随着国民经济的快速发展,中国对天然橡胶的需求逐年增加。根据中国国家统计局的数据,2020年国内天然橡胶产量占总消费量的25.15%,而近一半的天然橡胶产量来自位于热带地区的海南省。橡胶初加工废水是天然橡胶生产过程中产生的含有大量有机碳[1]（TOC）、粘度和酸性[2]的淡黄色废水。这种淡黄色废水称为胶清废水,因其处理成本较高且经常存在厌氧处理失效,导致后端废水处理不达标、甚至有较多废水直接被排入周边土壤而污染了周边土壤。
胶清废水主要包含来自橡胶作物的有机物,例如蛋白质[3]、氨基酸、糖类[4]、有机酸等和具有黏性的橡胶颗粒聚异戊二烯[5],以及在橡胶生产过程中用于保存乳胶的氨氮[6],杀菌剂二甲基四硫化秋兰姆（TMTD）以及用于胶清胶浓缩的硫酸。这些复杂成分使得胶清废水具有较高的TOC、粘度、酸性和可能的生物毒性。其中,胶清废水中的黏性聚异戊二烯会与蛋白质和糖类在土壤表面形成团聚体包裹在土壤颗粒表面,改变土壤微观结构,从而降低了土壤的通气性和排水性。进而富含有机物的胶清废水被土壤微生物厌氧发酵产生大量的恶臭气体。作为杀菌剂的TMTD在橡胶工业中常用作硫化剂,也常作为农药使用。研究发现,TMTD会扰乱雌性大鼠排卵的荷尔蒙控制[7],影响雌性大鼠的生殖周期,并导致大鼠的神经元毒性和行为变化。TMTD还引起人体的肾功能衰竭、具有致癌性和发育毒性[8]。因此,难以降解的TOC、粘度、酸性和可能的生物毒性,会对土壤微观结构和微生物群落结构产生极大的影响,进而对附近的生态系统造成危害。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验采用的实验菌群来源于海南大学有机污染物环境行为实验室筛选,以芽孢杆菌为优势菌属的微生物群落（Bacillus-dominated microbial consortium WR-2,以下均称为WR-2）。供试土壤取自海南大学基地,未受橡胶加工废水污染的红壤土,其中总有机碳（TOC）1.686 g/kg,电导率0.22 μs/cm,pH 5.68。供试胶清废水采集自某主要生产浓乳的加工厂。其中,化学需氧量（COD）约为18 000 mg/L,pH 4.23。固定化小球载体材料分别选择木薯渣生物质炭（木薯渣在马弗炉中以500℃恒温加热,直至形成木薯渣生物质炭,过100目筛）,椰糠和甘蔗渣（经破碎后由无菌水洗净,105℃烘箱烘干,粉碎过100目筛）。
1.2 方法
1.2.1 固定化微生物小球的制备及性能测试
将保存在4℃中的WR-2,接种于150 mL LB液体培养基中,29℃、150 r/min振荡培养24 h,得到菌液,用无菌水调节OD600值至1.0左右。选择生物质载体材料为1.5%和2%的比例,准确称量0.3 g和0.4 g的木薯渣生物质炭、甘蔗渣、椰糠,分别添加到20 mL的WR-2菌液中,在29℃恒温振荡箱中150 r/min振荡吸附1 h,加入80 mL质量分数为3%的海藻酸钠溶液混合,摇匀。使用一次性塑料滴管滴至质量分数为2%的CaCl2饱和硼酸溶液中固化,得到6组小球：1.5%木薯渣生物质炭（A1）,2%木薯渣生物质炭（A2）,1.5%甘蔗渣（B1）,2%甘蔗渣（B2）,1.5%椰糠（C1）,2%椰糠（C2）,放入4℃冰箱中交联24 h,用去离子水冲洗3次,于4℃冰箱中贮存。测定小球的质量、体积、密度、机械强度等性能。
1.2.2 胶清废水污染土壤的生物修复实验
