镰刀菌属包括禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、串珠镰刀菌（F. moniliforme）、尖孢镰刀菌（F. oxysporum）、拟枝孢镰刀菌（F. sporotrichioides）等主要的植物病原真菌,能够产生多种次生代谢产物[1,2,3]。其中,聚酮类化合物的种类最为丰富,它以乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A或其衍生物为底物,经聚酮合酶（PKS）催化而成。比卡菌素（bikaverin）是一种红色的四环聚酮化合物,具有抗菌、抗肿瘤的活性,拥有巨大的应用潜力[3,4,5]。比卡菌素的生物合成的基因簇以及生物合成途径已经解析清楚,Bik1基因编码催化抗生性聚酮化合物合成的关键酶[1, 3, 6-8]。在植物模式病原真菌水稻恶苗病菌（F. fujikuroi）中证明了I型聚酮合酶pks4参与了红色次生代谢产物比卡菌素的生物合成,pks4（现更名为Bik1）突变体不能产生比卡菌素[6],bikaverin生物合成基因簇中包含有6个基因都参与比卡菌素的合成,依次命名为Bik1-6。其中Bik1全长6270 nt,含有3个内含子,编码2009个氨基酸。编码I型聚酮合酶,将1个乙酰辅酶A和8个丙二酰辅酶A聚合形成比卡菌素前体物,负责红色色素比卡菌素的生物合成。Bik2编码FAD依赖性单加氧酶（Bik2）,Bik3编码o-甲基转移酶（Bik3）,Bik4编码NmrA样家族结构域蛋白,Bik5编码一个真菌特异性的Zn(II)2Cys6转录因子,Bik6编码一个MFS转运蛋白。基因簇中的每一个基因的缺失都会导致比卡菌素合成量的全部丢失或显著减少。ΔBik1、ΔBik2、ΔBik3敲除突变体中无法合成比卡菌素;Bik4、Bik5和Bik6影响比卡菌素的合成量,Bik5敲除后仅产生微量的比卡菌素[7]。Bik1具有成为内源报告基因的特征和潜力。Bik1是目前丝状真菌中鉴定到的最长的编码基因,此外,Bik1参与催化合成的红色色素比卡菌素的生物合成,ΔBik1敲除突变体不能合成比卡菌素从而丧失了红色色素合成能力,摇培后的菌液呈白色[7,8]。在构建棉花枯萎菌（F. oxysporum f. sp. vasinfectum, Fov）的高效CRISPR/Cas9基因编辑体系中,FovBik1作为内源报告基因评估编辑的效率,原核表达Cas9蛋白后,与体外转录的sgRNA体外组装成核糖体核蛋白复合体RNP,连同供体DNA一并原生质体转化敲除靶标基因,敲除成功的ΔFovBik1突变体摇培后的菌液呈白色,与野生型的红色菌液对比明显,直接通过颜色差异即可判断基因编辑是否成功[9]。
香蕉枯萎病是破坏香蕉维管束导致植株死亡的毁灭性土传病害,其病原菌为尖孢镰刀菌古巴转化型（F. oxysporum f. sp. cubense, Foc）,其中4号生理小种（Foc4）是致病力最强的小种,其致病机制和防控措施是香蕉产业的重要问题,也是热带地区植物病理学研究的热点和难题之一[10]。利用反向遗传学基因功能日趋成熟,通过基因敲除（gene knockout）、RNAi干扰（RNA gene silencing, RNAi）等技术创造突变体并研究突变体的表型从而阐述基因的生物学功能。对Foc4而言,这些反向遗传学操作都需要一系列的操作,成功率受到很多因素制约。基因敲除可选择的筛选标记有限,而有些特殊的致死基因敲除后无法获得敲除突变体。利用RNAi基因沉默不能完全消除背景基因的影响,并且RNAi发夹中同源序列的dsRNA可能干扰其他非靶标基因出现脱靶现象。
成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9, CRISPR/Cas9）是近年开展的一种方便灵活的基因组编辑技术,可直接在基因组上进行DNA序列的插入、敲除、定点突变以及组合编辑等,尤其是在水稻恶苗病菌（F. fujikuroi）[11]以及尖孢镰刀菌棉花专化型（F. oxysporum f. sp. vasinfectum, Fov）[9]上的成功编辑极大地促进了镰刀菌分子生物学和遗传学的研究。但是Foc4目前尚无CRISPR/Cas9基因编辑的相关报道,因此,建立可靠的遗传转化技术并高效地删除目的基因是进行基因功能分析的重要前提。
