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2022 , Vol. 43 >Issue 8: 1565 - 1576

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2022.08.005

Germplasm Resources, Genetics & Breeding

Using the SSR Fluorescent Labeling to Establish SSR Fingerprints for 37 Cultivars in rubber tree (Hevea brasiliensis)

  • WEI Mingming ,
  • HUANG Xiao ,
  • LI Weiguo ,
  • HUANG Huasun
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  • Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / State Centre for Rubber Breeding / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Haikou, Hainan 571101, China

Received date: 2021-12-29

  Revised date: 2022-02-02

  Online published: 2022-09-09

Fold

Abstract

37 rubber tree cultivars were used as the materials to establish DNA fingerprints and to analyze the genetic relationship with SSR fluorescence labeling technology. A total of 34 pairs of SSR primers were screened and determined as the core primers for the construction of rubber tree variety DNA fingerprint library. Of which 30 pairs of SSR primers could be used for variety identification and 4 pairs of SSR primers could be used as alternative primers for the identification of subsequent newly selected varieties. The core SSR primers screened and determined showed high polymorphism information content (PIC value). Among them, the number of primers with PIC value higher than 0.5 was 97%, the number of primers with PIC value greater than 0.7 was 12, and the number of primers with PIC value greater than 0.8 was 2. Primer rbm28 had the highest polymorphism and could be used as the best primer to identify the genetic diversity of the main strains of rubber tree in China. The other four primers HESR025, HESR163, H-084 and H-122 had high heterozygosity and polymorphism at the same time, so they could be considered as alternative primers. A total of 161 alleles were detected by 34 pairs of core SSR primers in 37 rubber tree varieties, with an average of 5.4 alleles per pair of primers and an average polymorphism information content (PIC) value of 0.65. 30 pairs of core SSR primers were used to amplify 37 rubber tree strains to obtain the accurate SSR site information of related varieties. The standard DNA fingerprint library of 37 rubber tree varieties was constructed, of which 33 rubber tree varieties had unique DNA characteristic fingerprints, which could be used as the specific fingerprints of each variety, so as to provide a basis for rubber tree variety identification and breeding practice.

Key words： Hevea brasiliensis; hybrid identification; SSR fluorescent marker; DNA fingerprint

Cite this article

WEI Mingming , HUANG Xiao , LI Weiguo , HUANG Huasun . Using the SSR Fluorescent Labeling to Establish SSR Fingerprints for 37 Cultivars in rubber tree (Hevea brasiliensis)[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2022 , 43(8) : 1565 -1576 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.08.005

巴西橡胶树原产亚马逊河流域,是热带地区重要的经济作物,其生产的天然橡胶是关系到国计民生的战略资源。巴西橡胶树自1904年引种至中国以来,迄今国内保存的橡胶树栽培品种、野生种质以及同属种质材料5个种、1个变种共计6165份种质材料[1]。然而,橡胶树属多年生乔木,不仅具有有性世代周期长,品种高度杂合,很多亲缘关系相近的品种间农艺性状差异较小,甚至只有单一性状的不明显变异等不利因素[2],而且目前生产上橡胶树一般在定植后5~6年才能开花结果,若在此时利用传统的形态学标记来鉴定品种真伪已为时过晚。
国际植物新品种保护联盟把特异性、一致性和稳定性作为新品种登记和保护的必备特征[3]。目前,传统的形态学鉴别方法不仅存在鉴定周期长、易受环境因素影响等缺点,而且对于一些性状差异较小、亲缘关系较近品种的鉴定十分困难,给橡胶树种质资源和品种鉴定带来了诸多不便。长期以来,橡胶树品种特性鉴定一直采用以形态性状为主要依据。这种经典的、常规鉴定方法一般要在植株从营养生长期发育至特定的生殖发育期才能进行,因而鉴定周期较长,而且农艺性状易受环境条件和栽培管理措施的影响。因此,亟需准确的分子标记方法来对橡胶树种质资源和品种进行鉴定。
随着分子生物学的发展,各种DNA分子标记技术不断涌现,检测技术渐趋完善,为实现橡胶树品种的早期、快速和准确鉴定提供了新途径。前人也有利用分子标记技术对橡胶树种质资源和品种进行鉴定的研究[4⇓-6],但都侧重于对橡胶树种质材料的亲缘关系及特定标记进行研究,目前还没有建立起完整的橡胶树品种指纹图谱库从而鉴别品种的报道。应用SSR荧光标记引物和毛细管电泳检测技术鉴别橡胶树品种,构建橡胶树标准DNA指纹图谱库,具有重复性好、稳定可靠、检测快速的优点,可为橡胶树品种的鉴别、甄别,以及分子辅助育种提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以海南儋州国家橡胶树种质资源圃保存的橡胶树主栽品种为供试材料（表1）,分别从同品种5株不同的橡胶树中采集适量稳定期叶片后,立即投入液氮中冷冻,并转放至实验室-80℃冰箱保存。
表1 37个供试橡胶树品种