将制备好的6种固定化小球各5 g加入到外源添加了145 mL原液胶清废水模拟污染（TOC为5000 mg/kg）的500 g灭菌红壤土中,放入生化培养箱中29℃培养30 d,每天添加20 mL无菌水,设置一个不加小球的对照,每组处理重复3次。在0、1、3、5、8、14、30 d分期取样,测定土壤的有机质（TOC）、pH值、电导率和微生物量。在0和30 d,将2%椰糠处理的土壤样品冷冻干燥以观察土壤微观结构,并使用扫描电子显微镜（SEM,Verios G4 UC,Thermo Scientific,USA）进行测量。
1.2.3 土壤TMTD降解实验
将筛选出的各方面性能都较为优异的2%椰糠,进行胶清废水污染土壤的TMTD降解验证试验。将制备好的2%椰糠固定化小球5 g加入到添加了TOC（5000 mg/kg）的1 kg灭菌红壤土中,放入生化培养箱中29℃培养30 d,设置不加固定化小球的对照,每组处理重复3次。在0、7、14、30 d分期取样,测定土壤中的TMTD含量。
1.2.4 数据收集
小球体积测定,随机挑选10个大小相似且均匀的小球为一组称取重量并记录。将上述小球放入量筒加蒸馏水到完全覆盖,量筒读数减去所加蒸馏水体积即为小球体积。取一颗小球置于电子天平中央,使用盖玻片均匀按压小球,观察和记录小球形变和出现裂痕时的质量作为小球的机械强度。土壤有机碳使用重铬酸钾氧化–分光光度法[12]测定,pH值采用pH计测定,电导率[13]采用土壤浸提液使用电导率计测定,土壤中可培养微生物总数[14]使用稀释-平板法测定。土壤TMTD含量测定[15]将土壤样品经过四氢呋喃萃取,过0.22 μm滤膜,进液相色谱仪检测。高效液相色谱仪检测条件流速为1 mL/min;柱温：30℃;流动相位V（甲醇）∶V（水）=50∶50;色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm,5-micron）;检测波长为254 nm;进样量为10.0 μL。TMTD标准曲线的绘制,配置TMTD标准溶液,进标准样10 μL进行检测,以峰面积为纵坐标,以进样TMTD含量为横坐标绘制标准曲线。TMTD标准回归方程Y=61954X- 59527,R2=0.9981,此标准曲线呈良好的线性关系,适合进行土壤中TMTD含量的检测。
1.3 数据处理
TOC降解率计算公式：
$TOC降解率= \frac{C_0 - C_i}{C_0 - S} ×100 \text{%}$
式中：C0为0 d时TOC含量5.383 g/kg,Ci为每次测得的TOC含量（g/kg）,S为供试红壤土的TOC原始值1.686 g/kg。
试验数据采用SPSS 26.0软件进行统计分析和单因素方差分析（ANOVA）,采用Origin 2018软件完成绘图。
2 结果与分析
2.1 固定化小球的形态及性能表征
6种固定化小球形态如图1所示,木薯渣和甘蔗渣形态从外观上看,载体材料分布较为均匀,而1.5%的椰糠载体材料分布并不均匀。6种包埋剂下制得的小球在质量、体积及密度上差异不显著,在机械强度方面则有所差异。实验结果见表1,从变形的质量结果来看,木薯渣和甘蔗渣在抗形变能力上与椰糠具有显著性差异,椰糠抗形变能力最差。在小球形态来看,椰糠固定化小球的载体材料分布不均匀,主要是由于椰糠因其良好的吸水性能,遇水后易凝结成团状,在菌液中不易均匀地分散。这也使得椰糠的固定化微球抗形变能力最差。不同载体材料制得的小球抗形变能力大小为1.5%木薯渣>2%甘蔗渣>2%木薯渣>1.5%甘蔗渣>2%椰糠>1.5%椰糠。从出现裂纹质量的结果来看,由于椰糠本身具有一定的结构硬度及稳定性能,在椰糠分布相对均匀的2%椰糠具有十分优异的抗裂纹能力。而木薯渣生物质可以与菌液充分混合,这也使得木薯渣生物质固定化小球具有全面的抗形变和抗裂纹能力。而2%椰糠出现裂纹的质量达到了200.3 g,且与1.5%、2%甘蔗渣、1.5%椰糠组有显著性差异。由于出现裂纹能直接导致固定化小球中的微生物流失,小球内包埋的微生物失去保护,固定化小球活性降低,因此出现裂纹的质量是衡量固定化小球机械性能的关键,综上考虑认为,不同载体材料制得的小球机械性能排序为1.5%木薯渣（A1）>2%椰糠（C2）>2%木薯渣（A2）>2%甘蔗渣（B2）>1.5%甘蔗渣（B1）>1.5%椰糠（C1）。
