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2022 , Vol. 43 >Issue 3: 634 - 643

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.023

Post-harvest Treatment ＆ Quality Safety

Effect on Metabolites of Dendrobium officinale by Different Cultivation Substrates Based on Derivative GC-MS Method

  • ZUO Simin 1 ,
  • FU Jiashun 1 ,
  • YU Haidong 1 ,
  • YUN Yonghuan , 1, 2, *
Expand
  • 1. School of Food Science and Engineering, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China
  • 2. Institute of Environment and Plant Protection, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China
*YUN Yonghuan,E-mail：

Received date: 2021-09-23

  Request revised date: 2021-11-30

  Online published: 2022-03-23

Copyright

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Fold

Abstract

Cultivation substrate is one of the main factors affecting the growth of Dendrobium officinale. In this study, the substrates of pine bark (PB), coconut coir (CC) and the mixture of pine bark∶coconut coir in 1∶1 ratio (PC) were used to plant D. officinale. On the basis of metabolomics, the effects of the properties of the three cultivation substrates on the metabolism of D. officinale stems were investigated. Cutting ring method was used to determine the physical properties of the three cultivation substrates, phenol-sulphuric acid method was used to detect the content of polysaccharides, and gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) method was performed to detect the primary metabolites. The results indicated that the aeration porosity and water holding capacity in the group of coconut coir and complex substrate were higher than that of the substrate of pine bark, the content of polysaccharides were ranked as coconut coir > complex substrate > pine bark. Principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) for multivariate statistical analysis of 42 identified metabolites showed that the samples cultivated in different substrates clustered into one group, and the separation between groups was obvious, indicating the metabolites of the samples from different groups existed a significant difference. Combined with fold change (FC), the VIP values calculated based on the OPLS-DA model were used to screen the metabolites with significant difference. When the conditions (VIP>1 and FC≥2 or FC≤0.5) were set, there were a total of fourteen, eleven and five metabolites, with significant differences in content across groups being screened in the comparison of pine bark and complex substrate, pine bark and coconut coir, complex substrate and coconut coir, respectively. A large part of metabolites with significant difference in the group of coconut coir and complex substrate performed a lower accumulation in the pine bark group. The results gained by combined analysis between the physical properties of the three cultivation substrates and the metabolites with significant difference revealed that if the cultivation substrate had the weaker aeration and capacity of water supply, there would be a stronger expression in crassulacean acid metabolism (CAM). Thus, C3 pathway would become weaker, and carbohydrates accumulate less. In other words, the substrate with the properties of high aeration porosity and good water holding capacity was beneficial to the accumulation of carbohydrate in D. officinale. Therefore, this study could provide data and theoretical guidance for the cultivation of D. officinale.

Key words： cultivation substrate; Dendrobium officinale; gas chromatography mass spectrometry (GC-MS); metabolites

Cite this article

ZUO Simin , FU Jiashun , YU Haidong , YUN Yonghuan . Effect on Metabolites of Dendrobium officinale by Different Cultivation Substrates Based on Derivative GC-MS Method[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2022 , 43(3) : 634 -643 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.023

铁皮石斛（Dendrobium officinale）是兰科石斛属的名贵中草药植物,素有“中华九大仙草之首”之美誉,富含多糖、生物碱、氨基酸、黄酮等活性成分,具有增强机体免疫力、抗衰老、降血糖血脂等功效[1,2]。野生铁皮石斛因生长条件苛刻且生长缓慢而导致资源匮乏,为满足市场需求,学者们致力于研究开发人工栽培方法,以代替野生资源。栽培基质是铁皮石斛生长的必要条件,选择合适的栽培基质对于大规模培育高产优质的铁皮石斛具有重大意义。铁皮石斛是附生植物,喜好温暖、潮湿、通风透气的环境,常附生于树干、石头上。因此,在筛选铁皮石斛人工栽培的基质时,需综合考虑基质的松散程度、通气性、持水性等物理性质。经过多年探索研究,目前常用于铁皮石斛人工栽培的基质有松树皮、椰糠、泥炭、水苔等[3]。松树皮质地疏松,具有空隙量大,透水透气性好的优点,非常适合铁皮石斛生长。翟明恬等[4]、谢静等[5]的研究表明,与泥炭土混合物、椰糠、谷壳、腐殖土等基质相比,松树皮栽培的铁皮石斛在成活率、萌芽数、株高等方面表现良好,是适合铁皮石斛人工栽培的优良基质。椰糠具有较好的保水保肥性能,在海南资源丰富,取材便利,是栽培铁皮石斛的优良基质。
在栽培基质的比较评价研究中,多以铁皮石斛的移栽成活率、生长指标为评价标准,但这仅能说明铁皮石斛的产量而无法表征其质量。质量评价上更多是依靠某种或多种有效成分指标,如多糖[6,7]、黄酮[8]等成分的含量。然而,铁皮石斛作为一种药用植物,讲究“君臣佐使,方剂配伍”的使用原则,其药效是多种化学成分共同作用的结果。
代谢组学是基于气相色谱质谱法（gas chromatography mass spectrometry, GC-MS）、液相色谱质谱法（liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS）或核磁共振技术（nuclear magnetic resonance, NMR）分析生物体内内源性代谢产物及其变化规律的一门科学,广泛应用于药用植物领域,如药用植物真伪鉴别、产地溯源等[9,10,11]。基于GC-MS研究铁皮石斛代谢谱有助于更全面地了解铁皮石斛的代谢变化情况,从而探究基质对铁皮石斛代谢的影响。
本研究选取松树皮、椰糠、松树皮:椰糠（1:1）的复合基质等3种基质栽培铁皮石斛,测定3组基质的物理性质指标,采摘2年生的铁皮石斛,测定石斛茎中的多糖含量,并采用硅烷化衍生化法结合GC-MS法检测铁皮石斛茎中的初级代谢产物,基于代谢组学分析思路筛选差异显著的代谢物。将基质的物理指标与铁皮石斛茎中差异显著的代谢物含量进行联合分析,探究不同栽培基质对铁皮石斛代谢成分的影响机理,为铁皮石斛栽培基质的选择提供理论指导和基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

