油棕（Elaeis guineensis Jacq.）是重要木本油料作物,单产和总产均世界第一,被美誉为“世界油王”[1]。油棕原产于热带西非,目前主要分布在南纬10°至北纬15°的56个热带亚非拉太国家和地区,喜高温多雨的气候,适宜生长温度为24~27℃,低于15℃生长受到影响[2]。前期调查表明,我国海南、云南、广东、广西、福建5省（区）均有油棕分布[3],除海南南部以外,我国其他热区地处热带边缘[4],热量远低于油棕原产区,并经常遭遇低温侵袭,尤其是极端低温,对油棕生长发育造成严重威胁。因此,建立适宜的抗寒评价方法并应用于抗寒油棕种质资源的筛选,对我国热带北缘油棕发展具有现实意义。
近年来,对油棕抗寒生理鉴定已有较多报道,在低温胁迫下油棕叶片的生理生化指标会发生明显的变化,其抗寒能力与渗透调节物质和抗氧化酶等指标密切相关[5,6,7,8,9]。曹建华等[10]对10个油棕品种RYL31~RYL40的8个月龄的袋育苗进行不同温度梯度处理,采用主成分分析法进行抗寒性评价,认为丙二醛和相对电导率是评价油棕抗寒性的重要指标。曹红星等[6]根据MDA、Pro、SS等生理指标的变化规律对哥斯达黎加引进的油棕资源TE、BE、OG和海南本地种BD的6个月龄的袋育苗进行抗寒评价,初步筛选出MDA、Pro和谷胱甘肽还原酶（GR）3个抗寒指标。利用单一的指标很难客观准确地反映植物的抗寒能力,目前隶属函数法已广泛应用于对不同资源或品种的抗寒性综合评价[11,12,13,14],金龙飞等[15]采用隶属函数法对低温胁迫下9个油棕品种的MDA、SP和SS等生理指标进行了抗寒性评价。林榕燕等[16]采用隶属函数法对6个秋石斛品种的SS、MDA和SP等生理指标进行抗寒性综合评价,得出抗寒性评价结果与低温半致死温度（LT50）和田间观测结果基本一致。本研究选择云南大理抗寒高产成龄油棕树的自交F1代,利用人工模拟低温胁迫方法,通过观察子一代群体在低温胁迫后的寒害程度及其恢复生长情况将其划分为4个寒害等级,并测定了4个寒害等级材料的MDA、Pro、SS含量以及POD和SOD活性的变化,然后运用隶属函数法对4个寒害等级材料的抗寒性进行综合评价,以期为今后开展油棕抗寒性评价与利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为云南大理（100°72° E,25°50° N,海拔1381 m,年均温14.9℃,极端最低温-3.3~ 2.3℃[17]）抗寒高产油棕成龄树的自交F1代有性系,总株数31株,苗龄为3年的盆栽苗,现存叶片总数为5~10片,株高100~150 cm。
1.2 方法
1.2.1 低温处理 试验于2021年2月在中国热带农业科学院橡胶研究所冷库进行4℃低温处理,设置4个时间梯度：0（对照）、1、3、5 d,每天光照12 h,胁迫后采集植株第2~3片叶叶轴中部两侧的小叶作为样品,将叶样用去离子水洗净后再用锡箔纸严密包裹,然后放到液氮中速冻,最后转移到-80℃超低温冰箱保存待测。
1.2.2 寒害分级 将所有植株低温胁迫5 d后放置在自然条件下恢复生长1个月,然后每天对油棕叶片的寒害症状（叶片萎蔫、干枯以及枪叶干枯腐烂等）进行观测,根据观测结果划分为4个寒害等级（表1）。
表1 油棕寒害等级的评价标准Tab. 1 Evaluation criteria for cold damage of oil palm |
| 寒害等级 Cold injury level | 寒害症状Cold damage symptoms |
|---|---|
| 1级 | 树冠叶片和枪叶无寒害症状;生长点未受害,1~2个月后能恢复生长。 |
| 2级 | 树冠部分叶片受害,受害叶片中有部分小叶的叶缘和叶尖褪绿变黄;枪叶干枯;生长点未受害,2~3个月后能恢复生长。 |
| 3级 | 树冠全部叶片受害,受害叶片中有1~3片叶中的小叶全部受害（小叶干枯变褐色或除主脉及其附近呈绿色外其余部分为褐色）,其余叶片中有部分小叶的叶缘和叶尖褪绿变黄;枪叶干枯;生长点未受害,2~4个月后能恢复生长。 |
| 4级 | 树冠全部叶片受害,受害叶片中全部小叶干枯;枪叶干枯或腐烂;生长点受害且不能恢复生长,植株死亡。 |