Tab. 1 37 cultivars of rubber tree for SSR analysis

编号
Code		 品种名称
Variety name		 简称
Abbreviation		 编号
Code		 品种名称
Variety name		 简称
Abbreviation		 编号
Code		 品种名称
Variety name		 简称
Abbreviation
1 PR107 PR107 14 RRIM600 RRIM600 27 文昌217 WC217
2 GT1 GT1 15 93-114 93-114 28 热研879 RY879
3 PB86 PB86 16 云研77-2 YY77-2 29 热研8-333 RY8-333
4 海垦1 HK1 17 云研77-4 YY77-4 30 热垦525 RK525
5 Tjir1 Tjir1 18 热研217 RY217 31 热垦523 RK523
6 南华1 NH1 19 PB235 PB235 32 热垦628 RK628
7 红星1 HX1 20 RRIM712 RRIM712 33 热研87-4-26 RY87-4-26
8 天任31-45 TR31-45 21 云研277-5 YY277-5 34 黑皮PR107 HPPR107
9 合口3-11 HK3-11 22 热研7-33-97 RY7-33-97 35 水丰 SF
10 RRIM623 RRIM623 23 热研7-20-59 RY7-20-59 36 08-3 08-3
11 IAN873 IAN873 24 文昌11 WC11 37 11-1 11-1
12 大丰95 DF95 25 热研88-13 RY88-13
13 海垦2 HK2 26 湛试327-13 ZS327-13

1.2 方法

1.2.1 橡胶树总DNA提取

参照CTAB法提取所述各个橡胶树品种的叶片总DNA[7],将橡胶树叶片置入盛有液氮的研钵中充分磨成粉末,后将0.1 g左右的叶片粉末转移至2 mL离心管中,加入500 µL提前预热的CTAB缓冲液,并置入水浴锅中65℃温育30 min,中间取出离心管上下颠倒充分摇匀,然后取出离心管加入500 µL按24∶1混合均匀得氯仿∶异戊醇溶液,然后室温、12 000 r/min、离心10 min,弃沉淀,将上清液转移至新的离心管中,加入2/3体积的异丙醇混匀后,-20℃静置1 h;最后4℃、10 000 r/min、离心5 min,弃上清,保留沉淀,加入500 µL 75%的乙醇洗涤沉淀2次,获得的DNA沉淀放于室温下晾干,后加入100 µL ddH2O溶解DNA。后用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测各品种的总DNA质量,以确保所提取的各个橡胶树品种总DNA完整性好,且A260/A280比值在1.6~2.0之间。放入-20℃冰箱中保存备用。

1.2.2 SSR特征引物对序列的筛选及合成

SSR特征引物对序列的筛选：以‘PR107'‘GT1'‘PB86'‘HK1'‘Tjir1'‘NH1'‘HX1'‘TR31-45'8个橡胶树品种为材料对793对SSR引物进行初筛,首先用聚丙烯酰胺凝胶电泳对参试橡胶树品种中PCR扩增谱带的特异性、多态性以及带型的易区分程度进行初筛。从793对SSR引物中筛选出44对在不同橡胶树品种间多态性丰富、带型清晰、特征谱带能够稳定重复的SSR引物。然后,使用M13通用接头序列（TGTAAAACGACG GCCAGT）加到每对引物的5°端,合成带不同荧光基团的M13接头序列-携带荧光标记的SSR引物组合[8-9]。通过荧光标记PCR扩增,得到带荧光基团的SSR标记产物,再进行毛细管电泳分离,根据毛细管电泳筛选结果来确定构建指纹图谱的核心引物对序列。最后,利用毛细管电泳找出一对在所述各个橡胶树品种间多态性信息含量即PIC值大于0.4,等位位点数最多的34对SSR引物作为橡胶树品种指纹图谱库构建的核心引物。
SSR引物对的来源及合成：选择分布于不同连锁群上的引物对序列（表2）,上述引物对序列由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成,按PAGE方法进行纯化。
表2 34对核心SSR特征引物对序列

