镉（Cd）是一种对动植物具有剧毒,且毒性持久的非必需元素,严重影响农作物的产量和质量[1]。镉进入植物体后,会替换其他离子吸收转运相关的结合位点,导致新陈代谢紊乱,影响细胞结构[2-3],当土壤受到镉污染后,镉会在生物体内富集,并通过食物链进入人体从而引起慢性中毒[4]。生态环境部2020年5月7日公布的《2019年全国生态环境质量简况》中指出,影响农用地土壤环境质量的主要污染物是重金属,其中镉为首要污染物。
植物经过长期进化演变,进化出了一套复杂的耐镉机制,主要包括细胞壁、抗氧化系统、螯合蛋白、转运蛋白等协同作用,消除由镉引发的O2-·、H2O2过量积累导致的膜脂过氧化反应和细胞膜损坏[5]。当植物面对氧化胁迫时可启动由超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶组成的自身保护系统,提高清除活性氧自由基（ROS）的能力,其中SOD作为抵抗ROS的第一道防线[6-7],可快速将O2-·转化为H2O2[8-9],降低过氧化伤害,提高植物耐镉性。非巯基蛋白如植物螯合肽（phytochelatin, PCs）等能直接螯合重金属离子参与解毒。PCs是由植物螯合肽合酶（phytochelatin synthase, PCS）催化,以还原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）为底物合成[10],PCs中半胱氨酸的巯基（-SH）结合Cd2+形成Cd-PC复合物,并通过液泡膜上的转运蛋白-ABC运输体将其转运至液泡内完成对镉的解毒作用[11⇓-13]。
1 材料与方法
1.1 材料
供试品种为耐镉品种‘川苎8号',生化试剂OmniPlant RNA Kit（DNase I）购自康为世纪（北京）生物科技有限公司,EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Green qPCR SuperMix购自全式金（北京）生物技术有限公司,超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）试剂盒购自索莱宝（北京）生物科技有限公司,谷胱甘肽（GSH）、非蛋白巯基（NPT）购自南京建成生物工程研究所。
1.2 方法
1.2.1 试验设计
盆栽试验于2021年3—7月在湖南农业大学苎麻智能温室进行。于苎麻种质资源圃剪取嫩梢,扦插育苗,麻苗均高25~30 cm时,选取高度、长势一致的健康苗定植于以膨胀珍珠岩基质的聚乙烯塑料盆中。每周添加一次1/2 Hoagland全面营养液。培育3周后,在苎麻盆栽中添加镉溶液500 mL。Cd2+供体为镉标准溶液,试验设置0、5、25、50 mg/L 4个Cd2+浓度水平,以不加镉标准液为对照,每个处理重复3次。
1.2.2 测定项目
（1）生物量与镉含量测定。镉处理1周后小心取出整株苎麻,用去离子水洗净尘土与珍珠岩,吸水纸擦干水分,称重记录,一部分经105℃杀青30 min,然后65℃烘干至恒重,研磨、过筛,样品采用HNO3-HClO4法消化。采用SOLAAR M6型原子吸收光谱仪测定重金属镉含量。另一部分按地下部、地上部分别用液氮速冻,于-80℃保存,备用。
（2）生理指标测定。超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、过氧化氢（H2O2）含量采用北京索莱宝生物科技有限公司试剂盒测定,谷胱甘肽（GSH）、非蛋白巯基（NPT）含量采用南京建成生物工程研究所相应的试剂盒测定。植物螯合肽（PCs）含量=非蛋白巯基（NPT）含量-谷胱甘肽（GSH）含量。
（3）BnPCS1与BnGCL1表达分析。苎麻植物螯合肽合成酶基因（BnPCS1）和半胱氨酸连接酶基因（BnGCL1）的引物序列根据苎麻基因组（PHNS00000000.1）中的PCS1和GCL1基因序列设计。引物由擎科生物有限责任公司合成,引物序列见表1。