经考察,选择海南省海口市秀英区药谷工业园作为铁皮石斛栽培基地,利用大棚进行规范种植,并采用14.2 cm×10.2 cm×10.3 cm的多孔透气网盆进行盆栽试验,选定栽培基质为松树皮（粒径为10~13 mm,PB）、椰糠（粒径为14~18 mm,CC）、松树皮:椰糠（1:1,PC）的复合基质。试验于2017年11月实施,栽培基质经杀菌和水浸泡处理后,装入盆中约三分之二体积处,每盆栽种1株浙江乐清铁皮石斛幼苗。并在幼苗移栽1个月后施加1‰的磷酸二氢钾。试验按不同基质设3个处理,每个处理6个单元,每个单元包含9盆,共162盆。置于大棚的育苗活动床上,该大棚具有遮阳、喷灌设施,定时定期对植株进行浇水,浇水频率为春冬季节2 d一次,夏秋季1 d一次。夏秋进行适当遮阴,降温通风,并及时对石斛的生长环境进行监测于2019年11月采收,取铁皮石斛茎部位,立即放入液氮冷冻,后转移至-80℃冰箱保存。
试剂：N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA,98%）、甲氧氨基盐酸盐（98%）、阿东糖醇（99%）,购于上海麦克林生化科技有限公司;吡啶（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、氯仿（色谱纯）,购于LabServ公司;D-(+)-葡萄糖标准品、苯酚（分析纯）、浓硫酸（分析纯）,购于西陇化工股份有限公司。
仪器与设备：5804R高速冷冻离心机（Eppendorf中国有限公司）;UV-5500PC紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）;KQ- 400KDE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;7890B/7000C GC-MS联用仪[安捷伦科技（中国）有限公司];HP-5MS色谱柱（30 m× 250 μm×0.25 μm）[沃特世科技（上海）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 基质物理性质的测定 采用环刀法测定基质的容重、持水能力、总孔隙度、通气孔隙度、持水孔隙度、气水比。具体测定过程参照齐海鹰等[12]的方法。
1.2.2 粗多糖提取及含量的测定 取铁皮石斛粉末于100 mL离心管,按料液比1:120（m/V）加蒸馏水,混匀,50℃下超声（超声功率为240 W）2.0 h。超声结束后立即过滤,取少量蒸馏水分次洗涤滤渣,合并滤液。将滤液转移至100 mL容量瓶中定容,精密量取5 mL于50 mL离心管中,精密加入25 mL无水乙醇,摇匀,4℃冷藏至少4 h,取出,离心（10 000 r/min,20 min）,弃上清液,取20 mL 80%乙醇洗涤沉淀,8000 r/min离心15 min,洗涤2次。弃去上清液,所得沉淀即为粗多糖,挥干溶剂后加水溶解并定容至50 mL。使用苯酚-硫酸法[13]测定其多糖含量,试验平行3次。
1.2.3 样品提取及衍生化处理 样品处理参照LISEC等[14]的方法并进行适当调整。取新鲜铁皮石斛茎条剪成约5 mm的小段,加入液氮研磨至粉末状,迅速称取(100±5)mg于10 mL离心管中,并立即加入1.4 mL在-20℃预冷的甲醇,涡旋1 min。向离心管中加60 μL阿东糖醇溶液（0.2 mg/mL）作为内标,涡旋30 s,随后在40℃下超声提取30 min。超声结束后在样液中依次加入750 μL氯仿和1.4 mL预冷（4℃）的超纯水,涡旋1 min,以8000 r/min的转速离心15 min。精密吸取2.0 mL上清液至5 mL离心管中。将等质量的不同基质栽培的铁皮石斛粉末充分混匀,称取(100±5)mg作相同处理作为质控样本。
将提取液放入氮吹仪中进行氮吹挥干溶剂,加入120 μL甲氧基胺盐酸盐溶液（20 mg/mL）涡旋30 s,并在37℃下保温反应120 min;再加入120 μL衍生化试剂BSTFA,在25℃下保温90 min。吸取试液转移至进样小瓶中,4℃保存并在48 h内检测。
1.2.4 GC-MS条件 进样量：1 μL;分流比为20:1;流量：1 mL/min;升温程序：初始温度设为40℃,运行5 min后以10℃/min的升温速率升温至280℃,保持5 min;进样口温度：280℃;传输线温度：280℃。电离方式：EI;电子能量：70 eV;离子源温度：300℃;扫描方式：SCAN,扫描质量范围为35~780;MS在9.5~34 min时间段内采集数据[15]。

1.3 数据处理

通过SPSS 23.0软件使用Duncan’s多重比较检验差异显著性。GC-MS数据经自动解卷积、峰提取、峰对齐等处理后,通过NIST14.0标准质谱图库数据系统对信号进行鉴定,并对缺失值进行平均值填充,得到一个代谢物数据矩阵。采用SIMCA-P14.1对数据矩阵进行主成分分析（principle component analysis, PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant, OPLS-DA）,根据fold change（FC）值和OPLS-DA中的VIP值筛选显著性差异代谢物。

