土壤为植物的生长提供必需的营养元素和水分,是植物健康生长生存的基础,植物在生长过程中通过根系分泌物也向土壤中释放各种有机和无机物质,对土壤微生物种群多样性、数量和分布有很大的影响[1]。土壤微生物组成的多样性和种群功能是衡量植物健康生长与否的重要指标[2],土壤微生物可通过与病原菌进行竞争、拮抗等作用抑制病原菌的生长防止作物病害的发生,微生物群落结构丰富度及多样性越高,在对抗病原菌时发挥的作用就越明显[3]。但是,土壤微生物也可通过积累大量的病原菌导致植株染病死亡[4],许多土传病害的发生与微生物有非常密切的关系。王茹华等[5]研究表明,植物对土传病害表现出的抗性与根际真菌有密切关系;刘先良[6]、董朝霞等[7]研究发现接种丛枝菌根真菌能提高植株对青枯病的抗性并能促进植株生长;龚云丽等[8]研究发现丛枝菌根真菌对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）有抑制作用;张深[9]通过平板拮抗实验筛选出的15株对烟草青枯病有抑制作用的菌株中,分泌抗菌活性物质最强的2株均为真菌菌株;董夏伟[10]用滤纸法从59株真菌中分离出2种对烟草青枯病菌有较好抑制作用的拮抗真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）和浅黄新萨托菌（Neosartorya aureola）,抑菌圈直径分别为10 mm和9.5 mm,经过反复拮抗试验表明抑菌圈直径无明显差异;黎起秦等[11]筛选到5株经鉴定对西瓜枯萎病、番茄青枯病有抑制活性的康氏木霉菌,且在人工接种条件下仍有防效。
1 材料与方法
1.1 材料
2019年7月在琼中红毛镇牙挽农场采集桑树土壤样品,土质为砂砾土。采样点信息：19°00′10″ N,109°38′46″ E,海拔368 m,pH 5.93,有机质0.4279 g/kg,土壤有机质58.12 g/kg、电导率205 uS/cm、盐分115 g/kg、总悬浮物（TSS）100 mg/L,全钾865.34 g/kg,全磷19 496.83 g/kg。采用五点取样法,随机选取‘抗青283’ב抗青10’（QZ1K）和易感桑品种‘强桑1号’（QZ1Q）各5株,挖取植株地下10~20 cm根系,抖落较大块土壤后,用软毛刷刷取根表面0~5 mm的土壤于样品袋中,混合均匀后分装进4个5 mL冻存管中分别编号为QZ1K1~QZ1K4和QZ1Q1~ QZ1Q4,置于冰盒,-80 ℃冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1 土壤根际样品微生物DNA的提取 取充分混合后的土壤根际样品0.5 g,采用QIAamp 96 PowerFecal QIAcube HTkit(13)试剂盒按照说明书提取根际土壤DNA,之后用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。
1.2.2 基因扩增与测序 TaKaRa公司的Takara Ex Taq高保真酶进行PCR,利用ITS1-ITS2区域（引物ITS1F 5¢-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA A-3¢和ITS2 5¢-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3¢）进行扩增[6]。PCR扩增体系：25 µL 2×Premix Taq（TakaraBiotechnology）,引物各1 µL（10 mmol/L）,DNA模板3 µL（20 ng/µL）,加ddH2O溶解定容至50 µL。PCR反应程序：预变性94 ℃ 5 min;变性94 ℃ 30 s,退火52 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,30个循环;延伸72 ℃ 10 min。采样琼脂糖电泳检测,利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒精确定量回收产物并进行测序。
1.3 数据处理
使用Trimmomatic（Version 0.35）软件首先把原始数据（raw data）质量部分进行剪切,拼接继而得到整条的paried end序列。使用QIIME的split-libraries（version1.8.0）软件得到clean tags序列。去除非特异性序列和嵌合体,得到valid tags序列。对质控得到的质量较高的序列valid tags使用vsearch（version 2.4.2）软件按照97%的相似度进行OTU（操作分类单元）分类,并选取每个OTU种丰度最大序列作为该OTU的代表序列,采用RDP classifier Native Bayesian分类算法对代表序列与数据进行对比注释,得到OTU的注释信息。使用BioVenn在线软件进行Flower图绘制;对2个样本测序数据各取平均值后,使用Excel 2013和SPSS19.0软件对相对丰度数据进行统计分析,绘制相对丰度柱状图;使用Qiime软件观测物种数、Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数、PDwhole指数、Goods_coverage指数等多样性指数,稀释曲线图用R软件绘制。通过LDA对根际细菌群落进行LEFSE分析（LDA Score2.5）寻找不同样地桑树根际土壤真菌群落差异。用FUNGuild软件对测序得到的2个样本的OTU进行营养型类别分析。