1.2.3 生理指标的测定 将同一寒害等级的油棕叶片样品等量混合,每个寒害等级重复3次。可溶性糖（SS）含量和脯氨酸（Pro）含量采用南京建成试剂盒测定,丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化物酶（POD）活性采用索莱宝试剂盒测定。
1.2.4 抗寒性评价 参照付超等[18]的方法,采用隶属函数法对油棕进行抗寒性综合评价,求出各寒害等级材料不同生理指标的隶属函数值,公式如下：
${{U}_{ij}}=({{X}_{ij}}-{{X}_{\text{min}}})/({{X}_{\text{max}}}-{{X}_{\text{min}}})$
${{U}_{ij}}=1-({{X}_{ij}}-{{X}_{\text{min}}})/({{X}_{\text{max}}}-{{X}_{\text{min}}})$
式中：Uij表示i寒害等级材料的 j生理指标的隶属函数值,Xij表示i寒害等级材料的 j生理指标的测定值,Xmin表示所有寒害等级材料j生理指标测定值的最小值,Xmax表示所有寒害等级材料j生理指标测定值的最大值。与抗寒性呈正相关的生理指标采用公式（1）计算,与抗寒性呈负相关的生理指标采用公式（2）计算。
1.3 数据处理
采用Microsoft Excel 2010软件进行试验原始数据整理,采用DPS软件进行方差分析（Duncan's多重比较法）,采用Originpro 2018软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 低温胁迫对油棕叶片生长的影响
根据油棕幼苗低温胁迫5 d后在自然环境下的叶片恢复生长情况划分为4个寒害等级（图1）,其中1级、2级、3级和4级的植株分别为5株、14株、8株和4株,寒害率分别为16.13%、45.16%、25.81%和12.90%（表2）。所有植株在低温处理期间均无明显的叶片寒害症状,但在恢复生长阶段部分植株逐渐表现出寒害症状,其中恢复生长5 d后植株开始出现叶片形态变化、枪叶基部变黑等症状;10 d后枪叶变黑区域扩大,嫩叶出现萎蔫,老叶叶缘干枯;20 d后枪叶干枯,嫩叶褪绿变黄,出现褐斑,老叶干枯;30 d后嫩叶褐斑增多,个别植株全部叶片干枯;除寒害4级的植株死亡外,其他等级的植株均能在2~4个月内恢复生长。由此可见,大多数油棕幼苗4℃低温胁迫5 d后,能在2~4个月内恢复正常生长,说明云南大理抗寒成龄油棕树的自交子一代具有较强的抗寒能力。
图1 不同寒害等级植株自然环境下恢复生长情况A：寒害1级;B：寒害2级;C：寒害3级;D：寒害4级。 Fig. 1 The recovery growth of plants with different cold levels in the natural environment A: Cold injury level 1; B: Cold injury level 2; C: Cold injury level 3; D: Cold injury level 4. |
表2 低温胁迫下云南大理抗寒高产油棕成龄树的自交子一代受害情况Tab. 2 Injury situation of first self-bred progeny of mature oil palm trees with cold tolerance and high yield in Dali, Yunnan under low temperature stress |
| 寒害等级 Cold injury level | 株数 Number of plants | 寒害百分比 Percentage of cold damage/% |
|---|---|---|
| 1级 | 5 | 16.13 |
| 2级 | 14 | 45.16 |
| 3级 | 8 | 25.81 |
| 4级 | 4 | 12.90 |
2.2 低温胁迫对油棕叶片丙二醛（MDA）含量的影响