2 结果与分析

2.1 栽培基质物理性质

基质的各项物理性质结果如表1所示。持水能力和通气孔隙度分别表示基质对水分保持能力的大小和基质与空气交换能力的大小,由表中数据可以看出,松树皮基质的持水能力和通气孔隙度明显弱于椰糠和复合基质,而松树皮基质的容重高于椰糠和复合基质,表明该基质对植株的固定能力更强。
表1 不同栽培基质物理性质

Tab. 1 Physical properties of cultivation substrates

处理
Treatment		 容重
Bulk density
/(g·cm-3)		 持水能力
Holding water
capacity/%		 总孔隙度
Total
porosity/%		 通气孔隙度
Aeration
porosity/%		 持水孔隙度
Water-holding
porosity/%		 气水比
Void ratio
松树皮 0.15 225.00 59.72 40.36 19.36 2.08
椰糠 0.06 340.00 64.37 48.81 15.56 3.14
松树皮:椰糠（1:1） 0.10 235.80 56.68 43.10 13.58 3.17

2.2 栽培基质对铁皮石斛茎多糖含量的影响

通过SPSS 23.0软件使用Duncan’s多重比较对不同组多糖含量进行分析,结果如表2所示。3种不同基质栽培的铁皮石斛茎多糖具有显著差异,其中椰糠栽培的铁皮石斛多糖含量最高,为30.53%;松树皮栽培的铁皮石斛茎多糖含量最低,仅13.45%。
表2 不同基质栽培的铁皮石斛多糖含量

Tab. 2 Content of polysaccharides of D. officinale stems

指标
Index		 松树皮PB
Pine bark		 椰糠CC
Coconut coir		 松树皮:椰糠PC
Pine bark:Coconut coir
多糖含量/% 13.45±0.35c 30.53±0.84a 20.38±0.22b

注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

Note: Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

2.3 不同基质栽培的铁皮石斛代谢谱

铁皮石斛样品经GC-MS检测,总离子流图见图1。对色谱图进行自动解卷积和积分处理,得到196个峰,借助NIST14.0标准质谱图库数据系统检索相关质谱信息,共鉴定出42个匹配度大于70%的化合物,主要为糖和糖苷类物质（16个）、有机酸（13个）。以峰面积计算各物质的相对百分含量,得到3种基质栽培的铁皮石斛代谢谱信息如表3所示。其中,苹果酸峰面积占比最高,在松树皮组、椰糠组、复合基质组中分别为34.32%、31.73%、32.36%。而松树皮组、椰糠组、复合基质组中糖和糖苷类物质含量占比分别为41.96%、51.94%、43.83%,有机酸物质占比分别为50.18%、44.49%、49.35%。
图1 铁皮石斛质控样本甲醇/水提物的GC-MS总离子流图（TIC）

Fig. 1 GC-MS total ion chromatogram of methanol/water extracts from quality control samples of D. officinale