2 结果与分析
2.1 OTU聚类分析
原始数据经过优化处理后共得到266 777条高质量序列,单一样本序列数在24 264~40 473条之间。在97%的相似度水平上对2种桑树的OTU进行聚类分析,得到2604个OTU,共分析鉴定出9个门、33个纲、96个目、184个科、319个属、592个种。由图1 QZ1K和QZ1Q根际土壤真菌群落OTU flower图可知,QZ1K和QZ1Q根际土壤真菌共有OTUs 107个,QZ1K根际土壤真菌特有OTUs分别为371、307、483、530个,分别占其总数的77.62%、74.15%、81.86%、83.2%;QZ1Q根际土壤真菌特有OTUs分别为382、550、342、455个,占其总数的78.12%、83.71%、76.17%、80.96%。
2.2 Alpha多样性分析
图2 不同桑树品种根际土壤真菌群落Chao1指数（A）和Observed-species指数（B）Fig. 2 Chao1 index (A) and Observed-species index (B) of fungi community in rhizosphere soil of different mulberry varieties |
表1 不同品种桑树根际土壤真菌群落Alpha多样性分析Tab. 1 Analysis of Alpha diversity of fungi community in rhizosphere soil of different mulberry varieties |
| 样本 Sample | 丰富度指数 Chao1 | 物种覆盖率指数Goods-coverage | 测序深度指数Observed-species | 香农指数 Shannon | 辛普森指数 Simpson |
|---|---|---|---|---|---|
| QZ1K | 703.45a | 0.99130a | 533.75a | 5.1479a | 0.88079a |
| QZ1Q | 721.57a | 0.99093a | 539.7a | 5.5056a | 0.92361a |
注：同列相同小写字母表示不同样本间无显著差异（P>0.05）。 | |
Note: The same lowercase letters in the same column indicate no significant difference among different samples (P>0.05). |
2.3 不同品种根际土壤真菌群落结构分析
2.3.1 门水平根际土壤真菌群落结构分析 由图3可知,在门水平分类上,QZ1K和QZ1Q桑树品种根际土壤中的真菌群落Others-Top30优势菌门为：子囊菌门（Ascomycota）分别为54.86%和68.04%,担子菌门（Basidiomycota）分别为24.67%和15.12%,接合菌门（Zygomycota）分别为3.17%和1.90%,球囊菌门（Glomeromycota）分别为2.92%和0.80%,壶菌门（Chytridiomycota）分别为1.12%和0.81%,其他类群分别为13.25%和13.30%。其中,根际土壤中担子菌门（Basidiomycota）、接合菌门（Zygomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）、壶菌门（Chytridiomycota）相对丰度QZ1K高于QZ1Q。
2.3.2 纲水平根际土壤真菌群落结构分析 由图4可知,在纲水平分类上,QZ1K和QZ1Q桑树品种根际土壤中的真菌群落组成Others-Top30优势菌纲为：粪壳菌纲（Sordariomycetes）分别为27.68%和38.49%,座囊菌纲（Dothideomycetes）分别为18.95%和21.93%,伞菌纲（Agaricomycetes）分别为22.04%和11.35%,银耳纲（Tremellomycetes）分别为2.28%和3.29%,Mortierellomycotina分别为2.90%和1.63%,散囊菌纲（Eurotiomycetes）分别为2.30%和1.24%,球囊菌纲（Glomeromycetes）分别为2.43%和0.75%,其他类群分别为18.08%和18.70%。其中根际土壤中银耳纲（Tremellomycetes）、Mortierellomycotina、散囊菌纲（Eurotiomycetes）、球囊菌纲（Glomeromycetes）的相对丰度QZ1K高于QZ1Q。
2.3.3 属水平根际土壤真菌群落结构分析 由图5可知,在属水平分类上,QZ1K和QZ1Q桑树品种根际土壤中真菌群落组成Others-Top30主要为：镰孢菌属（Fusarium）分别5.43%和5.84%,腐质霉属（Humicola）分别为0.46%和8.46%,淡紫拟青霉属（Purpureocillium）分别为5.71%和0.01%,旋孢腔菌属（Cochilobolus）分别为1.79%和2.22%,拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）分别为1.72%和2.09%,Galerella分别为0.01%和3.21%,木霉属（Trichoderma）分别为0.51%和1.39%,斜盖伞属（Clitopilus）分别为1.54%和0.32%,被孢霉属（Mortierella）分别为0.78%和1.01%,漆斑菌属（Myrothecium）分别为1.21%和0.36%,其他属分别为76.92%和72.98%。其中,根际土壤中淡紫拟青霉属（Purpureocillium）、斜盖伞属（Clitopilus）、被孢霉属（Mortierella）的相对丰度QZ1K高于QZ1Q。