尖孢镰刀菌（F. oxysporum）中也有比卡菌素的生物合成途径[1, 12-13]。通过生物信息学功能域分析软件分析,Foc4菌株含有I型PKS聚酮合酶Bik1同源基因（FOIG_14908）,开展基因敲除及表型分析,观察Foc4Bik1基因敲除缺失突变体是否出现菌液颜色变化并评估Foc4Bik1作为内源报告基因的可行性。其次,香蕉枯萎病目前尚无CRISPR/Cas9基因编辑技术的报道,借鉴水稻恶苗病菌（F. fujikuroi）的基因编辑载体pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph（Addgene, #121092）,尝试构建了以Foc4Bik1为靶标基因的基因编辑体系,评估Foc4中构建基因编辑的可行性[11],为后续的香蕉枯萎菌的分子生物学研究提供有力的技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验菌株及香蕉品种 香蕉枯萎病菌4号生理小种（F. oxysporum f. sp. cubense race 4, Foc4）由本实验室鉴定保存。试验接种的香蕉品种为‘巴西蕉’（Cavendish cv. Brazil, AAA）。
1.1.2 试剂 2×Taq Master Mix DNA聚合酶（#P112）、DNase I（#EN401）、Realtime PCR试剂盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（#Q711）、Phata Max Super-fidelity DNA高保真酶（#P505）、ClonExpress® II One Step Cloning Kit同源重组试剂盒（#C112）等购自南京诺唯赞（Vazyme）生物科技股份有限公司;Trizol RNA提取试剂（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）、酵母转化试剂盒Alkali-CationTM Yeast Transformation Kit（#112200200）以及其他分析纯及试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司;引物由北京华大基因合成（PAGE纯化）。
1.2 方法
1.2.1 真菌DNA的制备 采用CTAB方法提取真菌的基因组DNA。将实验室保存的Foc4野生型菌株接种到PDA平板上,28℃培养3~5 d后,刮取新鲜的菌丝,按照CTAB方法提取菌丝DNA。其他突变体的DNA提取按照Foc4的操作方法和步骤进行。
1.2.2 Bik1蛋白结构域分析及基因敲除片段扩增 利用在线蛋白功能域预测分析软件SMART（simple modular architecture research tool, http://smart.embl.de）分析Foc4Bik1基因的保守功能域。参考Foc4Bik1的基因序列（FOIG_14908）和已发布的Foc4野生株基因组序列（JH658279.1）,设计引物LBCK和LB-R,RB-F和RBCK（表1）扩增Bik1基因的上下游片段;设计HYG-F和HYG-R引物（表1）扩增验证潮霉素片段;重组上下游片段则分别通过引物LB-F、HYG-R1和HYG-F1、LB-R（表1）来扩增。Outside引物检测靶标基因是否被重组片段替换（敲除）,而Inside引物检测Bik1内源基因。
表1 引物序列Tab. 1 Sequence of primers used in this study |
| 引物Primer | 序列（5'-3'）Sequence (5'-3') |
|---|---|
| HYG-F | CTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGT |
| HYG-R | CCCGGTCGGCATCTCTCTATTC |
| Bik1-HYG-LBCK | TTGAGGAGAGTGACGACCA |
| Bik1-HYG-LB-R | ACCTCCACTAGCTCCAGCCAAGTCGCTGTTGAAAGCAGTAAC |
| Bik1-HYG-RB-F | GAATAGAGTAGATGCCGACCGGGACACTTCCCTACCGTGTCAGC |
| Bik1-HYG-RBCK | CGACGGACAGAGCAAACC |
