花色是观赏植物最重要的性状之一,也是植物自然进化过程中最具适应意义的表型性状[1]。目前国内外已有许多关于植物花色的研究,包括花色素苷结构、花色变异机理、花色成色机理等方面[2-3]。不同植物的花色形成机理并不完全相同,其中花色素苷的合成代谢对植物花色的影响最为直接[4]。而决定花色素苷合成的基因主要包括结构基因和调节基因,结构基因编码参与花青素苷生化反应的合成酶类,如C4H、CHS、DFR等[5];调节基因编码的转录因子则可决定结构基因表达与否以及表达的强弱,如WD40、MYB、BHLH等[6]。其中WD40是真核生物中的大家族,具有调节花青素苷生物合成、植物生长发育、非生物胁迫响应等功能,且WD40的重复结构域具有提高与其他蛋白互作的能力[7]。植物花色素苷的合成除了由基因调控还受到周围环境的影响,如光照、温度和激素等,其中光是影响植物花青素苷生物合成的最重要的环境因子之一,且光可以通过光信号影响与花青素苷合成相关基因的表达[8⇓-10]。WD40亚家族的LWD1和LWD2基因在拟南芥的光周期途径中起着重要的作用,并调节光周期感知的输出基因的正确的表达[11],并且植物的光受体感知光信号后,会进一步调控下游转录因子的表达,从而促进或抑制结构基因的表达,最终影响植物中花青素的合成[12]。有研究表明在强光下花青素苷的积累量显著提高,但在弱光或黑暗条件下相关基因的表达被下调或抑制,使植物花青素苷的含量下降,从而产生白色或浅色器官[13⇓⇓-16]。在拟南芥中,进行蓝光处理或过量表达CRY1或CRY2的转基因植株均能促进花青素积累[17-18]。强光可以增加苹果MdMYB1的表达,上调下游基因的表达,促进果皮中花青素的积累[19];由SlaN2、BrTT8和SlaN11组成的MYB-bHLH- WD40复合物可在强光下触发番茄果实中不均匀的花色苷积聚[20]。已有研究表明与LWD1和LWD2基因同属一个亚族的TTG1基因除了参与拟南芥花青素苷的调控,还具有调节拟南芥光周期的功能[21];LWD1和LWD2基因作为已知的生物钟调节因子,其是否在植物花青素合成调控中起作用尚不明确,有待深入研究。
滇水金凤（Impatiens uliginosa）是凤仙花科凤仙花属一年生或多年生的中国特有植物,主要分布于中国西南地区,其花繁色艳、花期长、抗性强、生物量大,具有较高的观赏价值,并广泛应用于滇池等湿地建设。本研究以滇水金凤为材料,通过RT-PCR等技术对LWD基因进行克隆,并对其序列结构、系统发育进行分析;再通过qRT-PCR分析其在不同花色及不同花发育时期中的表达情况,以期进一步了解LWD基因在滇水金凤花色苷合成途径中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
滇水金凤采自昆明市捞鱼河湿地公园,其中红色为野生型,另有白色、粉色和深红色为突变型,样品采集后于液氮速冻,再置于-70℃冰箱中备用。以红色滇水金凤花器官为材料进行目的基因的克隆,以滇水金凤4种不同花色及其4个不同花发育时期（S1花苞期、S2始花期、S3盛花期、S4谢花期）的花器官来检测目的基因的相对表达量（图1）。
1.2 方法
1.2.1 滇水金凤总RNA的提取与LWD基因的克隆
采用RNA提取试剂盒（OMEGA）提取滇水金凤花器官总RNA;参照逆转录试剂盒（全式金）将RNA逆转录为cDNA,最后置于-20℃中备用。
根据转录组数据设计IuLWD1和IuLWD2的特异性引物（本研究所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成）。引物：IuLWD1F（5°-ATGGTGGCGAGAAGCGACCAGAAC-3°）、 IuLWD1R （5°-TCATACCCTAAGAATTTGAAGCTTACTAGAGAAGGC-3°）; IuLWD2F（5°-ATGGTGGCGAGCAGTGACCCGAACCAAGATG-3°)、 IuLWD2R(5°-TCATACCCTCAGGATTTGAAGCTTACTAGAG-3°）。 以红色滇水金凤cDNA第一链为模板进行LWD基因的cDNA扩增。PCR反应总体系为20.0 µL,其中d N T P M i x t u r e 1.6 µL,1 0×B u f f e r（M g2+）2.4 µ L, E a s y T a q D N A P o l y m e r a s e 0.2 µ L,上下游引物各1.0 µ L,模板1.0 µ L,最后用d d H2O补足。PCR反应程序：95℃ 5 min;95℃ 50 s,59℃(IuLWD1)/64℃(IuLWD2) 30 s,72℃ 1 min,35个循环;72℃ 10 min,4℃ 10 min。胶回收后连接载体并转化大肠杆菌,挑菌验证后进行测序。