表1 引物序列Tab. 1 Primer sequence |
| 引物名称 Primer name | 引物序列（5'-3'） Primer sequence (5'-3') | 引物用途 Primer purpose |
|---|---|---|
| Actin-F1 | GCTCCGTTGAACCCTAAG | 内参引物 |
| Actin-R1 | GCTCCGATTGTGATGATTT | |
| BnPCS1-F | TGAGGGCCAACGGTGATAAG | BnPCS1引物 |
| BnPCS1-R | CACCGCAAGAAGAGCAAGTC | |
| BnGCL1-F | CGGCCAGTTTGAGCTTAGTG | BnGCL1引物 |
| BnGCL1-R | TTCCTCGGCAACAGCTTTGA |
各处理分别取1 g苎麻组织,提取总RNA,反转录成cDNA作为模板,进行实时荧光定量PCR扩增检测基因的表达量。反应体系为：2×SYBR Green PCR Mix 10 µL、QF（10 μmol/L）0.5 μL、QR（10 μmol/L）0.5 μL、cDNA 2 µL和ddH2O 7 µL。反应条件为：94℃（30 s）;94℃（5 s）、61℃（35 s）45个循环。每个样本重复3次。以苎麻肌动蛋白（β-actin）作为内参。采用2-∆∆CT法计算基因的相对表达量。
1.3 数据处理
采用SPSS 24.0和Origin 2019软件对试验数据进行统计分析与作图。采用LSD法分析差异显著性。F检验P≤0.05时为显著差异。
植株地上部重金属累积量=植株地上部重金属含量×植株地上部生物量;植株地下部重金属累积量=植株地下部重金属含量×植株地下部生物量。转运系数=植株地上部镉含量（mg/kg）/植株地下部镉含量（mg/kg）。
2 结果与分析
2.1 镉胁迫对苎麻生长的影响
2.2 镉胁迫对苎麻镉含量、镉积累量和转运系数的影响
随着镉处理浓度的上升,苎麻地上部与地下部镉含量显著上升,50 mg/L镉处理的地上部与地下部镉含量达到最高,分别为38.79 mg/kg和69.04 mg/kg,且各处理下地下部含量均高于地上部。25 mg/L和50 mg/L镉处理的地上部镉含量较5 mg/L处理显著上升126.82%和204.24%,地下部镉含量与5 mg/L处理相比显著上升了99.55%和213.96%（图2A）。在25 mg/L处理下‘川苎8号'植株内镉积累量达到最高,且显著高于其他处理,5、25、50 mg/L镉处理的每株地上部镉积累量分别为48.69、57.93、39.24 μg,每株地下部积累量分别为68.71、81.13、50.57 μg（图2B）。各个处理的转运系数均小于1（图2C）。
2.3 镉胁迫对苎麻氧化胁迫和抗氧化酶活性的影响
丙二醛（MDA）作为植物细胞脂质过氧化的最终产物,可作为植物氧化胁迫程度的指标[17]。5、25、50 mg/L镉胁迫下‘川苎8号'地上部的MDA含量分别较对照显著下降了14.23%、10.31%和57.31%,5 mg/L镉处理时地下部MDA含量达到最高,较对照显著上升13.99%,后随处理浓度的上升较对照分别降低5.20%和36.69%;50 mg/L镉处理的地上部与地下部MDA含量均为最小值（图3A）。50 mg/L镉处理的地上部H2O2含量达到最高且显著高于其他水平,较对照显著上升30.47%;而25 mg/L镉处理的地下部H2O2含量显著高于其他处理,较对照显著上升34.56%,50 mg/L处理的含量最低,较对照显著下降24.13%,各个处理的地下部H2O2含量显著高于地上部（图3B）。镉胁迫后地上部与地下部超氧化物歧化酶（SOD）活性显著增加,5、25、50 mg/L镉处理下地上部SOD活性较对照分别增加了89.34%、14.75%和113.08%,地下部SOD活性较对照分别增加了320.82%、90.30%和64.41%;5 mg/L和25 mg/L镉处理的地下部SOD活性高于地上部,50 mg/L镉处理的地上部SOD活性显著高于地下部（图3C）。