| Bik1-HYG-LB-F | ATGTCAGCACCCACCGAA |
| HYG-R1 | GGATGCCTCCGCTCGAAGTA |
| HYG-F1 | CGTTGCAAGACCTGCCTGAA |
| Bik1-HYG-RB-R | CGCTTCAGTCACCACGCA |
| Bik1-Outside-F | TGCCAGCCACTACGGAGATT |
| Bik1-Outside-R | CAGGTGACGCAGTTGAGGTAGA |
| Bik1-Inside-F | CGAGGGCACTGAGGCTTA |
| Bik1-Inside-R | CTGTCGCAGCAATACGGG |
| 5SrRNA-U-F-EcoRI | GTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGATGACAAATTCAACAACTC |
| 5SrRNA-U-R-EcoRI | TCGCGAGGTACCGAGCTCGAATTATTAAGGTTGGCAAGTGCAGGA |
| BIK1-sgRNA162-F | AGAGAGAAAATCGATTCCCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA |
| BIK1-sgRNA162-R | CGGGAATCGATTTTCTCTCTCATACAACAG CGGGGATTCGCT |
| pUC19-BIK1-LB-F | AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGTTGCCCATACACAGGTCACT |
| pUC19-BIK1-LB-R | AAATAACACTGCCGCTTCAAGAGAAAATCGCTGTTGAAAGCA |
| pUC19-BIK1-RB-F | TGCTTTCAACAGCGATTTTCTTTGAAGCGGCAGTGTTATTT |
| pUC19-BIK1-RB-R | AACAGCTATGACCATGATTACGCCAAACGCATCTCGAAGAGAATGA |
1.2.3 原生质体制备及转化 香蕉枯萎病菌原生质体制备参照王飞燕等[14]的方法进行。PEG介导的原生质体转化参照徐齐君等[15]的方法。以培养3 d的Foc4野生株为原始菌株制备浓度为1×107个/mL的原生质体,分别取3~5 µg上下游片段回收产物与1 mL原生质体混匀,冰上放置30 min;取2 mL 60% PTC分3次缓慢加入到混合液,冰上放置15~20 min;将预冷的STC溶液加入到混合液至25 mL,4℃,5000 r/min离心15 min弃上清液;加入无抗性的SR液体培养基3 mL,再加入含有100 µg/mL潮霉素和50 µg/mL链霉素的SR固体培养基混匀后均匀倒在培养皿上,28℃培养箱中培养3~5 d后得到转化子,并连续培养3代得到稳定转化子。
1.2.4 ΔFoc4Bik1敲除突变体PCR鉴定 敲除重组DNA片段需要包含靶标基因5'上游约1 kb的同源序列、抗性基因序列、3'下游约1 kb的同源序列。Split-marker重组方法参考WANG等[16]的方法构建Split-marker基因敲除重组片段,包含2个重组DNA片段,具体分2步进行。第1轮PCR扩增3个片段：HYG-F/HYG-R扩增HYG抗性基因1.4 kb;Foc4基因组DNA为模板,引物Bik1-HYG-LBCK/Bik1-HYG-LB-R扩增左端LB1 1830 bp;Foc4基因组DNA为模板,引物Bik1- HYG-RB-F/Bik1-HYG-RBCK扩增右端RB 2133 bp。第2轮PCR扩增2个重组DNA片段：左端（5'上游）重组DNA片段扩增（LB2+HY）：Bik1-HYG- LB-F/HYG-R1为引物,Bik1-LB1+HYG-1.4kb为模板,扩增产物大小2713 bp;右端（3'下游）重组DNA片段扩增（YG+RB2）：HYG-F1/Bik1- HYG-RB-R为引物,HYG-1.4kb+Bik1-RB1为模板,扩增产物2386 bp。将5'上游重组DNA和3'下游重组DNA等体积混合后按照上述的原生质体转化方法进行转化。采用CTAB方法提取真菌的基因组DNA。配制20 µL PCR反应体系,反应程序：94℃,5 min;95℃,40 s;58℃,45 s;72℃,2 min;72℃,5 min;16℃,5 min,35个循环扩增验证敲除体中的目标片段,其中引物Outside-F/Outside-R检测靶标基因是否敲除;而引物Inside-F/Inside-R对敲除体内源基因进行检测（表1）。
