1 本研究所用引物Tab. 1 Primer sequences of this study |
| 引物名称 Primer name | 引物序列（5°-3°） Primer sequence (5°-3°) | 用途 Purpose |
|---|---|---|
| DoAGL6-F | gaccagttgaaagagagaaata | 基因克隆 |
| DoAGL6-R | tgatcagtaagatatctcctt | |
| DoAGL6-pro-F | cagtGGTCTCatagaaagtgcaagaaataggccga | 启动子 克隆 |
| DoAGL6-pro-R | cagtGGTCTCagttgtatttctctctttcaactgg | |
| A1-F | cagtGGTCTCatagaaagtgcaagaaataggccga | 载体构建 |
| A2-F | cagtGGTCTCatagaagagacagttgaattgattt | |
| A3-F | cagtGGTCTCatagaattcaacctaaatcttttaa | |
| Pro-R | cagtGGTCTCagttgtatttctctctttcaactgg |
注：大写字母为Eco31Ⅰ限制性核酸内切酶识别位点。 | |
Note: Capital letters are the Eco31Ⅰ restriction endonuclease recognition site. |
1.2.2 生物信息学分析
使用NCBI（National Center for Biotechnology Information）对克隆得到的DoAGL6蛋白序列进行保守结构域分析并通过Blastp搜索同源序列,DNAMAN软件进行氨基酸水平的序列比对,MEGA6.0软件构建系统进化树,ExPASy（ https://www.expasy.org/）在线软件对氨基酸理化性质进行预测,SPOMA（ https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在线软件分析其二级结构,SWISS-MODEL（ https://swissmodel.expasy.org/）在线软件进行三维结构建模,Softberry网站（ http://linux1.softberry.com/berry.phtml）进行亚细胞定位预测,SignalP-5.0（ https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）在线软件预测该蛋白的信号肽,PlantCARE（ http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）[15]、PLACE（ https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace）[16]等在线软件对DoAGL6启动子序列进行预测,分析启动子区的顺式作用元件。
1.2.3 DoAGL6启动子瞬时表达载体构建
根据启动子测序和网站预测结果,在全长启动子A1（-1891-+1）的基础上,构建2个5'端缺失启动子,分别为A2（-1488-+1）、A3（-784-+1）,并设计对应引物（表1）。以pMD18-T-A1质粒为模板,扩增全长启动子A1和5'端缺失片段A2、A3。定向替换载体pCAMBIA1300上CaMV35S启动子,构建pCAMBIA1300-A1-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A2-promoter::GUS、pCAMBIA1300- A3-promoter::GUS融合表达载体。
1.2.4 瞬时表达试验及GUS活性检测
将pCAMBIA1300-A1-promoter::GUS、pCAMBIA1300- A2-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A3-promoter:: GUS融合表达载体以及含CaMV35s启动子的载体转入农杆菌EHA105感受态细胞,分别侵染拟南芥植株和铁皮石斛原球茎,进行GUS组织化学染色。
2 结果与分析
2.1 铁皮石斛DoAGL6基因及其启动子的克隆