2.4 镉胁迫对苎麻植物螯合肽（PCs）和谷胱甘肽（GSH）含量的影响
5 mg/L镉处理时‘川苎8号'地上部PCs含量较对照下降10.05%,25 mg/L和50 mg/L镉处理较对照分别增加了5.08%和2.06%;5、25、50 mg/L镉处理下地下部PCs含量分别较对照下降了22.25%、13.12%和0.57%（图4A）。5 mg/L镉处理时地上部GSH含量较对照显著增加16.08%,25 mg/L和50 mg/L镉处理时分别较对照下降12.69%和42.71%;在5 mg/L和25 mg/L处理时地下部GSH含量分别较对照显著下降12.39 %和27.75%（图4B）。‘川苎8号'地上部PCs和GSH含量均显著高于地下部,植株PCs含量显著高于GSH含量。
2.5 镉胁迫对BnPCS1和BnGCL1的相对表达量的影响
植物螯合肽合酶（PCS）是控制植物螯合肽（PCs）合成的关键酶。5 mg/L镉处理时‘川苎8号'地上部的BnPCS1相对表达量达到最高,较对照显著增加了30.47%,25 mg/L镉处理时最低,较对照显著降低了37.59%;地下部的BnPCS1相对表达量随镉浓度的增加显著下降,5、25、50 mg/L各处理的表达量分别较对照下降了35.05%、60.95%和71.19%（图5A）,各处理的地下部BnPCS1相对表达量均高于地上部。γ-谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCL）是谷胱甘肽（GSH）合成途径的限速酶,GCL通常决定细胞GSH水平和GSH的生物合成能力。,5、25、50 mg/L镉处理下‘川苎8号'地上部的BnGCL1相对表达量分别较对照减少了53.50%、20.63%和5.79%,地下部的BnGCL1表达量分别较对照减少了56.23%、62.47%和68.14%（图5B）。
2.6 镉胁迫下镉含量与生理指标及相关基因表达量的相关性分析
低浓度（5 mg/L）处理的地上部、地下部SOD活性均与镉含量呈极显著正相关（P<0.01）;高浓度（25 mg/L和50 mg/L）下,地上部SOD活性与镉含量呈极显著正相关（P<0.01）,地下部SOD活性与镉含量呈极显著负相关（P<0.01）。H2O2与镉含量的相关性和SOD活性一致。各个浓度处理下地上部BnPCS1的相对表达量均与镉含量呈极显著正相关（P<0.01）,地下部的BnPCS1相对表达量与镉含量呈显著负相关（P<0.01）;在高浓度下地上部的BnGCL1相对表达量与镉含量呈正相关（P<0.01）（图6）。
图6 镉含量与生理指标及相关基因表达量的相关性分析A：5 mg/L,地上部;B：5 mg/L,地下部;C：25 mg/L和50 mg/L,地上部;D：25 mg/L和50 mg/L,地下部。 Fig. 6 Correlation analysis of Cd content with physiological indexes and related gene expression A: 5 mg/L, aboveground; B: 5 mg/L, underground; C: 25 mg/L and 50 mg/L, aboveground; D: 25 mg/L and 50 mg/L, underground. |
3 讨论