表1 不同固定化小球物理性能和机械强度Tab. 1 Physical properties and mechanical strength of different immobilized microspheres |
| 固定化小球 Immobilized spheres | 质量 Mass/g | 体积 Volume/mL | 密度 Density/(g•mL-1) | 变形质量 Deformation mass/g | 裂纹质量 Crack mass/g |
|---|---|---|---|---|---|
| 1.5%木薯渣 | 0.039±0.002a | 0.037±0.001a | 0.103ab | 24.3±1.2a | 176.7±8.4b |
| 2%木薯渣 | 0.038±0.001a | 0.037±0.019a | 0.101b | 22.0±2.1ab | 128.7±1.3c |
| 1.5%甘蔗渣 | 0.037±0.001a | 0.035±0.016a | 0.104ab | 20.0±0.8bc | 112.3±8.8cd |
| 2%甘蔗渣 | 0.037±0.001a | 0.035±0.028a | 0.107a | 23.3±2.1ab | 112.0±9.2cd |
| 1.5%椰糠 | 0.036±0.003a | 0.035±0.024a | 0.104ab | 15.7±2.5d | 111.0±11.8a |
| 2%椰糠 | 0.037±0.001a | 0.035±0.012a | 0.104ab | 16.7±0.9cd | 200.3±1.6a |
注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters after the same column of data indicate significant difference (P<0.05). |
2.2 不同固定化微球对胶清废水污染土壤的修复
2.2.1 海藻酸钠-生物质微球对土壤有机碳的影响
6种固定化微球对胶清废水污染土壤有机碳（TOC）修复性能如图2所示。土壤有机碳（TOC）降解率根据式（1）计算各组的TOC降解率,以降解速度和最终降解率作为微球土壤修复能力的主要评价指标。土壤TOC变化在1 d时,1.5%、2%木薯渣生物质炭和2%甘蔗渣组表现出了较快的降解速度,降解率均达到20%以上。3 d时,木薯渣生物质炭的两组及1.5%甘蔗渣组的土壤有机质含量出现异常,相比于1 d均出现不减反增的现象,结合3 d时观察发现木薯渣生物质炭组的微球最先在土壤中破裂,分析认为微球破裂后内部载体材料随菌液流出,且在取样时未充分混合均匀土壤,对混合较多木薯渣生物质炭的土样取出测定有机质,导致测得有机质含量增加;椰糠的两组降解速度和降解率仍然处于较低水平,只有2%甘蔗渣组表现出良好的降解性能。基于30 d的TOC降解率而言,除了1.5%木薯渣生物质炭组土壤有机碳降解率为70.3%外,其余五组的土壤有机碳降解率都达到了90%以上,其中2%甘蔗渣组降解率达到了100%。而未添加菌群的对照组,土壤TOC降解较少;土壤有机质降解性能大小顺序为2%甘蔗渣>2%椰糠>1.5%椰糠>1.5%甘蔗渣>2%木薯渣>1.5%木薯渣。