低温胁迫下不同寒害等级油棕叶片MDA含量随胁迫时间的延长均呈显著上升的趋势,以处理5 d时含量最高（图2）,且在不同时间处理间均达到极显著差异（P<0.01）,说明随着低温胁迫时间的延长,油棕叶片细胞膜系统受害程度不断加剧,但不同寒害等级材料的受害程度不同。在低温胁迫下,不同寒害等级材料之间的MDA含量也存在显著差异（P<0.05）,寒害1级材料的MDA含量始终处于最低水平,其次是寒害2级材料,寒害4级材料除胁迫1 d外,其余均处于最高水平。不同寒害等级材料间的MDA含量增加的幅度存在明显差异,与对照相比,4级材料的MDA含量上升的幅度最明显,上升198.2%,1级材料的上升幅度最小,上升137.2%,说明4级材料叶片细胞膜受损程度最高,抗寒能力最小,1级材料的叶片受损程度最小,抗寒能力最强。
2.3 低温胁迫对油棕叶片脯氨酸（Pro）含量的影响
如图3所示,低温胁迫下不同寒害等级材料间的Pro含量差异显著（P<0.05）,随胁迫时间的增加,4个寒害等级材料的Pro含量均有不同幅度的增加,且不同胁迫时间之间差异极显著（P<0.01）,增加幅度最大为1级,最小为4级,分别增加了100%和59.4%,说明不同等级材料通过提高自身Pro含量来增强其抗寒适应的能力存在差异。在低温胁迫5 d后,1级材料的Pro含量最高,2级材料次之,3级和4级材料最小,说明1级材料抗寒性较强,3级和4级抗寒性较弱。
2.4 低温胁迫对油棕叶片可溶性糖（SS）含量的影响
低温胁迫后不同寒害等级材料的SS含量较对照均有所升高（图4）,且不同胁迫时间之间差异极显著（P<0.01）,随低温胁迫时间的增加,1级、2级和3级材料的SS含量呈上升趋势,4级材料的SS含量呈先升高后下降的趋势,在胁迫3 d时含量最高。低温胁迫下不同寒害等级材料的SS含量增加的幅度不同,低温胁迫5 d时,1级材料的SS含量增加幅度最大,较对照增加49.0%,4级材料的增加幅度最小,增加10.1%。
2.5 低温胁迫对油棕叶片过氧化物酶（POD）活性的影响
低温胁迫下不同寒害等级材料的POD活性变化存在明显差异,随着低温处理时间的增加,1级、2级和3级材料的POD活性均呈先上升后下降的趋势,而4级材料呈先上升再下降又上升的趋势（图5）。低温处理1 d后,4个等级材料的POD活性均达到最高,分别较对照增加38.5%、11.8%、32.8%、57.5%,且极显著高于其他处理（P<0.01）;低温处理5 d时,1级、2级和3级材料的POD活性均低于对照,分别较对照降低6.1%、31.1%、48.0%,仅4级材料的POD活性高于对照,较对照增加34.2%,且极显著高于其他材料（P<0.01）。
2.6 低温胁迫对油棕叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响
如图6所示,随着低温胁迫时间的增加,4个等级材料的SOD活性均呈不同幅度的增加趋势,且不同胁迫时间之间差异极显著（P<0.01）,寒害1级材料的SOD活性均处于最高值,寒害4级材料均处于最小值。不同寒害等级材料的变化幅度明显不同,寒害1级材料SOD活性的增加幅度最大,2级和3级次之,4级的增加幅度最小,分别较对照增加653.8%,355.7%、337.1%和279.3%,胁迫0~3 d时,4个材料的SOD活性增加幅度更加明显,胁迫3~5 d时,2级、3级和4级增加幅度较为缓慢,而1级材料增幅较快,说明不同寒害等级材料对低温抵抗能力存在差异。
2.7 隶属函数综合分析
采用隶属函数法,对低温胁迫下4个寒害等级材料的MDA含量、Pro含量、SS含量、SOD活性和POD活性等5项指标的隶属函数值求得平均值,平均隶属函数值越大说明抗寒能力越强,反之抗寒能力越弱[19],其中Pro、SS、SOD和POD与油棕抗寒性呈正相关采用隶属函数公式计算,MDA与油棕抗寒性呈负相关则采用反隶属函数公式计算。各寒害等级材料的平均隶属函数值如表3,由表3可见,4个材料的隶属函数值差异较大,介于0.040~0.847之间,按照排名得到4个材料的抗寒性综合评价结果,4个材料的抗寒能力表现为1级>2级>3级>4级,表明隶属函数综合评价结果与低温胁迫后的植株寒害分级结果一致,隶属函数法可以作为油棕抗寒性评价的方法。
表3 油棕叶片低温胁迫下5项指标的隶属函数值Tab. 3 Membership function values of five indicators of oil palm leaves under low temperature stress |