镉作为植物非必需金属元素,当植物组织镉含量超过5~10 μg/g时,对植物造成毒害作用,影响植株的生长[18],其具体表现为植株矮小、生物量减少等[19-20]。本研究中,5 mg/L镉处理提高了苎麻的株高、根长与生物量,25 mg/L和50 mg/L镉处理下苎麻株高、根长与生物量显著降低,但叶片始终保持绿色。‘川苎8号'地下部与地上部镉含量随镉浓度的上升逐渐增加,且地下部镉含量始终高于地上部镉含量,各浓度处理下转运系数均小于1,这与猕猴桃[21]、葡萄[22]、山定子[23]的分布规律一致,表明‘川苎8号'主要通过根部积累镉,根对镉有较强的滞留作用,可限制镉从根系向地上部迁移,减少对地上部光合系统的损伤。
植物在正常条件下能够有效地清除体内的活性氧自由基（ROS）使细胞免受伤害,但在重金属镉毒害胁迫下,植物体内的ROS产生速度超过植物清除ROS的速度,造成ROS在细胞中积累[24],产生丙二醛（MDA）等产物并造成DNA和蛋白质损伤以及细胞脂质过氧化[25]。在本研究中,除地下部MDA活性在5 mg/L处理时出现小幅上升外,其余均低于对照,说明‘川苎8号'在镉胁迫下受到的氧化伤害较小,细胞膜的稳定性和功能的完整性没有受到较大损害。本研究中,镉处理下‘川苎8号'体内超氧化物歧化酶（SOD）活性均高于对照,低浓度（5 mg/L）处理下SOD活性与镉含量在地上部、地下部位均呈极显著正相关（P<0.01）,高浓度下（25 mg/L和50 mg/L）,地上部SOD活性与镉含量呈极显著正相关（P<0.01）,地下部SOD活性与镉含量呈极显著负相关（P<0.01）。低浓度镉处理时‘川苎8号'通过提高体内SOD活性将有害的O2-·转化为H2O2和O2,能有效清除过量的活性氧,以保持细胞内抗氧化酶系统的平衡,减轻脂质过氧化程度与过氧化胁迫,这也从侧面解释了‘川苎8号'体内H2O2含量上升的原因。高浓度镉处理时地下部SOD活性降低,但是植物氧化胁迫程度的指标MDA含量并没有增加,说明除了抗氧化酶,‘川苎8号'存在其他的解毒途径防止植株遭受氧化伤害。
除抗氧化酶外,植物应对重金属胁迫的另一个策略是在细胞内合成巯基化合物（GSH和PCs等多肽物质）螯合重金属,减轻游离重金属离子对细胞的毒害。PCs是一类结构特殊的金属巯蛋白,是以GSH为底物的生物合成的酶促产物。GSH作为PCs的前体,由γ-谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCL）和谷胱甘肽合成酶（GS）通过ATP催化合成,合成过程中由多种因素调节,主要以GCL的调节为主[26]。孙琴等[27]研究发现小麦根系GSH含量随Cd浓度的增加而上升。ZHAO等[28]发现Pb胁迫下矿区生态型华中盖蹄蕨根和叶中的GSH含量均显著升高。同时有研究认为,GSH和PCs在植物不同部位承担着重金属解毒功能,PCs主要在根部,而GSH则在叶片的解毒上有更显著的作用[29]。另外,近年来研究发现植物根系通过减少植株PCs的合成来减少镉向地上部的运输,从而降低镉对叶片等器官的毒害,增强作物耐镉性能[30]。本研究中,5 mg/L镉处理的地上部和地下部PCs含量下降,50 mg/L镉处理时升高,与李雪玲[31]的研究结果相似,说明高浓度下进入细胞的大量Cd激活了PCs合成酶,进而促进了PCs的合成,也导致底物GSH含量持续减少。
镉处理下刚毛柽柳[32]叶片ThPCS1基因与苜蓿[33]根和茎尖MsPCS1基因表达下调,推测可能与PCS在植株不同部位发挥耐镉作用有关。本研究中,5 mg/L镉处理的地上部BnPCS1基因上调表达,其余处理的相对表达量均下调,在各个浓度处理的地上部BnPCS1基因相对表达量均与镉含量呈极显著正相关（P<0.01）,地下部BnPCS1相对表达量与镉含量呈极显著负相关（P<0.01）,进一步说明PCs在地上部和地下部承担着不同的解毒作用;高浓度镉处理的地上部BnGCL1相对表达量与镉含量呈极显著正相关（P<0.01）,地下部BnGCL1相对表达量与镉含量呈极显著负相关（P<0.01）,说明GSH在地上部和地下部的解毒作用也不相同。综合分析得出,‘川苎8号'在低浓度镉胁迫时主要通过激活抗氧化酶活性消除细胞中自由基的毒害,高浓度镉胁迫时通过调节抗氧化酶活性和PCs与GSH合成解除镉的毒害。