Tab. 2 Sequences of 34 core SSR primers

引物名称
Primer name		 上游引物（5′-3′）
Forward primer (5′-3′)		 下游引物（5′-3′）
Reverse primer (5′-3′)		 片段大小
Size/bp		 用途
Application
H-014 TCTAAGGATGGTTTCCGACG ATAGCCCCAACCCCATTC 175~198 品种鉴定
H-051 CCGCAGGAAATACTAAGGAGG TTGGCAATCCACGAACGA 197~235 品种鉴定
H-054 TTCAGATCCACACGCTAAAAT TCTGCCGTTGGCGGTTAT 195~211 品种鉴定
H-077 CCAGTAAAACCCAAATAGATAAACA AAGCAAGGCGAAGAACATAA 232~278 品种鉴定
H-084 GCCATTGACAGTGGTAGGG CTCAACAATGAGGTTTAACTGCT 272~287 备选
H-090 CCGCCTCAAGAAGAACAAA ACACCCAAATCCCCTCGA 441~450 品种鉴定
H-122 GATGCCCGATGGACCTCT CTACAAAACCCGACCCAATA 227~248 备选
H-189 CCGATCAGATCCAAATCAAG ATCCGAAGCCGCAGACAC 123~128 品种鉴定
H-190 CCCTTCCTTCTGTCCCTCTC GGGTAGATTCTGGAGGTCGG 294~324 品种鉴定
H-280 GGACACCTGGAGCAAAATAG TATGCTTCGATGTATATTCACAGT 367~376 品种鉴定
HESR001 AAGGCAACGACGAAGAAAGA CGTTAAAAAGGGGATGAAAGC 271~293 品种鉴定
HESR016 CGACTGCTGCTGTGACAAAT CAGGAACACAACGTCTTCTTTT 220~234 品种鉴定
HESR018 CGGAGATTGTTTGGGAGAGA ATTGGGTGGGGATACGTTTT 313~321 品种鉴定
HESR025 GCTTTGGTCTTGGGAGAGAG TGCACCAATCAATAATCACCA 243 备选
HESR031 GGCCAATGGATTCTCTCTCA CAAAACCCAAAAAGGAACGA 153~163 品种鉴定
HESR045 TTGATGGCCAATTATCAGCA GTTGCCTTCATCTTCTGCAA 212 品种鉴定
HESR046 TTGATGGCCAATTATCAGCA CTTTCTTCGTCGTTGCCTTC 212~239 品种鉴定
HESR049 TTTCATTTCCAGTAAAACCCAAA CTCCCTCCATCTTGAACCAA 179 品种鉴定
HESR104 GGGGATTGCTGTTGTGAGA AGTGTAAGGTAGAGGTCGGTGA 319~328 品种鉴定
HESR130 GGGACGCTACCTACTATTAC CCCTTGAGTGCTCTTCG 152 品种鉴定
HESR145 AACAGATTCCTCATCACGG ATAGTTTTCACCATCACCC 163 品种鉴定
HESR163 AAACCCAAATCAGCAAGC AAACCAGCAGGCAAGAGC 402 备选
HESR203 AAGGCATCAACCACCAAATC AAGGCGTCATCGCTCCA 234 品种鉴定
HESR204 TAGGGTTATCTTTGGCTCTC CTACTGCTACTCCGATGGTG 237 品种鉴定
HESR210 CTGGGTTTGATTTTGATGGC CCTCTTTCTTCGTCGTTGC 238 品种鉴定
HESR211 CTGGGTTTGATTTTGATGGC TCCGATTCAGTTCCTCCGTA 330 品种鉴定
HESR245 CACGTTTAATATCACGGGAA CCTTTGACATAAGTTGGAGA 151~163 品种鉴定
HESR247 TCCCTTTTCTCCGCTCCT TCTCAATCCCGATACCTTCC 219 品种鉴定
HESR267 ATGTGCCCTTCTTGTGAGC TATCTTTGTAGGTGGTACTGGTG 130 品种鉴定
HESR269 CCCACGGATTTTGCTGTT CTTTACCCTATCAATGTCACCTC 264 品种鉴定
HESR356 ACGGTCTGTGAGTACCATCTGC CATCATCAACCTACACCCCATT 334 品种鉴定
rbm19 TCATTTCAAGTTCACCGTGCTTATT AGCGCATGTATTTGCCTTATGTCTC 148~166 品种鉴定
rbm28 TGTGTCCTCTACTTGTCTTCATTTG GCCTCTACTTTTCTTTCTCCTTTAT 222~246 品种鉴定
rbm36 CATCTCCACCACCTACA AGGAGAGCAATAACCAAC 237~261 品种鉴定

1.2.3 荧光PCR扩增

以上述各个橡胶树品种的叶片DNA为模板,分别加入上述核心引物对序列及荧光标记进行PCR扩增,其中荧光标记为FAM、HEX、TAMRA 3种不同的标记。荧光PCR反应采用15 μL体系,各成分及比例如下：2×Taq Master Mix 7.5 μL;Mix primer 2.0 μL;DNA模板1 μL（50~200 ng）;ddH20 4.5 μL。PCR反应程序如下：94℃预变性2 min;94℃变性30 s,52~ 57℃退火45 s,72℃延伸1 min,循环30次;72℃延伸5 min,4℃保存20 min,获得橡胶树叶片DNA扩增产物。

1.2.4 PCR产物电泳分析

采用毛细管电泳仪获得各橡胶品种的毛细管电泳图谱,毛细管电泳仪器为Applied Biosystem公司3730xl分析仪,样品上样处理参照仪器说明要求,毛细管电泳进样电压为-15 kV,进样时间为40 s,分离电压为-15 kV,温度控制为25℃。

1.2.5 橡胶树标准DNA指纹图谱库的构建

以筛选获得的核心SSR特征引物对序列为基础,分别对所述各个橡胶树品种进行PCR扩增,先采用非变性的聚丙烯酞胺凝胶电泳初步验证,再采用毛细管电泳分析,获得各个橡胶树品种的DNA特征指纹图谱。根据上述得到的毛细管电泳图谱,挑选符合引物设计目标产物大小和重复单位特征的电泳峰,进行毛细管电泳图谱有效特征数据采集,然后进行毛细管电泳图谱有效特征数据的标准化,最后利用对应PCR扩增产物大小的电泳峰的位置及其对应的电泳峰特征数据构建橡胶指纹图谱。