1.2.5 ΔFoc4Bik1突变体生长特性分析 （1）生长形态和生长速率测定。挑选3个培养3~5 d的ΔFoc4Bik1突变体和Foc4野生株,分别取5 mm菌饼接种到无抗性的PDA平板上,28℃培养,并分别在培养1、3、5、7 d测量菌落直径并拍表型图,每次设置3个重复。第7天观察结束后从PDA平板上取少量菌丝,制成载玻片进行显微观察形态。（2）孢子形态和产孢量分析。取ΔFoc4Bik1突变体和Foc4野生株的5 mm新鲜菌饼分别加入到无抗性PDB液体培养基中,28℃摇培7 d,观察菌液颜色;同时,三层滤纸过滤后借助血球计数板在显微镜观察并统计其孢子数量。
1.2.6 ΔFoc4Bik1突变体致病力分析 取ΔFoc4Bik1突变体和Foc4野生株的5 mm新鲜菌饼分别接种到100 mL PDB液体培养基中,28℃摇床、150 r/min摇培5 d,用三层滤纸将菌丝过滤,收集分生孢子液,用无菌水将分生孢子液浓度调节为2×106个/mL。采用盆栽伤根灌淋法测定菌株致病性。其中突变体和野生株分别处理15株香蕉苗,每株苗浇灌15 mL孢子液,以无菌水作为空白对照,3次重复,60 d后纵向切开香蕉苗球茎,观察球茎褐变程度,参考MOHAMED等[17]的病情调查分级标准,记录每株苗的发病等级并对病情指数进行统计。
1.2.7 CRISPR/Cas9基因编辑技术体系 借鉴水稻恶苗病菌（F. fujikuroi）的基因编辑载体pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph（Addgene, #121092）,探索采用5SrRNA启动子和HTBNLS核定位信号的质粒编辑载体,尝试构建以Foc4Bik1为靶标基因的基因编辑技术[11]。
sgRNA序列的设计以及编辑载体构建。人工合成263 nt的Ff5SrRNA-Bik1 sgRNA全基因序列[11],并以此为模板扩增后续的sgRNA序列后同源重组进入基因编辑质粒。guide RNA由Eukaryotic Pathogen CRISPR guide RNA/DNA Design Tool网站设计,综合分析后确定gRNA的序列,Foc4Bik1-gRNA162：AGAGAGAAAATCGATTCC CGagg。以人工合成的序列为模板,分别用引物对5SrRNA-U-F-EcoRI/BIK1-sgRNA162-R、BIK1- sgRNA162-F/5SrRNA-U-R-EcoRⅠ扩增5SrRNA- Bik1 sgRNA的上、下游两段序列;pUC-f FuCas9- HTBNLS-hph载体EcoRⅠ酶切后,利用ClonExpress® II One Step Cloning Kit重组克隆试剂盒,将5SrRNA-Bik1 sgRNA的两端扩增序列同源重组导入质粒构建成靶向Foc4Bik1的pUC-fFuCas9- HTBNLS-hph-Foc4Bik1基因编辑载体,该载体采用体内表达的Cas9和sgRNA。
同源重组修复供体质粒pUC19-Foc4Bik1- HDR的构建。pUC19-BIK1-LB-F/pUC19-BIK1- LB-R、pUC19-BIK1-RB-F/pUC19-BIK1-RB-R分别扩增Bik1基因的上游1419 bp同源序列、下游1315 bp同源序列,同源重组导入pUC19构成供体质粒pUC19-Foc4Bik1-HDR作为同源重组修复（homology directed repair, HDR）的HDR模板。
基因编辑操作方法。分别取5 µg构建的pUC- fFuCas9-HTBNLS-hph-Bik1、pUC1-Bik1-HDR质粒原生质体共转化后筛选阳性转化子,筛选方法与基因敲除阳性转化子筛选方法一致。
2 结果与分析
2.1 进化树分析