| 寒害等级材料 Cold injury level material | 隶属函数值 Membership function value | 排名Rank | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MDA | Pro | SS | SOD | POD | 平均值Average value | ||
| 1级 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.235 | 0.847 | 1 |
| 2级 | 0.566 | 0.605 | 0.768 | 0.370 | 1.000 | 0.662 | 2 |
| 3级 | 0.059 | 0.000 | 0.000 | 0.310 | 0.373 | 0.148 | 3 |
| 4级 | 0.000 | 0.077 | 0.125 | 0.000 | 0.000 | 0.040 | 4 |
3 讨论
低温是植物生长过程中重要的非生物胁迫因子,植物受到低温胁迫时,会发生一系列的生理响应变化,以抵御不良环境,评价植物抗寒生理特性,可在一定程度上反映植株对低温的耐受程度。MDA是植物叶片膜脂过氧化作用的重要产物,随着低温胁迫程度的加剧,植物体内的MDA含量升高,叶片细胞膜系统受损愈加严重,被认为是反映植物抗寒性的重要指标[20,21,22]。本研究表明,在低温胁迫下,随着胁迫时间的增加,4个不同寒害等级油棕的叶片MDA含量总体呈不同幅度升高趋势,这与曹红星等[8, 23] 、杨华庚等[9]和刘艳菊等[5]的研究结果一致,但不同寒害等级油棕的MDA含量在不同胁迫时间下差异明显,抗寒性弱的材料增加幅度大,抗寒性强的材料增加幅度小,且抗寒性弱的材料MDA含量极显著高于抗寒性强的材料,寒害程度最低的1级材料的MDA含量在低温胁迫下明显低于其他材料,说明其受低温的影响较小。
Pro、SS等渗透调节物质是评价植物抗寒性的重要指标,研究发现,低温胁迫下,植物通过提高Pro和SS等渗透调节物质含量来维持细胞渗透平衡,进而减轻低温对植物机体的伤害[24,25]。本研究结果发现,低温胁迫下,不同寒害等级材料的Pro和SS含量随胁迫时间的增加呈升高的趋势,但不同寒害等级材料的增加幅度不同,随着胁迫程度的加剧,抗寒性强的材料能积累更多的Pro和SS,这与曹红星等[8, 23]和刘艳菊等[5]的研究结果类似,随胁迫时间的增加,寒害1级、2级和3级材料的SS含量升高,而4级材料的SS含量呈先升高后降低的趋势,可能是胁迫时间超过一定值时植物体内的可溶性糖合成受抑制[14],说明该材料对低温胁迫的防御机能减弱。
POD和SOD是植物体内重要的抗氧化酶,当植物处于低温环境下,体内会不断产生活性氧自由基,植物可通过抗氧化酶系统消除活性氧自由基,从而减轻低温造成的伤害[26,27]。本研究发现,低温胁迫下,随着胁迫时间的增加,各寒害等级材料的SOD活性呈升高的趋势,这与LI等[28]的研究结果一致,不同材料SOD活性的变化存在明显差异,抗寒性强的材料升高的速率较快,抗寒性弱的材料升高的速率较慢,寒害1级材料始终处于最大值,4级材料始终处于最小值,说明1级材料抗寒能力最强,4级最小;POD活性随胁迫时间的延长呈先升高再降低的趋势,胁迫1 d时达到最大值,除4级材料外,其余材料均在5 d时达到最小值,且显著低于对照。
影响植物抗寒性状的因素十分复杂,单一的指标很难准确全面地反映植物的抗寒性实质,应结合生理生化、形态变化以及基因调控等表型、基因型性状进行抗寒性评价。本研究对云南大理抗寒油棕成龄树的31株自交子一代幼苗进行4℃低温胁迫0、1、3、5 d,根据叶片寒害程度及其恢复生长情况可划分出4个寒害等级材料,研究发现低温胁迫后,寒害较轻的油棕的叶片MDA含量和SOD活性均分别低于和高于寒害较重的材料,可作为油棕抗寒性鉴定的参考指标。此外,低温胁迫后油棕叶片的生理指标的隶属函数值的大小与寒害等级划分结果一致,表明隶属函数法在油棕抗寒性评价中具有一定的准确性和可行性,但本研究只采用抗寒高产油棕成龄树为材料,所得结果是否适用于其他油棕材料还有待进一步确认。