1.3 数据处理

使用Gene Marker软件,导入基因分析仪上的原始结果文件,根据位点信息设置分析Panel。使用GeneScan 500 LIZ Size Standard进行数据分析。核查Size Standard评分,剔除评分小于0.8的数据,导出Excel格式的等位基因信息,按项目号-板号进行命名。
使用GenAIex软件计算等位基因数（Na）、有效等位基因（Ne）、Shannon信息指数（I）、观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、固定指数（F）、以及遗传分化系数（Fst）等遗传参数。各个位点的多态信息含量指数（PIC值）使用Cervus软件计算。使用Phylip软件进行统计分析,计算橡胶树品种间遗传距离,构建遗传相似性矩阵[10],采用UPGMA（unweighted pair group method using arithmetic averages）法进行群体间聚类分析[11]。

2 结果与分析

2.1 SSR遗传多样性分析

利用筛选出的34对稳定性好、多态性丰富的核心引物对序列对37份橡胶树品种DNA进行扩增,扩增产物经过毛细管电泳检测,部分品种在HEX、FAM、TAMRA 3种荧光显色剂显色下扩增出的等位基因,获得不同橡胶树品种在不同位点的等位变异的片段大小（表2）及相对应的毛细管电泳图（图1）。37份材料共检测出650个等位基因。
图1 ‘PR107'‘GT1'‘热研879'‘热垦628'和‘热垦525'在位点H014的SSR指纹图谱

Fig. 1 SSR fingerprints of ‘PR107' ‘GT1' ‘RY8-79' ‘RK628' and ‘RK523' at H014

34对引物扩增的片段长度为123~450 bp,每对引物检测出3~30个等位基因,平均每个引物等位基因数为5.4个,最高为13（rbm28,rbm19）,最低为3（H-014,H-051,H-054）;有效等位基因（Ne）值1.28~7.49,平均为3.72;观测杂合度（Ho）值0.14~1.0,平均为0.67;期望杂合度（He）值0.22~0.87,平均为0.69;各引物的Shannon信息指数（I）值0.45~2.21,平均为1.42;各引物多态信息含量（PIC）值变化范围在0.21~0.85之间,平均为0.65,其中最高为0.85（rbm28）,最低为0.21（H-014）,所有引物中PIC值高于0.5的SSR引物高达97%（表3）。综上所述,筛选和确定的核心SSR引物对组合表现出高度多态性,在参试橡胶树品种中反映出的遗传多样性较为丰富。
表3 34对核心SSR引物在37份供试材料中的扩增信息

Tab. 3 Amplification with 34 core SSR primes in 37 tested hybrids

引物编号No. SSR位点
名称Locus		 荧光标记
Dye		 检测样本
数量N		 等位基因数Na 有效等位基因数Ne 香农
指数I		 观测杂合度Ho 期望杂合度He 固定指数F 多态信息含量PIC
1 H-014 FAM 37 3 1.283 0.449 0.135 0.221 0.388 0.208
2 H-051 FAM 37 3 1.885 0.811 0.243 0.470 0.482 0.416
3 H-054 FAM 37 3 2.891 1.079 0.649 0.654 0.008 0.579
4 H-077 HEX 37 9 4.910 1.865 0.889 0.796 -0.116 0.776
5 H-084 HEX 37 4 3.094 1.252 1.000 0.677 -0.478 0.627
6 H-090 TAMRA 37 4 3.007 1.202 0.757 0.667 -0.134 0.608
7 H-122 HEX 37 6 2.648 1.268 0.622 0.622 0.001 0.585
8 H-189 FAM 37 3 2.615 1.025 0.541 0.618 0.125 0.544
9 H-190 TAMRA 37 7 4.669 1.741 0.889 0.786 -0.131 0.761
10 H-280 TAMRA 37 3 2.775 1.059 0.757 0.640 -0.183 0.566
11 HESR001 HEX 37 5 3.488 1.417 0.703 0.713 0.015 0.673
12 HESR016 HEX 37 8 3.794 1.600 0.838 0.736 -0.138 0.704
13 HESR018 TAMRA 37 4 2.460 1.031 0.703 0.593 -0.184 0.511
14 HESR025 HEX 37 9 4.153 1.719 0.714 0.759 0.059 0.730
15 HESR031 FAM 37 6 4.082 1.541 0.757 0.755 -0.002 0.718
16 HESR045 FAM 37 6 3.671 1.473 0.676 0.728 0.071 0.683
17 HESR046 HEX 37 6 3.671 1.473 0.676 0.728 0.071 0.683
18 HESR049 FAM 37 9 4.910 1.865 0.889 0.796 -0.116 0.776
19 HESR104 TAMRA 37 4 1.322 0.520 0.108 0.243 0.556 0.231
20 HESR130 FAM 37 4 3.019 1.202 0.514 0.669 0.232 0.608
21 HESR145 FAM 37 4 2.947 1.198 0.556 0.661 0.159 0.599
22 HESR163 HEX 37 5 4.306 1.528 0.306 0.768 0.602 0.730
23 HESR203 FAM 37 6 3.478 1.386 0.622 0.712 0.127 0.664
24 HESR204 FAM 37 6 2.949 1.407 0.297 0.661 0.550 0.632
25 HESR210 HEX 37 6 3.671 1.473 0.676 0.728 0.071 0.683
26 HESR211 HEX 37 5 3.387 1.359 0.189 0.705 0.732 0.655
27 HESR245 FAM 37 11 4.516 1.757 1.000 0.779 -0.284 0.747
28 HESR247 FAM 37 10 4.229 1.758 0.865 0.764 -0.133 0.736
29 HESR267 FAM 37 6 3.509 1.451 0.865 0.715 -0.210 0.673
30 HESR269 HEX 37 6 4.399 1.609 0.838 0.773 -0.084 0.740
31 HESR356 HEX 37 8 5.071 1.743 0.838 0.803 -0.044 0.774
32 rbm19 FAM 37 13 6.205 2.093 0.865 0.839 -0.031 0.821
33 rbm28 HEX 37 13 7.488 2.213 0.919 0.866 -0.061 0.853
34 rbm36 HEX 37 9 5.257 1.855 0.946 0.810 -0.168 0.785