表3 铁皮石斛茎中代谢物信息

Tab. 3 Details of metabolites from stems of D. officinale

序号
No.		 保留时间
RT/min		 代谢物名称
Compounds name		 分子式
Formula		 匹配度
Similarity
/%		 相对百分含量Relative content/%
松树皮PB 复合基质PC 椰糠CC
1 9.586 ethanamine, 2TMS derivative（乙胺,2TMS） C8H23NSi2 90.97 1.01 0.95 0.48
2 11.827 lactic acid, 2TMS derivative（乳酸,2TMS） C9H22O3Si2 93.84 0.17 0.17 0.22
3 13.010 methylmalonic acid, 2TMS derivative（甲基丙二酸,2TMS） C10H22O4Si2 71.36 0.07 0.06 0.08
4 13.203 oxalic acid, 2TMS derivative（草酸,2TMS） C8H18O4Si2 72.76 1.40 1.34 1.08
5 15.115 ethanolamine, 3TMS derivative（乙醇胺,3TMS） C11H31NOSi3 93.52 1.93 1.66 2.20
6 15.674 succinic acid, 2TMS derivative [(Z)-2-琥珀酸,2TMS] C10H20O4Si2 81.57 0.11 0.16 0.13
7 17.264 N-alpha-acetyllysine, 3TMS derivative（N-α-乙酰-L-赖氨酸,3TMS） C17H40N2O3Si3 73.66 0.29 0.22 0.23
8 17.750 cadaverine, 3TMS derivative（1,5-戊二胺,3TMS） C14H38N2Si3 73.47 0.21 0.15 0.16
9 18.153 malic acid, 3TMS derivative（苹果酸,3TMS） C13H30O5Si3 85.95 34.32 31.73 32.36
10 18.507 L-aspartic acid, 3TMS derivative（L-天冬氨酸,3TMS） C13H31NO4Si3 74.86 0.03 0.04 0.03
11 18.563 pyroglutamic acid, 2TMS derivative（L-5-羟脯氨酸,2TMS） C11H23NO3Si2 71.39 0.02 0.02 0.01
12 18.644 4-aminobutanoic acid, 3TMS derivative（4-氨基丁酸,3TMS） C13H33NO2Si3 84.74 0.00 0.06 0.01
13 18.785 phloretic acid（对羟基苯丙酸） C17H26O3 75.50 0.28 0.05 0.23
14 18.945 threonate, trimethylsilyl ester（L-苏阿糖酸,3TMS） C16H40O5Si4 85.69 0.25 1.13 0.53
15 19.706 L-glutamic acid, 3TMS derivative（L-谷氨酸,3TMS） C14H33NO4Si3 78.52 0.05 0.06 0.04
16 21.014 meso-erythritol, 4TMS derivative（赤藓糖醇,4TMS） C16H42O4Si4 77.31 0.30 0.29 0.26
17 21.143 2-keto-l-gluconic acid, 5TMS derivative（2-酮-1-葡萄糖酸,5TMS） C21H50O7Si5 74.68 0.06 0.17 0.11
18 21.336 beta-D-ribofuranose, 4TMS derivative（β-D呋喃核糖,4TMS） C17H42O5Si4 85.23 0.40 0.30 0.26
19 21.802 shikimic acid, 4TMS derivative（莽草酸,4TMS） C19H42O5Si4 74.96 4.69 9.08 5.45
20 21.891 citric acid, 4TMS derivative（柠檬酸,4TMS） C18H40O7Si4 74.52 9.56 4.84 7.91
21 22.390 L-sorbose, 5TMS derivative [L-(-)-山梨糖,5TMS] C22H55NO6Si5 86.48 0.20 0.71 0.71
22 22.491 D-psicose, 5TMS derivative（D-阿洛酮糖,5TMS） C22H55NO6Si5 88.04 0.31 0.46 0.48
23 22.543 D-mannose, 5TMS derivative [D-甘露糖-(1Z),5TMS] C22H55NO6Si5 86.53 0.54 0.27 0.44
24 22.591 D-galactose, 5TMS derivative（D-半乳糖,5TMS） C22H55NO6Si5 80.83 0.07 0.13 0.11
25 22.656 beta-D-glucose, 5TMS derivative（β-D-葡萄糖,5TMS） C22H55NO6Si5 82.71 6.13 14.94 12.67
26 22.853 alpha-D-glucose, 5TMS derivative（α-D-葡萄糖,5TMS） C22H55NO6Si5 85.53 0.90 3.39 2.20
27 22.925 tyramine, 3TMS derivative（酪胺,3TMS） C17H35NOSi3 70.08 0.05 0.06 0.08
28 23.472 beta-D-(+)-talopyranose, 5TMS derivative [β-D-(+)-塔罗糖,5TMS] C21H52O6Si5 93.07 0.01 0.15 0.03
29 23.955 methyl galactoside, 4TMS derivative（甲基半乳糖苷,4TMS） C19H46O6Si4 83.79 0.05 0.16 0.14
30 24.237 palmitic Acid, TMS derivative（棕榈酸,TMS） C19H40O2Si 86.45 0.66 0.57 0.43
31 24.490 octopamine, 4TMS derivative（章胺,4TMS） C20H43NO2Si4 73.67 0.00 0.06 0.06
32 24.551 inositol, (Z)-, 6TMS derivative（肌醇,6TMS） C24H60O6Si6 85.94 1.58 1.95 2.12
33 26.036 stearic acid, TMS derivative（硬脂酸,TMS） C21H44O2Si 89.08 0.52 0.42 0.32
34 27.029 D-(+)-galacturonic acid, 5TMS derivative [D-(+)-半乳糖醛酸,5TMS] C21H50O7Si5 83.43 0.18 0.16 0.12
35 28.015 methyl beta-D-glucopyranoside, 4TMS derivative（乙基- α-D-吡喃葡萄糖苷,4TMS） C20H48O6Si4 85.73 0.27 0.22 0.24
36 28.168 oleanitrile（油腈） C18H33N 83.65 0.41 0.33 0.42
37 28.349 maltose, 8TMS derivative, isomer 2[β-麦芽糖,8TMS (异构2)] C36H86O11Si8 79.92 0.13 0.12 0.12
38 29.102 3-alpha-mannobiose, 8TMS derivative, (isomer 2) [3-α-甘露二糖,8TMS(异构2)] C36H86O11Si8 70.82 31.74 22.36 26.72
39 29.222 beta-D-lactose, 8TMS derivative（β-D-乳糖,8TMS） C36H86O11Si8 82.96 0.28 0.21 0.21
40 29.778 D-(+)-cellobiose, (isomer 1), 8TMS derivative [D-(+)-纤维二糖,8TMS] C36H86O11Si8 81.41 0.30 0.06 0.04
41 29.955 2-alpha-mannobiose, 8TMS derivative, (isomer 1) [2-α-甘露二糖,8TMS (异构1)] C36H86O11Si8 78.64 0.26 0.28 0.31
42 31.170 maltose, 8TMS derivative, isomer 1[α-麦芽糖,8TMS(异构1)] C36H86O11Si8 80.99 0.26 0.49 0.25

2.4 多元统计分析

采用多元统计分析方法对高维数据矩阵进行简化和降维。对数据进行自标尺化处理,采用无监督的主成分分析方法,以明确不同基质栽培的铁皮石斛样品组间和组内的相似性和差异性,结果如图2所示,质控样本很好地聚集在一起,这表明仪器稳定性好。第一主成分为50.4%,第二主成分为14.1%。松树皮、椰糠、复合基质3组样本各自聚为一类,表明样本的组内差异较小;不同组样本在第一和第二主成分上均有明显分离,说明样本的组间差异较大。其中松树皮组与椰糠组样本相距最远,复合基质组样本分布在松树皮、椰糠2组样本之间,这一差异趋势与基质物理性质结果相对应,表明栽培基质对铁皮石斛初级代谢产物有较大的影响。
图2 主成分分析得分图

R2X[1]代表第一主成分,R2X[2]代表第二主成分。

Fig. 2 Scores plot of principle component analysis

R2X[1] and R2X[2] represent the first and the second principle component, respectively.