2.4 桑树根际土壤优势真菌差异分析
使用LEfSe分析抗性品种QZ1K和易感品种QZ1Q根际土壤中真菌群落的主要差异物种（LDA Score的预设值为2.5,小于2.5视为没有差异）发现,抗性品种QZ1K根际土壤中小皮伞属（Marasmius）、小皮伞科（Marasmiaceae）、海壳科（Halosphaeriaceae）、球囊霉目_f_uncultured、瓶霉属（Phialophora）、球囊霉目_f_uncultured_g_ uncultured的相对丰度显著高于易感品种QZ1Q,而赤壳科（Nectriaceae）、赤壳科_g_uncultured、Cantharellales-fam-incertae-sedis、Minimedusa、被孢霉科_g_uncultured、干朽菌科（Serpulaceae）、干腐菌属（Serpula）、毛孢壳目（Coniochaetales）这几类真菌群落在易感品种QZ1Q根际土壤中的相对丰度显著高于抗性品种QZ1K（图6A）。抗性品种QZ1K根际赤壳科LDA值最大,易感品种QZ1Q根际小皮伞属LDA值最大,可见这2个真菌群落在抗性品种QZ1K和易感品种QZ1Q根际土壤中的差异最大。抗性品种QZ1K根际土壤中起重要作用的真菌群落为：海壳科、小皮伞科、球囊霉目_f_uncultured_,而易感品种QZ1Q根际土壤中起重要作用的真菌群落为：毛孢壳目（Coniochaetales）、赤壳科（Nectriaceae）、干朽菌科（Serpulaceae）、Cantharellales-fam-incertae- sedis（图6B）。
图6 不同桑树品种根际土壤LEfSe分析A：不同桑树品种根际土壤真菌群落的主要差异物种;B：不同桑树品种根际土壤中有重要作用的真菌群落。 Fig. 6 LEfSe analysis of rhizosphere soil of different mulberry varieties A: Main species of rhizosphere soil fungal communities of different mulberry varieties; B; Fungal communities that play an important role in rhizosphere soil of different mulberry varieties. |
2.5 真菌营养型分类
用FUNGuild软件对抗性品种QZ1K和易感品种QZ1Q的OTU进行营养型类别分析,主要划分为3类：病原营养型、腐生营养型和共生营养型。其中Highly Probable（1个）和Probable（98个）为病原营养型真菌共有99个,属于植物病原菌的有74个,属于动物病原菌的有8个;Highly Probable（19个）和Probable（227个）为腐生营养型共246个;Highly Probable（129个）和Probable（19个）为共生营养型共148个,属于外生菌根真菌的有41个,属于外生菌根真菌的有11个。进一步分类得到22个Guild（图7）,抗性品种‘抗青283’ב抗青10’根际真菌病原营养型真菌数量相对较多,而易感品种‘强桑1号’根际聚集了相对较多的腐生营养型和共生营养型真菌。
3 讨论
本研究以海南省琼中县主栽桑树抗性品种‘抗青283’ב抗青10’（QZ1K）和易感桑品种‘强桑1号’（QZ1Q）为研究对象,对其根际土壤真菌群落多样性研究发现根际真菌群落多样性差异未达到显著水平,这可能与相近植被和气候以及土壤条件下,真菌群落的组成具有较高的相似性有关[16]。在门水平,子囊菌门、担子菌门、接合菌门、球囊菌门和壶菌门等为2个样本根际土壤真菌的优势菌门,分别占‘抗青283’ב抗青10’和‘强桑1号’根际真菌门整体的86.74%和86.67%,与王艳云等[17,18,19,20]的研究结果相似。在土壤根际真菌群落属水平,优势菌属主要分布在镰孢菌属、腐质霉属、淡紫拟青霉属、旋孢腔菌属、拟盘多毛孢属等,但抗性和易感品种在各个属丰度上存在不同,抗性品种‘抗青283’ב抗青10’根际真菌淡紫拟青霉属、斜盖伞属、被孢霉属的相对丰度均高于易感品种‘强桑1号’。淡紫拟青霉是被广泛应用的一种生防菌,单独或者结合药剂使用都能增强植物的抗逆性[21,22,23],张雅静等[24]研究表明,淡紫拟青霉菌株对黄瓜根腐病和根结线虫病的防效高于同类商品菌株,张菁等[25]研究表明淡紫拟青霉属可诱导番茄植物防御酶活性的提高进而抑制番茄霉灰病的发生。木霉能产生多种拮抗物质及水解酶能对很多病原因子产生抑制作用,是目前研究较多、应用广泛的一种生防菌[26,27,28],‘抗青283’ב抗青10’和易感桑品种‘强桑1号’的根际土壤中均检测到木霉菌,但抗性品种的木霉菌含量低于易感品种,具体原因将进一步探索。
本研究结果表明,2种抗桑青枯病桑树根际土壤真菌群落优势菌群丰度和多样性无显著差异,抗性品种根际检测到可能与其抗性有关的淡紫尼青霉属和丛枝菌根球霉菌目。研究结果将为海南桑青枯病拮抗真菌的筛选与有效利用奠定基础。