2.2 遗传相似性及聚类分析

利用Phylip软件计算橡胶树品种间的遗传相似系数（GS）,所得数据表明37份橡胶树品种两两间的GS在0.11~0.63之间,平均值为0.31,说明供试品种间存在较大的遗传差异。其中‘RRIM712'和‘RY88-13'的GS最大（0.63）,亲缘关系最近;‘TR31-45'和IAN873的GS最小（0.11）,亲缘关系最远。
利用34对引物扩增得到的条多态性条带进行聚类分析,得到供试材料的遗传关系树状图（图2）。结果表明,所有供试材料间差异位点数均不低于3,其中‘PR107'与‘HPPR107'‘IAN873'与‘SF'‘RK628'与‘11-1'和‘08-3'相似系数较高,仅有2对引物可以将其分开。
图2 37个橡胶树品种的SSR分子标记聚类分析图

Fig. 2 Multiple alignment analysis of 37 rubber tree varieties using SSR markers

以遗传相似系数0.25为阈值,可以将37个橡胶树品种分为5个类群。第I类群包含7个橡胶树品种,分别为‘YY77-4'‘Tjir1'‘RRIM623'‘YY277-5'‘HK3-11'‘93-114' ‘TR31-45',该类群主要为橡胶树抗寒品种,包含了橡胶树抗寒育种的骨干亲本类型,如‘HK3-11'‘TR31-45'‘93-114'。第Ⅱ类群包含15个橡胶树品种,分别为‘HPPR107'‘PR107'‘ZS327-13'‘RY217'‘WC217'‘RY7-20-59'‘HK1'‘DF95'‘WC11'‘RY87-426'‘RY879'‘RY8-333'‘YY77-2'‘GT1'‘HX1',该类群主要为橡胶树高产抗逆品种,包含了橡胶树高产抗逆育种的骨干品种‘PR107',以及目前国内产量最高的品种‘RY879'。第Ⅲ类群包含5个橡胶树品种,分别是‘SF'‘IAN873'‘RK523'‘RK525'‘NH1',该类群主要为橡胶树速生高产品种,包含了目前2个胶木兼优品种‘RK523'和‘RK525'。第Ⅳ类群包含6个橡胶树品种,分别是‘PB86'‘RRIM600'‘RY7-33-97'‘RRIM712'‘RY88-13'‘HK2',该类群主要为橡胶树高产品种,包含了目前国内推广面积最大的高产品种‘RY7-33-97',第Ⅴ类群包含4个橡胶树品种,分别为‘08-3'‘RK628'‘11-1'‘PB235',该类群主要为速生高产品种,如速生高产品种‘RK628'。以上研究聚类结果与其系谱来源和亲缘关系比较吻合。

2.3 品种指纹图谱构建与品种鉴定

利用筛选出的30对核心SSR引物对37份橡胶树品种进行扩增,部分毛细管电泳结果如图1所示。利用软件对获得的原始数据进行人工校对,整理电泳峰图,读出等位基因条带的长度值[12⇓-14],准确获得不同材料在不同位点的等位基因的片段大小（表4）,建立起37个橡胶树品种的DNA指纹图谱。
30对核心引物可以将所有供试品种区分开来（表4）,其中33个橡胶树品种的SSR指纹图谱互不相同,可以作为各品种特定的图谱,为品种鉴别提供依据。4个品种为异物同名品系,如‘HPPR107'与‘PR107'为同一品种,‘SF'与‘IAN873'为同一品种,‘08-1'‘11-1'和‘RK628'为不同批次从马来西亚引进的同一品种。
表4 37个橡胶树品种在30个SSR位点的指纹图谱