采用有监督的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）方法分别对松树皮、椰糠、复合基质3组作进一步分析,以最大程度地提取组间差异信息,得分图如图3A、图3C、图3E所示,松树皮、椰糠、复合基质3组样本间均有显著差异,说明不同基质栽培的铁皮石斛存在明显的代谢差异。所建立的OPLS-DA模型R2Y值和Q2值均大于0.9,表明模型可以很好地解释数据矩阵信息,有较好的预测能力。对OPLS-DA模型进行200次置换检验,以验证模型是否存在过拟合,结果如图3B、图3D、图3F所示。所有R2和Q2左边的点都低于右边的点,且R2和Q2的回归线斜率都为正,说明建立的OPLS-DA模型具有可行性, 可根据建立模型所得到的VIP值筛选松树皮-椰糠、松树皮-复合基质、椰糠-复合基质3组之间的差异代谢物。
图3 正交偏最小二乘判别分析

A、C、E分别为松树皮-椰糠、椰糠-复合基质、松树皮-复合基质的OPLS-DA模型得分图,R2X[1]代表主成分,R2X[o]代表正交主成分。B、D、F为A、C、E相应的模型验证图。

Fig. 3 Orthogonal partial least squares discriminant analysis

A: Scores plot of the OPLS-DA model of PB vs. CC, CC vs. PC, PB vs. PC, respectively. R2X[1] and R2X[o] represent the predictive principal component and the orthogonal principal component, respectively. The plots of B, D and F are the model validation of A, C, E.

2.5 差异代谢物筛选

基于OPLS-DA结果获得变量重要性投影（variable importance in project, VIP）,结合差异倍数（fold change, FC）,筛选差异显著的代谢物。设置阈值条件为VIP>1、FC≥2或FC≤0.5。松树皮组与复合基质组间筛选出14个差异显著的代谢物,松树皮组与椰糠组间11个,复合基质组与椰糠组间5个,共筛选到17种差异显著的代谢物,占检测出的所有代谢物（42种）的40.5%,结果如表4所示。与复合基质组相比,在松树皮组中12个代谢物（糖和糖苷类7个,有机酸类3个,氨基酸及其衍生物类1个,胺和酰胺类1个）含量显著下调,β-D-葡萄糖、α-D-葡萄糖、β-D-(+)-塔罗糖、甲基半乳糖苷、L-(-)-山梨糖、L-苏阿糖酸、2-酮-1-葡萄糖酸、章胺、4-氨基丁酸等物质下调了3倍以上。其中,章胺和4-氨基丁酸在松树皮组中未检出。与椰糠组相比,在松树皮组中10个代谢物（糖和糖苷类5个,有机酸类2个,氨基酸及其衍生物类1个,胺和酰胺类2个）显著下调,α-D-葡萄糖、β-D-(+)-塔罗糖、甲基半乳糖苷、L-(-)-山梨糖、章胺、4-氨基丁酸等物质下调了3倍以上。椰糠组与复合基质组相比,仅L-5-羟脯氨酸、L-苏阿糖酸、β-D-(+)-塔罗糖、4-氨基丁酸、对羟基苯丙酸5个代谢物含量表达差异显著。这表明,复合基质、椰糠基质栽培的铁皮石斛糖和糖苷类及有机酸类物质显著高于松树皮组,复合基质组与椰糠组之间则存在较小的差异,且复合基质组铁皮石斛略优于椰糠组。
表4 显著性差异代谢物信息

Tab. 4 Information of metabolites with significant difference

类别
Type		 代谢物名称
Compound name		 PB-PC PB-CC CC-PC
FC VIP FC VIP FC VIP
有机酸 threonate, trimethylsilyl ester（L-苏阿糖酸,3TMS） 0.16 1.35 0.34 1.49 0.48 1.33
2-keto-l-gluconic acid（2-酮-1-葡萄糖酸） 0.29 1.34 0.43 0.99 0.67 0.99
shikimic acid, 4TMS derivative（莽草酸,4TMS） 0.39 1.34 0.63 1.01 0.61 1.35
phloretic acid, 5TMS derivative（对羟基苯丙酸,5TMS） 3.83 1.35 0.89 0.09 4.29 1.40
糖和糖苷 D-psicose, 5TMS derivative（D-阿洛酮糖,5TMS） 0.51 1.24 0.47 1.32 1.08 0.44
beta-D-glucose, 5TMS derivative（β-D-葡萄糖,5TMS） 0.31 1.38 0.36 1.55 0.87 1.26
alpha-D-glucose, 5TMS derivative（α-D-葡萄糖,5TMS） 0.20 1.35 0.30 1.54 0.66 1.26
beta-D-(+)-talopyranose, 5TMS derivative [β-D-(+)-塔罗糖,5TMS] 0.05 1.38 0.22 0.58 0.22 1.29
methyl galactoside, 4TMS derivative（甲基半乳糖苷,4TMS） 0.26 1.31 0.28 1.54 0.94 0.74
D-(+)-cellobiose, (isomer 1), 8TMS derivative [D-(+)-纤维二糖,8TMS(异构1)] 3.72 1.35 5.41 1.62 0.69 1.08
L-sorbose, 5TMS derivative [L-(-)-山梨糖,5TMS] 0.22 1.36 0.21 1.57 1.03 0.58
D-galactose, 5TMS derivative（D-半乳糖,5TMS） 0.43 1.30 0.50 1.38 0.87 1.05
maltose, 8TMS derivative, isomer 1[α-麦芽糖,8TMS(异构1)] 0.40 1.27 0.74 0.49 0.54 1.32
胺和酰胺 tyramine, 3TMS derivative（酪胺,3TMS） 0.71 1.08 0.49 1.43 1.44 1.20
octopamine, 4TMS derivative（章胺,4TMS） 0.00 1.38 0.00 1.64 0.92 0.81
氨基酸及其衍生物 4-aminobutanoic acid, 3TMS derivative（4-氨基丁酸,3TMS） 0.00 1.36 0.00 1.26 0.15 1.47
pyroglutamic acid, 2TMS derivative（L-5-羟脯氨酸,2TMS） 0.73 0.82 1.67 0.94 0.44 1.27