1.2.2 IuLWDs基因生物信息学分析
使用Expasy分析IuLWD1和IuLWD2的基本理化特性;运用NCBI的CDD工具预测目的基因结构域;采用BLAST工具于NCBI中查找同源序列,并用DNAMAN 6.0软件进行序列比对;利用MEGA 7.0软件构建系统发育树。
1.2.3 IuLWDs基因的时空表达模式分析
分别提取4种不同花色及4个不同花发育时期的滇水金凤花器官总RNA,然后逆转录成cDNA。IuLWD1和IuLWD2基因的qRT-PCR引物：qIuLWD1F（5°-GAGACAGAACCGAAGCGAGT-3°）、qIuLWD1R（5°-CCGAGTCGAACCAAAGGAGT-3°）;qIuLWD2F（5°-AAGATGGTTCCGACGAGCAA-3°）、qIuLWD2R（5°-GAGGTCAGGCTTCTGGCATT-3°）。qRT-PCR的内参基因为Actin：ActinF（5°-TGAATGTCCCTGCTGTTTG-3°）、ActinR（5°-ACCTTCCGCATAACTTTACC-3°）。采用2-∆∆CT法计算基因相对表达水平,每个样品进行3个重复,将花苞期定义为1个单位作为对照,对目的基因在4种不同花色及4个不同花发育时期的表达量进行qRT-PCR分析,并用SPSS软件进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 滇水金凤LWD基因的基本理化性质及保守域分析
在滇水金凤转录组数据的基础上设计特异性引物,以滇水金凤的cDNA为模板,通过RT-PCR克隆获得2条LWD基因片段,与转录组序列无差异,分别命名为IuLWD1和IuLWD2（图2）。
运用ExPasy-ProtParam对滇水金凤LWD基因进行分析,IuLWD1和IuLWD2全长分别为1041 bp和1032 bp,分别编码347和344个氨基酸。GC含量分别为46%和50%;原子总数分别为5398和5424;相对分子量分别为38 838.47 kDa和39 029.65 kDa;理论等电点分别为4.71和4.70。不稳定指数分别为53.60和52.58,均属于不稳定蛋白。总平均亲水指数分别为-0.388和-0.366, 均为亲水性蛋白。运用CDD进行结构域分析,结果显示IuLWD1和IuLWD2蛋白均含有6个典型的WD40-repeat保守结构域,推测IuLWD1和IuLWD2蛋白属于WD40超家族（图3）。
2.2 滇水金凤LWD基因的系统进化分析
运用DNAMAN软件对源自不同物种的LWD基因进行氨基酸同源序列比对分析,结果表明,滇水金凤IuLWD1与其他植物具有较高的同源性,约85%,如芍药科的牡丹（AIU98519.1）和葡萄科的葡萄（NP_001268006.1）等;IuLWD2与其他植物也具有较高的同源性,约90%,如杨梅科的杨梅（KAB1200607.1）和杨柳科的毛果杨（XP_002321066.1）等。此外,IuLWD具有WD40家族典型的WD repeats保守结构域,并且序列比对结果表明源自不同物种的LWD氨基酸序列在某些区域是高度保守的（图4）。运用Neighbor- Joining法,Bootstrap值为1000,根据IuLWD氨基酸及其同源氨基酸序列构建系统发育树,结果发现IuLWD1与葡萄和牡丹聚为一支,IuLWD2与杨梅聚为一支,然后共同聚类在一支,IuLWD1和IuLWD2并未直接聚在一起,推测二者为旁系亲缘关系（图5）。
2.3 滇水金凤LWD基因的表达分析