Tab. 4 Fingerprint data of at 30 SSR loci of 37 rubber tree cultivars

编号Code H-014 H-051 H-054 H-077 H-090 H-189 H-190 H-280 HESR001 HESR016
1 173/173 208/208 178/178 252/278 424/430 106/106 296/308 355/369 259/262 206/212
2 182/182 208/208 178/178 256/260 424/433 106/109 278/281 351/355 259/262 206/206
3 182/182 208/214 190/190 258/260 424/433 112/112 278/287 351/355 259/259 206/206
4 173/182 208/208 178/190 258/278 424/424 106/112 287/296 355/355 259/262 206/206
5 182/182 208/208 178/193 260/262 424/433 109/109 278/287 355/369 253/259 190/206
6 173/182 208/208 190/193 258/260 424/433 106/106 278/296 355/355 256/259 187/215
7 173/182 208/208 178/178 260/276 424/424 106/109 278/296 355/355 256/262 190/215
8 182/182 208/214 190/190 276/276 424/424 106/109 296/296 351/351 259/262 187/206
9 182/182 208/208 178/190 260/276 424/430 106/109 278/296 351/355 253/253 184/209
10 182/182 208/208 190/193 260/262 424/424 106/109 278/287 355/355 253/256 206/215
编号Code H-014 H-051 H-054 H-077 H-090 H-189 H-190 H-280 HESR001 HESR016
11 182/185 211/214 190/193 260/268 430/433 106/112 278/290 351/355 256/259 187/206
12 173/182 211/214 178/190 258/278 424/424 106/112 287/296 355/355 259/262 206/206
13 182/182 214/214 190/190 260/260 424/430 106/112 278/278 351/369 259/262 206/209
14 182/182 208/214 190/193 258/260 424/433 106/112 278/281 351/355 253/259 206/215
15 182/182 211/214 190/190 260/276 424/430 106/106 278/296 351/351 253/262 184/187
16 173/182 208/214 178/178 252/256 430/433 106/109 278/281 351/355 262/262 206/212
17 182/182 208/214 178/193 250/260 424/430 106/109 278/281 355/355 253/256 187/206
18 173/182 208/208 178/193 252/260 424/430 106/106 278/308 355/369 259/262 187/212
19 182/182 208/214 190/193 256/262 424/424 109/112 287/293 351/355 259/259 184/215
20 182/182 214/214 178/190 258/260 424/433 112/112 278/287 351/369 253/259 206/215
21 182/182 208/208 190/193 258/260 424/424 109/109 278/281 351/369 259/259 187/206
22 173/182 214/214 178/190 252/260 424/433 106/112 278/308 351/369 259/259 206/212
23 173/182 208/211 178/193 252/260 424/424 106/106 278/308 355/369 253/259 206/212
24 173/182 208/208 178/190 252/260 424/433 106/112 278/308 355/355 253/262 206/206
25 182/182 214/214 178/190 258/260 433/433 112/112 278/281 351/369 253/259 206/215
26 173/182 208/208 178/190 252/260 424/430 106/106 278/308 351/355 262/262 184/212
27 173/182 208/208 178/190 252/260 430/430 106/106 278/308 355/369 259/262 206/206
28 173/182 208/208 178/178 252/258 424/433 106/112 281/308 369/369 253/259 206/212
29 182/182 208/211 178/193 252/260 430/433 106/112 278/308 355/369 253/262 187/215
30 182/185 208/208 190/193 260/262 424/433 106/106 278/287 355/369 256/259 187/187
31 182/182 208/208 193/193 260/260 424/430 106/109 278/278 351/355 259/259 206/215
32 182/185 214/214 190/193 256/268 424/430 112/112 290/293 351/355 259/259 206/215
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34 173/173 208/208 178/178 252/278 424/430 106/106 296/308 355/369 259/262 206/212
35 182/185 211/214 190/193 260/268 430/433 106/112 278/290 351/355 256/259 187/206
36 182/185 214/214 190/193 256/268 424/430 112/112 290/293 351/355 259/259 206/215
37 182/185 214/214 190/193 256/268 424/430 112/112 290/293 351/355 259/259 206/215
编号Code HESR018 HESR031 HESR045 HESR046 HESR049 HESR104 HESR130 HESR145 HESR203 HESR204
1 295/307 139/141 188/188 199/199 174/200 301/310 150/150 164/164 227/229 249/256
2 295/303 133/137 188/191 199/202 178/182 301/307 150/163 161/167 227/227 238/238
3 295/303 137/144 188/191 199/202 180/182 298/301 150/163 161/167 229/233 238/238
4 295/303 137/141 182/208 199/199 198/200 298/301 163/163 161/167 229/229 249/260
5 295/303 133/137 191/208 202/220 182/184 301/310 153/153 161/161 227/227 238/238
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7 295/303 137/146 182/188 193/199 182/198 298/310 163/163 164/164 227/229 252/252
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9 295/297 137/139 205/208 217/220 182/198 301/301 153/154 161/164 227/229 249/252
10 295/303 137/137 182/205 193/217 182/184 301/301 150/163 161/161 227/227 238/238