注：FC值表示代谢物含量在组间上调或下调。以松树皮（PB）-复合（PC）基质为例,FC<1表示前一组（松树皮）与后一组（复合基质）相比,代谢物含量在前一组（松树皮）中下调,FC>1则表示上调。

Note: The FC value indicates the up-regulation or down-regulation between groups. Take the pine bark (PB) vs. complex substrate (PC) as an example, FC<1 indicates when it compared with the latter (complex substrate), the metabolite down-regulated in the former (pine bark), and FC>1 represents up-regulated.

3 讨论

栽培基质的主要功能是固定植物,调节供氧、供水。不同栽培基质物理性质不同,供氧供水能力也就不一致。由表1可以看出,基质容重从大到小排序为：松树皮>松树皮与椰糠复合基质>椰糠。通气孔隙度及持水能力排序为：椰糠>松树皮与椰糠复合基质>松树皮。这表明松树皮、椰糠基质对铁皮石斛植株的固定能力强于复合基质;椰糠、复合基质对铁皮石斛植株的供水能力强于松树皮[16]。以传统检测方法检测铁皮石斛茎中的多糖含量,结果表明,3组铁皮石斛茎多糖含量从高到低排序为椰糠组>复合基质组>松树皮组。多糖含量越高,铁皮石斛质量越好,即椰糠基质栽培的铁皮石斛质量最优,复合基质次之,松树皮基质最差。为进一步探究栽培基质对铁皮石斛的影响,采用基于代谢组学思路的GC-MS方法检测比较3种基质栽培的铁皮石斛茎中的初级代谢物。
通过多元统计分析共筛选出17个差异显著的代谢物,与松树皮组相比,在复合基质组、椰糠组中葡萄糖、麦芽糖、半乳糖等可溶性糖及莽草酸等有机酸含量显著上调。代谢谱结果表明,有机酸类物质总含量从高到低排序为：松树皮>复合基质>椰糠,糖和糖苷类物质总含量排序为椰糠>复合基质>松树皮。这表明基质通气孔隙度及持水能力较高时更有利于铁皮石斛中糖类物质的积累。这与杨霞等[17]关于腐熟菌渣对石斛的影响研究结果一致,较高的栽培基质持水孔隙度、容重、总孔隙度会对石斛植株的物质积累、根系延伸和分裂、植株的健康造成不同程度的抑制作用,而较高的通气孔隙度可以显著促进石斛的物质积累和根系发育。这一结果可能与铁皮石斛的光合特性有关。
据文献报道[18,19],铁皮石斛是兼性景天酸代谢（crassulacean acid metabolism, CAM）植物,可以在夜间吸收同化CO2,以苹果酸形式储存,并在白天分解有机酸释放CO2,通过卡尔文循环合成糖类[20]。在非生物胁迫环境下,铁皮石斛中C3和CAM并存,缺水情况下会因栽培基质含水量的变化执行不同强度的CAM途径[21,22]。SHAMEER等[23]的研究表明,CAM植物的光合效率低于C3和C4植物,干物质年积累量较低。采收前一段时间,浇水频率变更为2 d一次,但生长环境依然保持高温干燥状态,栽培基质水分会迅速流失,且松树皮基质因其持水性能低于椰糠、复合基质,水分流失更快[24,25]。在该环境下,铁皮石斛植株极有可能出现短暂性的缺水,从而诱导CAM的表达增强[26]。气质分析结果可以证实这一猜测,松树皮、复合基质、椰糠3组中检出的苹果酸峰面积占比分别为34.32%、31.73%、32.36%,而苹果酸是调节石斛属植物C3/CAM代谢转换的标志性物质[27]。故而推测铁皮石斛在栽培期间CAM途径有较强的表达。且由于松树皮基质持水性能弱于复合基质和椰糠,松树皮比另外2种基质更容易缺水,从而导致松树皮基质栽培的铁皮石斛中CAM表达强于另外2组。因此,糖和糖苷类及有机酸类物质在松树皮与复合基质和松树皮与椰糠两对比较组间表达差异显著,且CAM表达较强的松树皮组铁皮石斛多糖积累量少于复合基质和椰糠。值得一提的是,本研究是基于单位质量的铁皮石斛茎展开的,未对单位面积的铁皮石斛总重量进行测定,旨在讨论单位质量的铁皮石斛茎中代谢物含量变化,侧重点在于“优质”的铁皮石斛。在生产试验中,如考虑生产效率还需结合总生物量来分析,以栽培出“优质”且“高产”的铁皮石斛。