Foc4Bik1基因（FOIG_14908）CDS全长6111 bp,编码一个由2036个氨基酸组成的氨基酸多功能酶,包含多个保守结构功能域：初始单位酰基转移酶功能域[starter unit: acyl-carrier protein (ACP) transacylase, SAT],β-酮脂酰合成酶功能域（β-ketoacyl synthase, KS）,丙二酰酰基转移酶功能域（acyltransferase, AT）,脱氢酶（dehydratase, DH）以及硫酯酶（thioesterase, TE）（图1A）。
图1 香蕉枯萎菌Foc4Bik1的蛋白结构域及多序列比对分析A：SMART预测的香蕉枯萎菌Foc4Bik1蛋白保守结构域;B：Foc4Bik1蛋白氨基酸多序列比对。 Fig. 1 Conserved domain and multiple alignment of Foc4Bik1 among different fungi species A: Schematic representation of the conserved domain of Foc4Bik1 (FOIG_14908) using online SMART software; B: Multiple alignment of Foc4Bik1. |
经BLAST分析、Clustal X比对,Foc4Bik1与水稻恶苗病菌（F. fujikuroi）的BIK1蛋白（AJ278141）、尖孢镰刀菌棉花专化型Fov的BIK1（FOTG_08225）蛋白序列高度同源,具有高度保守的功能域结构,同源性达到99%以上（图1B）。
2.2 Foc4Bik1基因敲除及PCR检测
采用Split-marker重组技术原理,进行二轮PCR扩增重组DNA片段,左端（5'上游）重组DNA片段（LB2+HY）扩增（LB2+HY）2713 bp;右端（3'下游）重组DNA片段（YG+RB2）扩增2386 bp（图2A）。将5'上游重组DNA和3'下游重组DNA等体积混合后按照上述原生质体转化方法进行转化。经过潮霉素抗性筛选和再生培养,获得ΔFoc4Bik1敲除转化子。分别提取Foc4野生型菌株基因组DNA和ΔFoc4Bik1敲除转化子基因组DNA,并以此为模版,分别用Outside、Inside和HYG引物进行PCR扩增,鉴定阳性转化子。结果显示,Outside引物对从Foc4中扩增到6832 bp,而ΔFoc4Bik1敲除突变体中扩增到1800 bp;Inside引物对仅从Foc4中扩增到746 bp,而ΔFoc4Bik1敲除突变体中无扩增条带;HYG检测显示仅ΔFoc4Bik1敲除突变体中扩增到1376 bp条带,Foc4中无扩增条带,这些结果表明,这3个转化子中的Foc4Bik1基因已成功敲除（图2B）。
图2 Split-marker重组方法介导的Foc4Bik1基因敲除A：Split-marker重组基因敲除Foc4Bik1示意图;B：ΔFoc4Bik1转化子的PCR验证。 Fig. 2 Foc4Bik1 gene knockout via split-marker recombination approach and PCR screening A: Schematic map of Split-marker homologous recombination knockout of Foc4Bik1gene in Foc4; B: PCR detection of the ΔFoc4Bik1 gene-knockout transformants using outside, inside and HYG resistance primer set, respectively. |
2.3 ΔFoc4Bik1生长特性和产孢量分析
将Foc4和ΔFoc4Bik1分别接种于PDA培养基上,每天测量菌落直径大小,ΔFoc4Bik1生长速度略慢于野生株Foc4,其菌落直径为4.18 cm,野生株Foc4菌落直径5.65 cm,但是二者差异不显著（图3A,图3D）。显微观察结果显示,ΔFoc4Bik1与野生株对比,菌丝生长和菌丝顶端形态无明显差异,ΔFoc4Bik1菌丝生长正常（图3A,图3B）。产孢量统计显示,ΔFoc4Bik1产孢量为(5.1± 0.16)×107个/mL,野生株Foc4产孢量为(8.1± 0.3)×107个/mL,ΔFoc4Bik1产孢量明显降低但是差异不明显（图3C,图3E）。ΔFoc4Bik1分生孢子形态和大小发生改变,野生菌株Foc4小型分生孢子卵圆形或肾型,无色,单胞或双胞,而ΔFoc4Bik1分生孢子长度不变,稍微变宽,卵圆形或近球形（图3C）。ΔFoc4Bik1分生孢子平均大小为(7.88± 1.96)μm × (3.32 ± 0.78)μm,Foc4分生孢子平均大小为(7.56±1.93)μm × (2.84±0.36)μm（图3F）。