2.2.2 海藻酸钠-生物质微球对土壤pH的影响
不同固定化微球处理能使胶清废水污染土壤pH从5.27转变为弱酸性,处于6.26~6.43之间（图3）。其中30 d时,甘蔗渣组处理的土壤pH相较于其余两组偏低;木薯渣生物质炭组与椰糠组的土壤pH更接近原红壤土的pH值,这说明木薯渣生物质炭和椰糠作为载体材料对微生物降解土壤中的酸性物质有更好的促进作用。
2.2.3 海藻酸钠-生物质微球对土壤电导率的影响
胶乳存放过程中的加氨保存和杀菌剂秋兰姆/ ZnO,以及胶清胶凝固时加入的硫酸,及天然橡胶胶乳中含有的阳离子和有机酸等,随废水进入土壤后都可能影响土壤的电导率。不同固定化小球对胶清废水污染土壤电导率的影响情况如图4。固定化小球对土壤电导率的影响呈现出逐渐降低的趋势。处理30 d后,由初始值2.11 μs/cm降低至1.65 μs/cm以下,且电导率的降低主要在前14 d变化明显,14 d后整体电导率变化不大。其中,椰糠组从5 d开始就表现出了显著差异,且降低幅度最大。基于30 d电导率的降低程度,不同浓度和载体材料固定化小球的影响排序为1.5%椰糠>2%椰糠>1.5%甘蔗渣>1.5%木薯渣生物质炭> 2%甘蔗渣>2%木薯渣生物质炭。土壤电导率的降低,可能是微生物群落代谢活动对阴阳离子的吸收转化,以及载体材料对阴阳离子的吸附作用。
2.2.4 海藻酸钠-生物质微球对土壤可培养微生物量的影响比较
微生物群落在环境中的生存能力可能会影响其生物修复的应用潜力。土壤可培养微生物量可以间接反应微生物群落在土壤中的生存和适应能力。不同固定化微球对于土壤可培养微生物量影响情况见图5。添加固定化小球后土壤微生物量在前3 d内保持在较高水平,之后的微生物量较少。其中2%椰糠组在3 d时的土壤可培养微生物量最高,使土壤微生物量达到了3.03×108个,结合椰糠改良的固定化小球机械性能良好,不易破裂,在土壤环境中为细菌群落的生长提供了良好的环境。14 d后各组的微生物量都维持在较低水平,此时大部分土壤有机质已被降解,说明微生物的碳源等营养物质减少,微生物开始大量衰亡,仅在较低水平下维持生存。到30 d时,木薯渣活性炭微生物量偏低,其中1.5%木薯渣活性炭组微生物量最低,只有12×106个,与其具有较差土壤TOC降解能力相符。
2.3 2%椰糠固定化微球对污染土壤中二硫化四甲基秋兰姆的降解及土壤结构变化
3 讨论
本研究挑选了3种海南省特色的农业废弃物木薯渣、椰糠、甘蔗渣作为固定化小球的改良载体。研究了3种不同载体材料包埋不同浓度WR-2菌群的基础性能和胶清废水污染土壤的生物修复实验。实验结果表明,2%浓度的椰糠在固定化小球基础指标和胶清废水污染土壤修复中表现出优异的性能。原因可能是：由椰子外壳纤维制得椰糠在经过碾压粉碎过筛后,含有大量的粗纤维,以及多孔隙结构和出色的硬度,利于微球细菌细胞的繁殖及贮存。另外,椰糠自身就是可供微生物利用的有机材料,在微球的贮存期细菌细胞也不会缺少碳源而死亡。促使椰糠固定化微球优于其余载体材料的修复性能。
土壤微观结构方面,随着WR-2菌群的代谢活动,改良了橡胶初加工废水污染土壤表层的粘性结构,将包裹在土壤表层,由聚异戊二烯、糖类和蛋白质形成的团聚体[23]充分降解;调节了土壤理化性质的同时,进一步改善了土壤微观结构。在椰糠固定化载体材料和WR-2的共同作用下,减弱了橡胶废水对于土壤通气性和排水性的影响。因此,选择海藻酸钠-2%椰糠作为WR-2的固定化小球制备方式,为优化胶清废水污染土壤的生物修复能力,以及即时应用提供了理论依据。