2.2 生物信息学分析
2.2.1 DoAGL6基因序列特征
保守结构域分析结果如图2所示,DoAGL6属于MADS基因家族中的TypeⅡ型,含有典型的MADS-box和K-box两个结构域,分别位于2~76区、84~172区。DoAGL6基因的蛋白分子式为C1213H1955N359 O375S12,蛋白分子量为27 952.77,理论等电点为8.97,负电荷残基总数（Asp+Glu）为29个,正电荷残基总数（Arg+Lys）为34个,亲水性平均值（grand average of hydropathicity）预测为-0.778,属于亲水性蛋白,DoAGL6蛋白二级结构预测表明,该蛋白中含有49.38%（120）α-螺旋、4.12%（10）β-折叠、9.88%（24）延伸连、36.63%（89）无规则卷曲。使用SWISS-MODEL对DoAGL6蛋白进行三维结构建模,结果如图3,该蛋白QMEAN得分为0.65,表明评估蛋白与模板蛋白的匹配度较高,模拟得到的DoAGL6蛋白质三维结构是可靠的。利用SignalP5.0软件预测结果该蛋白不含有信号肽,Softberry亚细胞定位预测结果与大多数MADS-box基因一致,定位于细胞核。
2.2.2 DoAGL6蛋白同源比较及系统进化分析
经NCBI-BlastP同源检索,铁皮石斛DoAGL6氨基酸序列与其他植物的同源MADS基因具有较高相似性,与兰科的文心兰（AHM92084.1）、鼓槌石斛（KAH0467999.1）、拟兰（AIZ95398.1）、香草兰（KAG0489259.1）、鹭兰（BBC77270.1）、小兰屿蝴蝶兰（XP_020592894.1）同源性分别达到94%、93%、90%、88%、87%、84%;与其他单子叶植物如生姜（XP_042466597.1）、参薯（KAH7683200.1）、台湾百合（AHY82573.1）同源基因的同源性也可达80%、82%、79%,使用DNAMAN软件将铁皮石斛DoAGL6氨基酸序列与上述兰科植物同源序列进行比对,总体一致性达到86.96%（图4）。由系统进化树分析结果可以看出,铁皮石斛DoAGL6基因与上述兰科植物属于同一个进化枝,与文心兰亲缘关系最近（图5）。
2.2.3 DoAGL6基因启动子生物信息学分析
由表2可知,启动子区域包括核心启动元件TATA-box、CAAT-box和MADS-box蛋白结合位点（CArG-BOX）以及部分光响应元件LAMP- element、TCT-motif、光响应元件G-Box、脱落酸响应元件ABRE和生长发育相关元件CCGTCC- box、茉莉酸甲酯响应元件TGACG-motif、水杨酸响应元件W box、MYB结合的光响应元件MRE和参与防御和应激反应TC-rich repeats。
表2 启动子顺式作用元件分析Tab. 2 Analysis of promoter cis-elements |
| 元件名称 Element name | 基序序列 Motif sequence | 个数 Number | 功能 Function |
|---|---|---|---|
| TATA-box | TATA | 8 | 核心启动元件 |
| CAAT-box | CAAT/CAAAT/CCAAT | 11 | 启动子和增强子常见顺式调控元件 |
| CArG-BOX | C（A/T)G | 3 | MADS-box结合基序 |
| LAMP-element | CCTTATCCA | 1 | 部分光响应元件 |
| TCT-motif | TCTTAC | 1 | 部分光响应元件 |
| G-Box | CACGTT/CACGAC | 2 | 光响应元件 |
| ABRE | CACGTA | 1 | 脱落酸响应元件 |
| CCGTCC-box | CCGTCC | 1 | 生长发育相关元件 |
| TGACG-motif | TGACG | 2 | 茉莉酸甲酯响应元件 |
| W box | TTGACC | 1 | 水杨酸响应元件 |
| MRE | AACCTAA | 1 | MYB结合的光响应元件 |
| TC-rich repeats | GTTTTTCTTAC | 1 | 参与防御和应激反应的顺式作用元件 |
2.3 DoAGL6启动子5'端分段表达载体的构建
2.4 DoAGL6基因启动子表达活性验证