图3 ΔFoc4Bik1和野生型Foc4菌落生长表型及产孢量分析A：PDA平板菌落形态;B：菌丝顶端形态;C：分生孢子形态;D：菌落直径对比（1~7 d）;E：产孢量;F：分生孢子大小。不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 Fig. 3 Comparison of colony growth rate, conidia morphology and production of ΔFoc4Bik1 and Foc4 A: Colonies morphology of PDA plate; B: Microscopic observe the hyphae tip; C: Microscopic observe the conidia morphology; D: The comparison of colony diameter (1-7 d); E: The number of conidia production; F: Conidia size. Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). |
2.4 ΔFoc4Bik1摇培表型分析
图4 ΔFoc4Bik1和野生型Foc4菌落生长表型A：Foc4和ΔFoc4Bik1在PDB摇培后的菌液颜色;B：Foc4和ΔFoc4Bik1在PSB摇培后的菌液颜色。 Fig. 4 Phenotype between ΔFoc4Bik1 and wild type Foc4 cultured on different liquid medium A: The phenotype of Foc4 and ΔFoc4Bik1 cultured on the PDB liquid medium; B: The phenotype of Foc4 and ΔFoc4Bik1 cultured on the PSB liquid medium. |
2.5 ΔFoc4Bik1致病力分析
将Foc4野生型菌株和ΔFoc4Bik1突变体菌株的菌丝分别接种‘巴西蕉’幼苗。30 d后观察香蕉苗外部症状和内部症状。以H2O作为空白对照的‘巴西蕉’苗叶片嫩绿,叶片未出现症状,球茎无褐化现象。接种野生株Foc4的‘巴西蕉’苗下部叶片出现黄化枯萎现象,植株下部叶片褪绿变黄,并且纵向切开球茎后球茎褐化明显,出现典型的坏死斑;而接种ΔFoc4Bik1突变株的‘巴西蕉’苗均与接种野生株的症状相似,叶片黄化现象,球茎褐化明显（图5A）。病情指数统计显示,接种ΔFoc4Bik1突变株平均病情指数（54.17）与Foc4接种的平均病情指数（57.08）并无显著差异（图5B）,结果证实Foc4Bik1基因敲除后对致病力并无明显影响,Foc4Bik1基因并不参与调控病原菌的致病力。
图5 ΔFoc4Bik1的致病力分析A：Foc4野生株和ΔFoc4Bik1侵染后的叶部症状和球茎症状;B：Foc4野生株和ΔFoc4Bik1侵染的病情指数。不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 A: The leaf symptom and corm phenotype of banana inoculated by Foc4 and ΔFoc4Bik1, respectively; B: The disease indexes of the banana infected by Foc4 and ΔFoc4Bik1, respectively. Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). Fig. 5 Pathogenicity test of ΔFoc4Bik1 |
2.6 Foc4Bik1为靶标评估基因编辑可行性