4 结论

本文以松树皮、椰糠、松树皮:椰糠（1:1）的复合基质3种栽培基质栽培的铁皮石斛茎为研究对象。通过环刀法测定了3种基质的物理性质,结果显示复合基质、椰糠的通气孔隙度、持水性能优于松树皮基质。使用苯酚硫酸法检测铁皮石斛茎中的多糖含量,结果表明椰糠基质栽培的铁皮石斛多糖含量最高,质量最好,松树皮组含量最低,质量最差。采用GC-MS方法检测铁皮石斛茎中的初级代谢产物,共鉴定出42个物质。以VIP>1、FC≥2或FC≤0.5为条件,筛选出17个差异显著的代谢物,主要为糖和糖苷类、有机酸类物质。与松树皮组相比,大部分差异显著的代谢物在复合基质、椰糠中有较高的积累量。基质物理性质与差异代谢物联合分析结果表明,栽培基质通气供水能力越弱,植株可利用水越少,CAM途径表达越强而C3途径则弱,糖类物质积累量越少。即通气孔隙度高、持水性能好的基质更有利于铁皮石斛糖类物质的积累。

References

Publishing order | Descend order by publishing year | Descend order by cited within
[1]
GUO X, LI Y, LI C F, LUO H M, WANG L Z, QIAN J, LUO X, XIANG L, SONG J Y, SUN C, XU H, YAO H, CHEN S L. Analysis of the Dendrobium officinale transcriptome reveals putative alkaloid biosynthetic genes and genetic markers[J]. Gene, 2013, 527(1):131-138.

DOI

[2]
NG T B, LIU J Y, WONG J H, YE X J, SZE S C W, TONG Y, ZHANG K Y. Review of research on Dendrobium, a prized folk medicine[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 93(5):1795-1803.

DOI

[3]
胡小京, 曾燕颖, 敖飞雄, 关元静, 杜忠友, 宫杰芳. 不同栽培基质对两种石斛生长及生理的影响[J]. 西南师范大学学报, 2019, 44(11):29-35.

HU X J, ZENG Y Y, AO F X, GUAN Y J, DU Z Y, GONG J F. Effects of different substrates on growth and physiology of two species of Dendrobium[J]. Journal of Southwest Normal University, 2019, 44(11):29-35. (in Chinese)

[4]
翟明恬, 刘红霞, 王亚妮. 铁皮石斛组织快繁及移栽培养[J]. 东北林业大学学报, 2015, 43(1):50-53, 71.

ZHAI M T, LIU H X, WANG Y N. Tissue culture and transplanting of Dendrobium officinale Kimura et Migo[J]. Journal of Northeast Forestry University, 2015, 43(1):50-53, 71. (in Chinese)

[5]
谢静, 许环映, 吴建涛, 邱永生, 王勤南, 金玉峰, 胡后祥, 杨俊贤, 谭嘉娜. 栽培基质对铁皮石斛生长的影响[J]. 热带作物学报, 2017, 38(1):28-32.

XIE J, XU H Y, WU J T, QIU Y S, WANG Q N, JIN Y F, HU H X, YANG J X, TAN J N. Effects of culture substrates on the growth of Dendrobium officinale[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2017, 38(1):28-32. (in Chinese)

[6]
杨岚, 师帅, 向增旭. 蘑菇渣复合基质对铁皮石斛生长和有效成分含量的影响[J]. 江西农业大学学报, 2013, 35(5):945-949.

YANG L, SHI S, XIANG Z X. Effects of compound substrate of mushroom residue on the contents of effective components and growth situation of D. candidum officinal seeding[J]. Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis, 2013, 35(5):945-949. (in Chinese)

[7]
韦菲, 苏江, 黄映恒. 铁皮石斛组培苗移栽基质理化性质及栽培效果研究[J]. 安徽农业科学, 2016, 44(17):151-153.

WEI F, SU J, HUANG Y H. Study on physicochemical properties and cultivation effect of Dendrobium officinale tissue culture plantlets transplanting medium[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2016, 44(17):151-153. (in Chinese)

[8]
莫雨轩, 张浩涵, 田红怡, 邓波宁, 黄杰, 罗傲雪, 范益军. 蚯蚓粪对铁皮石斛抗氧化能力及次生代谢产物的影响[J]. 应用与环境生物学报, 2017, 23(4):642-647.

MO Y X, ZHANG H H, TIAN H Y, DENG B N, HUANG J, LUO A X, FAN Y J. Effects of vermicompost on antioxidant capacity and secondary metabolites of Dendrobium officinale[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2017, 23(4):642-647. (in Chinese)

[9]
LIU J, LIU Y, WANG Y, ABOZEID A, ZU Y G, TANG Z H. The integration of GC-MS and LC-MS to assay the metabolomics profiling in Panax ginseng and Panax quinquefolius reveals a tissue- and species-specific connectivity of primary metabolites and ginsenosides accumulation[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2017, 135:176-185.

DOI

[10]
SHU Y S, LIU Z L, ZHAO S Y, SONG Z Q, HE D, WANG M L, ZENG H L, LU C, LU A P, LIU Y Y. Integrated and global pseudotargeted metabolomics strategy applied to screening for quality control markers of Citrus TCMs[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2017, 409:4849-4865.

[11]
ZHAO S Y, LIU Z L, SHU Y S, WANG M L, HE D, SONG Z Q, ZENG H L, NING Z C, LU C, LU A P. Chemotaxonomic classification applied to the identification of two closely-related Citrus TCMs using UPLC-Q-TOF-MS-based metabolomics[J]. Molecules, 2017, 22(10):1721-1747.