11 303/303 141/144 191/194 202/205 182/190 301/304 150/154 158/161 231/233 250/250
12 295/303 137/141 188/188 199/199 180/200 298/301 163/163 161/167 227/229 238/238
13 295/303 137/144 188/191 199/202 182/182 301/310 150/163 161/161 229/229 238/238
14 295/303 137/144 191/208 202/220 180/182 301/310 150/153 161/161 233/233 238/238
15 295/297 133/137 188/205 199/217 182/198 301/307 153/163 161/164 227/227 250/252
16 295/303 133/139 188/188 199/199 174/178 307/310 150/150 161/164 227/227 238/238
17 295/295 133/137 182/208 193/220 172/182 301/310 153/163 161/167 229/229 238/238
编号Code HESR018 HESR031 HESR045 HESR046 HESR049 HESR104 HESR130 HESR145 HESR203 HESR204
18 303/307 137/139 188/188 199/199 174/182 301/301 153/153 164/164 227/229 250/256
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24 295/303 137/141 188/208 199/220 174/182 301/310 150/153 161/161 227/233 238/238
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27 295/303 141/144 188/191 199/202 174/182 310/310 150/150 161/164 229/229 252/256
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30 295/303 137/144 191/194 202/205 182/184 301/307 150/154 158/161 227/233 250/260
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33 303/303 137/137 188/208 199/220 174/180 301/301 150/163 164/164 229/233 238/238
34 295/307 139/141 188/188 199/199 174/200 301/310 150/150 164/164 227/229 249/256
35 303/303 141/144 191/194 202/205 182/190 301/304 150/154 158/161 231/233 250/250
36 295/303 141/141 191/191 202/202 178/190 301/301 150/163 158/164 227/231 260/260
37 295/303 141/141 191/191 202/202 178/190 301/301 150/163 158/164 227/231 260/260
编号Code HESR210 HESR211 HESR245 HESR247 HESR267 HESR269 HESR356 rbm19 rbm28 rbm36
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3 215/218 311/314 133/140 300/335 114/125 265/271 330/330 146/146 230/236 237/264
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5 218/236 326/326 161/167 300/300 125/125 271/277 328/328 146/146 236/238 258/260
6 209/218 302/314 133/133 300/300 125/131 265/271 328/330 146/172 238/246 258/264
7 209/215 302/302 133/133 300/318 125/125 265/271 330/334 146/165 222/246 258/258
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16 215/215 314/314 133/167 300/300 125/125 265/271 330/330 146/146 236/238 258/262
17 209/236 302/326 131/140 300/302 114/125 265/265 328/334 146/146 222/228 254/254
18 215/215 311/311 133/133 300/300 125/131 265/265 328/328 146/159 236/236 258/264
19 218/218 314/314 131/149 300/300 125/125 265/265 330/334 150/165 230/250 260/264
20 218/236 311/311 133/133 300/300 125/131 265/271 328/328 146/165 236/236 237/254
21 215/218 311/314 140/149 300/302 114/125 265/277 328/330 146/150 222/222 258/264
22 215/218 311/314 133/140 300/335 114/125 265/265 328/328 146/159 222/222 262/264
23 215/236 311/326 133/133 300/300 114/125 265/265 328/330 146/159 222/222 237/258
24 215/236 326/326 133/140 300/335 125/125 265/265 328/328 146/165 222/236 262/264
编号Code HESR210 HESR211 HESR245 HESR247 HESR267 HESR269 HESR356 rbm19 rbm28 rbm36
25 218/236 326/326 133/140 300/300 125/131 265/271 328/330 146/146 236/246 237/254
26 215/215 314/314 133/133 300/300 125/131 265/271 328/334 159/165 236/246 260/262
27 215/218 314/314 133/133 300/300 125/125 265/265 328/330 159/165 236/236 258/264
28 215/236 326/326 133/133 300/300 125/131 265/265 328/330 146/146 236/236 254/258
29 215/236 326/326 133/133 300/300 131/131 265/271 328/330 146/159 236/236 237/258
30 218/221 314/317 133/140 300/335 120/125 265/277 334/338 146/150 226/226 258/264
31 218/218 314/314 133/140 300/335 120/125 277/277 330/338 146/165 226/250 237/237
32 218/218 314/314 131/131 300/335 125/125 265/265 334/338 146/165 236/250 237/260
33 215/236 326/326 133/133 300/300 131/131 265/271 328/330 146/146 236/246 254/258
34 215/215 311/311 133/133 300/300 125/125 265/265 328/328 146/159 222/236 258/262
35 218/221 314/314 133/133 335/337 120/125 265/277 330/338 146/154 226/236 237/264
36 218/218 314/314 131/131 300/335 125/125 265/265 334/338 146/165 236/250 237/260
37 218/218 314/314 131/131 300/335 125/125 265/265 334/338 146/165 236/250 237/260