采用Pol III型启动子5S rRNA启动sgRNA体内表达,选用HTBNLS作为核定位信号,以水稻恶苗病菌（F. fujikuroi）的基因编辑载体pUC- fFuCas9-HTBNLS-hph（Addgene, #121092）构建以Foc4Bik1为靶标基因的CRISPR/Cas9基因编辑体系,编辑载体见图6A。在线软件Eukaryotic Pathogen CRISPR guide RNA/DNA Design Tool（ http://grna.ctegd.uga.edu/）设计gRNA序列Bik1- gRNA162: AGAGAGAAAATCGATTCCCG agg,gRNA在Bik1基因上的作用位点以及供体质粒pUC19-Foc4Bik1-HDR见图6B,构建好的编辑载体pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4Bik1与供体质粒pUC19-Foc4Bik1-HDR共转化原生质体。
图6 Foc4Bik1的CRISPR/Cas9基因编辑质粒示意图以及突变体表型分析A：基因编辑载体pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph (Plasmid #121092);B：Foc4Bik1设计的gRNA162序列;C：ΔFoc4Bik1（HDR）基因编辑后敲除突变体的摇培表型分析;D：ΔFoc4Bik1（HDR）基因敲除突变体的PCR检测验证。 Fig. 6 Schematic diagram of plasmid-based CRISPR/Cas9 gene editing vector applied in Foc4 and the phenotype of the ΔFoc4Bik1(HDR) gene replacement mutants A: Schematic diagram of gene editing vector of pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph (Plasmid #121092); B: Alignment of the designed guide RNA sequence in Foc4Bik1 gene; C: The phenotype analysis of ΔFoc4Bik1 (HDR) gene replacement mutants cultured on PDB (pH 4.0); D: PCR detection of ΔFoc4Bik1 (HDR) gene replacement mutants with different primer sets. |
CRISPR/Cas9基因编辑载体pUC-fFuCas9- HTBNLS-hph-Foc4Bik1与供体质粒pUC19-Foc4Bik1- HDR共转化原生质体后,获得基因编辑后的ΔFoc4Bik1（HDR）敲除转化子,在PDB（pH 4.0）液体培养基摇培3 d后,基因编辑转化子菌液颜色为白色,差异明显（图6C）。分别提取Foc4野生型菌株基因组DNA和ΔFoc4Bik1（HDR）基因编辑敲除转化子基因组DNA,分别进行PCR检测以鉴定阳性基因编辑敲除转化子。结果显示,
Outside引物对从Foc4中扩增到6832 bp,而ΔFoc4Bik1（HDR）基因编辑敲除转化子中扩增到450 bp;Inside引物对仅从Foc4中扩增到746 bp,而ΔFoc4Bik1（HDR）基因编辑敲除转化子中无扩增条带;此外,sgRNA以及Cas9基因也仅从ΔFoc4Bik1（HDR）基因编辑敲除转化子中扩增获得。这些结果表明,基因编辑后成功敲除了转化子ΔFoc4Bik1（HDR）中的内源报告基因Foc4Bik1（图6D）。
3 讨论
CRISPR/Cas9基因组编辑技术借助特异性DNA双链断裂（DNA double-strand breaks, DSBs）激活细胞天然的修复机制,包括同源重组修复（homology directed repair, HDR）和非同源末端连接（non-homologous DNA end joining, NHEJ）2条途径。同源重组是将外源基因靶向导入受体细胞染色体上的方法,借助在该位点有与导入基因同源的序列,通过单一或双交换,新基因片段可替换原基因片段。这是一种具有相对高保真度的修复过程。CRISPR/Cas9基因组编辑技术在代谢工程以及分子遗传育种等方面具有广阔的应用前景。镰刀菌中水稻恶苗病菌（F. fujikuroi）[11]以及尖孢镰刀菌棉花专化型（F. oxysporum f. sp. vasinfectum）[9]都有基因编辑的相关报道,目前,Foc4尚无基因编辑技术的报道,因此,鉴定并筛选表型容易分辨的内源报告基因评估基因编辑技术在枯萎菌上应用的可行性具有重要意义。