结果表明,IuLWD1和IuLWD2基因在滇水金凤4种不同花色及其4个不同花发育时期的花器官中均有表达,且均在深红色滇水金凤表达最高,其次是红色和粉色滇水金凤,而在白色滇水金凤中表达最低,其表达量均与滇水金凤花色呈正相关,这在一定程度上说明二者功能较类似[22]。其中IuLWD1基因在白色花器官中的表达量无明显波动,仅S1~S2和S3~S4阶段有显著性差异;在粉色花器官中,S1~S3阶段IuLWD1的表达量显著上升,S4阶段的表达量几乎为0;在红色花器官中,IuLWD1表达量在S3（盛花期）阶段达到峰值,约为S1阶段的6倍,与其他阶段的表达量均呈现显著性差异;在深红色花器官中S2（始花期）阶段表达量最高,是S1阶段的14.5倍左右,而后呈下降趋势,4个阶段的表达量均呈现显著性差异。IuLWD2基因在白色滇水金凤中的表达量均显著低于S1（花苞期）阶段,呈现先下降后上升的趋势;在粉色滇水金凤中IuLWD2基因在S2阶段（始花期）表达量最高,约为S1阶段的2倍,4个阶段均有显著性差异;红色和深红色滇水金凤中的S1~S3阶段显著升高,并在S3（盛花期）阶段达到峰值,分别为S1阶段的2倍和3倍左右,S4阶段表达量几乎为0（图6）。综上所述,随着花发育时期的推移,除了白色滇水金凤中IuLWD2基因表达量,在4种不同花色滇水金凤中LWD基因的表达量均呈先上升后下降的趋势,推测LWD基因参与了滇水金凤花色的调控;并且IuLWD1基因的表达量高于IuLWD2基因,可能IuLWD2基因在滇水金凤中的调控能力弱于IuLWD1基因。
图6 IuLWD1（A）和IuLWD2（B）基因在4种不同花色滇水金凤及其4个不同花发育时期的表达分析不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 Fig. 6 Expression analysis of IuLWD1 (A) and IuLWD2 (B) from four different colors of I. uliginosa and their four different stages of flower development Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). |
3 讨论
WD40作为转录因子的大家族,其结构高度保守,并具有多种生理生化功能[23-24]。本研究基于滇水金凤转录组数据,成功克隆了滇水金凤WD40家族的IuLWD1和IuLWD2基因,其cDNA全长分别为1041 bp和1032 bp,分别编码347 aa和344 aa,均属于亲水性不稳定蛋白;均不含内含子,这与WU等[11]的结果一致。结构域分析发现2个基因均具有典型的WD-repeat保守结构域,且WD基元数量均为6个,推测IuLWD1和IuLWD2蛋白属于WD40超家族。然而,在IuLWD1和IuLWD2蛋白中,除了WD重复序列外,没有已知的蛋白结构域被识别,IuLWD1和IuLWD2在滇水金凤中的具体作用方式还有待进一步探究。TTG1与LWD1和LWD2属于同一个WD40亚族,且TTG1是表皮细胞分化和色素产生的调节因子,最近的研究表明TTG1也参与拟南芥的生物钟调节[21];而LWD1和LWD2是已知的生物钟调节因子,推测其与同亚族的TTG1存在部分功能交叉,也对植物花色素苷的合成有一定的影响。通过系统发育树分析发现,滇水金凤IuLWD与牡丹、葡萄和杨梅聚类在同一支上,进化关系更近;有研究表明牡丹的PsWD40基因与花青素合成调控有关[25],推测滇水金凤的IuLWD基因可能也参与了其花色素苷合成的调控。而且LWD1和LWD2在多种生物体中的流行意味着这些蛋白质普遍参与生长和（或）发育过程,但是大多数生物体中该基因的生物学功能的报道仍然有限,因此,滇水金凤IuLWD1和IuLWD2基因的克隆及表达分析有望为这些同源蛋白的功能阐明提供线索。对4种不同花色及4个不同花发育时期的滇水金凤花器官进行qRT-PCR分析发现,IuLWD1和IuLWD2基因均是在深红色滇水金凤中表达量最高,白色滇水金凤中表达量最低,且2个基因的表达量均与花色呈正相关,可以推测IuLWD1和IuLWD2均在滇水金凤花色素苷的生物合成中发挥作用,并且2个基因存在功能冗余;但IuLWD1基因的表达量要高于IuLWD2,猜测IuLWD1基因对滇水金凤花色形成的调控作用强于IuLWD2基因。目前许多植物的花色表型变化及与花色形成相关基因的表达调控模式仍有待进一步研究[26],IuLWD基因是和TTG1一样通过与其他转录因子相结合共同调控花色素苷的合成还是通过调节其他的基因从而间接调控花色素苷的合成,还有待进一步的研究。
IuLWD基因在深红色滇水金凤中的高表达及白色滇水金凤中的低表达,表明该基因的表达量在一定程度上正向调控滇水金凤花色, qRT-PCR结果也进一步表明该基因可能参与滇水金凤花色素苷的合成,并在花色素苷的合成调控中发挥作用。上述结果为后续凤仙花花色遗传改良及新品种培育提供基础数据和科学依据。