分别用pCAMBIA1300-A1-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A2-promoter::GUS、pCAMBIA1300- A3-promoter::GUS表达载体和含CaMV35s启动子的对照载体质粒瞬时转化拟南芥全株。结果表明,转35S启动子的对照表现出全株染为蓝色（图8E）,未经农杆菌侵染的对照未出现染色（图8D）,而转化pCAMBIA1300-A1-promoter::GUS（图8A）、pCAMBIA1300-A2-promoter::GUS（图8B）、pCAMBIA1300-A3-promoter::GUS（图8C）的拟南芥植株都呈现出不同程度的染色,即随着启动子5'缺失长度的增加染色越来越浅,GUS活性越来越弱,初步证明启动子片段活性A1>A2>A3。转染铁皮石斛原球茎结果与拟南芥情况一致,即转35s启动子的阳性对照铁皮石斛原球茎切片全部呈蓝色（图9D）,未经农杆菌侵染的原球茎切片全部没有出现染色（图9E）,转化pCAMBIA1300- A1-promoter::GUS（图9A）、pCAMBIA1300-A2- promoter::GUS（图9B）、pCAMBIA1300-A3- promoter::GUS（图9C）的铁皮石斛原球茎的染色程度随启动子缺失片段增长而降低,GUS活性变弱,再次证明启动子片段A1（-1891-+1）活性最强,启动子片段A2（-1488~1）活性次之,启动子片段A3（-784~1）活性最弱。
3 讨论
本研究克隆了铁皮石斛DoAGL6基因及其启动子,发现铁皮石斛DoAGL6基因与建兰[20]、春兰×大花蕙兰杂种[21]、薄壳山核桃[22]等AGL6基因相似,也含有典型的TypeⅡ型MADS-box、K-box结构域,表明DoAGL6基因属于MIKC基因亚家族,该基因编码的氨基酸序列与其他兰科植物的序列一致性较高,说明克隆得到的序列是铁皮石斛DoAGL6基因。DoAGL6蛋白定位于细胞核,与大多数MADS家族转录因子一致。对启动子区域进行网站预测分析,结果表明铁皮石斛DoAGL6基因启动子区富含A/T序列,STAL- BERG等[23]认为富含AT的区段大多是与转录因子结合的部位,可以调控下游基因的高效表达。该启动子序列中除核心调节元件CAAT-box和TATA-box以外,还有多种与光响应相关元件,可能与铁皮石斛喜欢生长在半阴湿环境有关;还包含1种脱落酸响应元件,暗示DoAGL6的表达受脱落酸诱导;还有茉莉酸甲酯响应元件,茉莉酸甲酯是诱导植物产生化学防御的有机化合物,推测DoAGL6基因会响应逆境胁迫。
利用瞬时表达系统结合报告基因可以简单又快速地对植物启动子进行功能分析[24-25],敬帆等[19]将腊梅CpAGL6基因启动子转化烟草,发现该启动子在烟草的花瓣、雌蕊、茎、叶上均有染色,说明腊梅CpAGL6基因启动子具有启动活性;水稻中存在2个AGL6亚家族的基因,分别是OsMADS6和OsMADS17,卢爱龙[26]构建了OsMADS17基因启动子的GUS表达载体,转化不同生长时期水稻并进行GUS组织化学染色发现OsMADS17在植物不同时期的不同器官中都有表达活性;张璐[27]对中国水仙NtAGL6启动子瞬时转化烟草叶片检测出蓝色斑点,说明NtAGL6上游序列具有启动子活性。近年来,对AGL6基因启动子的研究大多集中在组织特异性方面,而研究分段表达活性的报道比较少,本研究利用瞬时表达技术对克隆得到的铁皮石斛DoAGL6启动子分段活性进行初步分析,构建融合GUS报告基因的植物分段表达载体,分别瞬时转化拟南芥及铁皮石斛原球茎验证分段启动子活性,经GUS组织化学染色发现,随着启动子5'缺失片段的增长,启动子活性呈下降趋势,拟南芥与铁皮石斛原球茎染色结果一致,说明DoAGL6启动子缺失片段均具有启动活性,可驱动下游GUS基因的表达。但分段表达载体染色程度与转35s启动子的植株相比均染色较浅,说明DoAGL6分段启动子启动活性与35s启动子相比均较弱。
本研究成功克隆了铁皮石斛DoAGL6基因及其启动子,并对DoAGL6基因启动子分段活性进行了初步探究,得到的结论对了解铁皮石斛DoAGL6基因作用机制提供一定参考,后续会继续对光照、激素和逆境胁迫等因素与DoAGL6基因启动子的关系进行探究,为更加明确DoAGL6基因的功能打下基础。