报告基因（reporter gene）是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,非常容易鉴定其表达产物。报告基因的种类很多,根据报告基因的来源及分析方法的不同,可将其分为外源报告基因和内源报告基因。植物中最常用的外源报告基因如β-葡糖醛酸酶（GUS）报告基因,绿色荧光蛋白（GFP）基因、萤火虫荧光素酶（luciferase）基因等;内源报告基因是自身编码的基因,植物中应用最广泛的是八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase, PDS）,基因沉默会出现典型的白化表型[20]。目前,香蕉枯萎菌应用最广泛的是GFP外源报告基因[21]。荧光蛋白GFP标记枯萎菌后有利于观察枯萎菌侵染、定殖过程[22]、评估不同生理小种之间的毒力差异[23]以及不同香蕉品种中的抗性差异[24],目前尚无香蕉枯萎病菌内源报告基因的相关报道。
本文鉴定的Foc4Bik1基因可以作为内源报告基因探索和评估基因编辑在Foc4上的可行性。Foc4Bik1基因符合作为内源报告基因的几大特征条件：（1）表型容易分辨。ΔFoc4Bik1突变株摇培后的菌液颜色呈白色,与野生株的红色菌液颜色差异明显。（2）ΔFoc4Bik1突变体不影响病原菌的其他生理表型和致病力,仅影响代谢产物中比卡菌素的生物合成。（3）其表达产物能够定量测定。Bik1负责比卡菌素（bikaverin）的生物合成,含量可以量化测定。（4）Foc4Bik1表达可调控。Bik1的表达可以受培养基和外界因素的调控表达,比卡菌素的合成主要受4个方面的影响：AreA的正调节、PacC的抑制、时间的调节和内部基因的相互调节。基因簇中任何一个相关基因突变,其他基因的表达均有明显的下降[7]。此外,比卡菌素产量还受培养条件的调控。研究表明,培养基中的N源缺乏[12]以及高C/N比有利于比卡菌素的生物合成[25]。蔗糖显著提高比卡菌素的生物产量[18]。培养基中添加钙提高其产量,而添加磷酸盐和硫酸盐负调控产量[25],培养过程中的通气量[26]以及水分活度（water activity, aw）[27]也影响比卡菌素生物产量。
丝状真菌的基因编辑有2种主要的操作方式,一种方式是基于质粒的体内表达系统,质粒上携带Cas9和sgRNA表达系统。sgRNA由Pol II型启动子,比如U6等启动表达;而Cas9由真菌组成型启动子表达。另外一种是体外表达Cas9,与体外转录的sgRNA结合形成RNP核糖核蛋白复合体后转化。Cas9单独转化到Foc4后并不影响其致病力（结果未显示）,与稻瘟菌的结果不一致[28],为后续采用质粒型编辑载体提供了前期保证。此外,同源重组修复是将外源基因靶向导入受体细胞染色体上的方法,本文构建的CRISPR/ Cas9基因组编辑技术依赖同源重组修复完成靶标基因敲除,需要外源供体DNA模板导入,借助在该位点有与导入基因同源的序列,通过单一或双交换,供体DNA序列可替换原基因片段。这是一种具有相对高保真度的修复过程。因此,本文采用质粒体内表达的方式探索Foc4基因编辑的可行性。以Foc4Bik1为靶标基因,在线网站设计gRNA构建pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4Bik1后,与供体质粒pUC19-Bik1-HDR一起导入到原生质体,潮霉素筛选的转化子经过表型分析和PCR鉴定。阳性转化子PDB摇培后的菌液呈白色,与野生型Foc4差异明显;DNA测序结果也证实通过基因编辑的方式敲除了Foc4Bik1基因,结果说明了Foc4中基因编辑的可行性,可以通过颜色差异直接筛选阳性转化子。
综上,Foc4Bik1基因编码聚酮合酶在代谢产物比卡菌素的生物形成中发挥重要作用,ΔFoc4Bik1敲除突变体菌液颜色发生改变外,不影响病原菌的生长发育、产孢及致病力,是Foc4良好的内源报告基因。以Foc4Bik1为靶标基因,初步构建了Foc4的基因编辑技术,后续将继续优化Cas9序列,NLS核定位信号,完善香蕉枯萎病的基因编辑技术,为病原菌的功能基因组学提供有力的技术支撑。