DOI

[12]
齐海鹰, 张淑霞, 宋朝玉, 孙兆法, 翟晓灵. 不同基质和供水方式对基质理化特性和一品红观赏品质的影响[J]. 植物资源与环境学报, 2009, 18(3):74-80.

QI H Y, ZHANG S X, SONG C Y, SUN Z F, ZHAI X L. Effects of different substrates and watering modes on physico chemical properties of substrate and ornamental quality of Euphorbia pulcherrima[J]. Journal of Plant Resources and Environment, 2009, 18(3):74-80. (in Chinese)

[13]
DUBIOS M, GILLES K A, HAMILTON J K, REBERS P A. Colorimetric method for determination of sugar and related substances[J]. Analytical Chemistry, 1956, 28:250-256.

DOI

[14]
LISEC J, SCHAUER N, KOPKA J, WILLMITZER L, FERNIE A R. Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants[J]. Nature Protocols, 2006, 1(1):387-396.

DOI

[15]
JIN Q, JIAO C Y, SUN S W, SONG C, CAI Y P, LIN Y, FANG H H, ZHU Y F. Metabolic analysis of medicinal Dendrobium officinale and Dendrobium huoshanense during different growth years[J]. PLoS One, 2016, 11(1):e0146607.

[16]
甘露, 范海燕, 吴文勇, 刘洪禄, 马福生, 牛勇. 无土栽培基质水分特性参数研究[J]. 农业机械学报, 2013, 44(5):113-118, 142.

GAN L, FAN H Y, WU W Y, LIU H L, MA F S, NIU Y. Water retention parameters of soilless-culture substrates[J]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2013, 44(5):113-118, 142. (in Chinese)

[17]
杨霞, 吴松展, 刘景坤, 余小兰, 李光义, 王进闯, 李勤奋. 秀珍菇菌渣在霍山石斛栽培基质上的应用效果分析[J]. 热带作物学报, 2020, 41(3):449-456.

YANG X, WU S Z, LIU J K, YU X L, LI G Y, WANG J C, LI Q F. Application effects of pleurotus geesteranus substrate on Dendrobium huoshanense cultivation[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2020, 41(3):449-456. (in Chinese)

[18]
LI M H, ZHANG G Q, DENG H, LIU D K, LIU Z J. A perspective on crassulacean acid metabolism photosynjournal evolution of orchids on different continents: Dendrobium as a case study[J]. Journal of Experimental Botany, 2019, 70(22):6611-6619.

DOI

[19]
ZOU L H, WAN X, DENG H, ZHENG B Q, YAN B J. RNA-seq transcriptomic profiling of crassulacean acid metabolism pathway in Dendrobium catenatum[J]. Scientific data, 2018, 5(1):1-7.

DOI

[20]
BORLAND A M, HARTWELL J, WESTON D J, SCHLAUCH K A, TSCHAPLINSKI T J, TUSKAN G A, YANG X, CUSHMAN J C. Engineering crassulacean acid metabolism to improve water-use efficiency[J]. Trends in Plant Science, 2014, 19(5):327-338.

DOI

[21]
邹龙海. 铁皮石斛景天酸代谢途径与其关键基因的共表达网络[D]. 北京: 中国林业科学研究院, 2019.

ZOU L H. Crassulacean acid metabolism pathway and its key genes’ co-expression networks in Dendrobium catenatum[D]. Beijing: Chinese Academy of Forestry, 2019. (in Chinese)

[22]
ZHANG Z J, HE D X, NIU G H, GAO R F. Concomitant CAM and C3 photosynthetic pathways in Dendrobium officinale plants[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science, 2014, 139(3):290-298.

DOI

[23]
SHAMEER S, BAGHALIAN K, CHEUNG C Y M, RATCLIFFE R G, SWEETLOVE L J. Computational analysis of the productivity potential of CAM[J]. Nature Plants, 2018, 4(3):165-171.

DOI

[24]
LU J, YUAN J G, YANG J Z, CHEN A K, YANG Z Y. Effect of substrate depth on initial growth and drought tolerance of Sedum lineare in extensive green roof system[J]. Ecological Engineering, 2015, 74:408-414.

DOI

[25]
徐小蓉, 张习敏, 刘杰, 张宇斌, 龚记熠. 间隔干旱胁迫对金钗石斛生理生化特性的影响[J]. 分子植物育种, 2019, 17(2):626-634.

XU X R, ZHANG X M, LIU J, ZHANG Y B, GONG J Y. Effect of repeated drought on physiological and biochemical characteristics in Dendrobium nobile[J]. Molecular plant breeding, 2019, 17(2):626-634. (in Chinese)

[26]
WAN X, ZOU L H, ZHENG B Q, TIAN Y Q, WANG Y. Transcriptomic profiling for prolonged drought in Dendrobium catenatum[J]. Scientific data, 2018, 5(1):1-9.

DOI

[27]
刘张栋, 曹声海, 仇硕, 罗靖, 赵健, 李秀娟, 王彩云. 干旱胁迫诱导石斛属植物C3/CAM转变的代谢机制初探[J]. 中国观赏园艺研究进展, 2015(9):593-599.

LIU Z D, CAO S H, QIU S, LUO J, ZHAO J, LI X J, WANG C Y. Study on metabolic mechanism during the photosynjournal C3/CAM shift induced by drought stress in the genus Dendrobium[J]. Advances in Ornamental Horticulture of China, 2015(9):593-599. (in Chinese)

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