3 讨论

本研究采用SSR荧光标记引物和毛细管电泳检测技术进行遗传多样性分析,相比传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染法检测,毛细管电泳检测技术不仅可以准确地读出等位变异的条带大小数据,即使扩增出来的等位基因相差1~2个碱基也能很好地检测出来,而且可以增加等位基因条带,减少人工读带的误差,使得检测结果更为精确、数据更为可靠[15-16],能更加准确地分析各品种间的亲缘关系。同时,基于DNA测序仪的扩增产物自动荧光检测方法,其检测效率明显高于聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染法。目前,在植物DNA指纹图谱构建中,SSR荧光标记毛细管电泳法已被广泛应用于作物种质资源鉴定和评价[17⇓-19],在品种甄别与物种保护中发挥着重要作用。在橡胶树研究领域,前人多利用普通的SSR聚丙烯酰胺凝胶电泳技术来进行橡胶树遗传多样性分析,而采用SSR荧光标记引物和毛细管电泳检测技术进行橡胶树遗传多样性分析,并构建相关DNA指纹图谱的研究未见相关报道。因此,以国内橡胶树主栽品种和主要亲本为供试材料,通过毛细管电泳技术构建相关品种精确位点信息的DNA指纹图谱,对于今后橡胶树品种的鉴定与甄别,以及分子辅助育种具有重要意义。
在植物DNA指纹图谱构建中,筛选和确定出适合品种鉴定的核心SSR引物组合是构建DNA指纹图谱的关键。要求筛选和确定出的核心SSR引物组合的标记多态性要好,其次要求用尽可能少的标记来区分开尽可能多的品种,引物多态性越高、数量越少在后期的品种鉴定中则越经济适用。因此,基于以上几点考虑,同时考虑到后期的毛细管电泳成本问题。本研究在SSR引物筛选和确定过程中先采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对参试橡胶树品种中PCR扩增谱带的特异性、多态性以及带型的易区分程度进行初筛,银染、显色后,筛选出一批在不同橡胶树品种间多态性丰富、带型清晰、特征谱带能够稳定重复的SSR引物;然后,利用毛细管电泳找出一对在所述各个橡胶树品种间多态性信息含量即PIC值最高,等位位点数最多的SSR引物作为橡胶树品种指纹图谱库构建的核心引物,这样的设计安排既充分利用了聚丙烯酰胺凝胶电泳易操作、成本低的特点,又兼顾了毛细管电泳检测效率高的优点。同时,利用毛细管电泳检测技术构建指纹图谱可以根据扩增片段大小进行整合,避免了聚丙烯酰胺凝胶电泳条带分离不开而造成的误差。
通过以上引物筛选流程的优化,本研究中共计筛选和确定出34对SSR引物作为构建橡胶树品种DNA指纹图谱库的核心引物,其中30对SSR引物可用于品种鉴定,4对SSR引物可作为备选引物用于后续新选育品种的鉴定。筛选和确定出的核心SSR引物表现出较高的多态性信息含量（PIC值）,其中PIC值高于0.5的引物高达97%,PIC值大于0.7的引物多达12对,PIC大于0.8的引物有2对。引物rbm28的多态性最高,可作为最佳引物用于鉴定中国橡胶树主栽品系的遗传多样性,而其他4条引物HESR025、HESR163、H-084、H-122同时具备较高的杂合率和多态性,可考虑作为备选引物。30对核心SSR引物共检测出161个等位基因条带,平均每对引物检测到5.4个等位基因,30对核心SSR引物的平均多态信息含量为0.65。利用30对核心引物扩增得到的多态性条带进行聚类分析,聚类结果显示37份橡胶树材料的遗传相似系数（GS）在0.11~0.63之间,变幅为0.52,表明37个供试橡胶树品种间遗传基础较为狭窄。以遗传相似系数0.25为阈值,可以将37个橡胶树品种分为5个类群,聚类结果与其系谱来源和亲缘关系比较吻合。
利用30对核心SSR引物对37份橡胶树品种进行扩增,得到相关品种的准确SSR位点信息,最终获得包含37个橡胶树品种的标准DNA指纹图谱库,其中33个橡胶树品种均具有唯一的DNA特征指纹。依据构建的DNA指纹图谱库,毛细管电泳检测与DNA指纹图谱分析表明,几个待测品种虽然在形态学上与橡胶树品种标准DNA指纹图谱中的橡胶树品种稍有差异,但通过与橡胶树品种标准DNA指纹图谱比对,‘PR107'和‘HPPR107',‘IAN873'和‘SF',以及‘RK628'‘08-3'和‘11-1'都为同物异名品种。由于种植于不同地方,植胶区环境类型的差异,待测橡胶树品种在形态学上表现稍有差异。通过以上橡胶树品种毛细管电泳指纹图谱的构建及应用,为今后橡胶树品种的鉴定与甄别提供了重要依据。同时,基于核心SSR引物组合构建的橡胶树标准DNA指纹图谱库可以直接用于橡胶树品种的真伪鉴定,解决了长期以来橡胶树品种早期鉴别的难题,使橡胶树品种鉴别不再受时空条件的限制,可为今后橡胶树品种选育提供参考依据。

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