植物在生长发育过程中不可避免地遭受多种生物和非生物胁迫的影响,其中干旱、盐碱、低温是影响植物生长常见的三大非生物胁迫因素,三者在植物生理上均会导致植物水分匮乏、细胞失水,从而造成渗透胁迫[1]。渗透胁迫下植物体内会发生多种变化,如Lei等[2]发现渗透胁迫下小麦幼苗的相对水分含量会降低;马廷臣等[3]利用PEG-6000模拟干旱处理2种水稻幼苗材料,发现胁迫处理下两种水稻的根体积、根粗、根长、根系质膜相对透性和POD活性等生理指标均受到严重影响;另有研究表明,在非生物胁迫条件下,植物体内活性氧的生成和消除处于平衡状态,但随着渗透胁迫程度的加深和时间延长,活性氧大量积累,膜脂过氧化加剧,水稻叶片质膜透性增加,丙二醛（MDA）含量显著提升,造成膜系统和多种酶损伤[4]。此外,渗透胁迫还会改变植物的叶绿素结构,使光合色素发生降解,光合电子系统受到破坏,光合作用受损[5]。
然而植物作为固着型生物,在长期的逆境环境中往往会形成相应的响应机制。即植物为适应渗透胁迫环境,细胞常常通过在体内积累溶质来增强渗透调节以降低水势,维持植物体内的水分平衡,从而降低渗透势,保证作物的正常生长[6]。海藻糖（Trehalose）就是植物重要的渗透调节物质之一,近年来有关海藻糖的研究也比较多。海藻糖是由两分子葡萄糖残基以α,α-1,1-糖苷键连接而成,具有特殊性质的非还原二糖[7],其广泛存在于除脊椎动物外的许多生物中,此外,因其稳定的化学结构以及特殊的物理性质[8],海藻糖成为了一种重要的抗逆化合物[9,10],帮助生物细胞在极端条件下维持核酸、蛋白以及生物膜的活性,并保护细胞结构[7]。许多微生物、低等动、植物在遭受不良生活环境时,细胞内通过体内调节合成海藻糖以抵御逆境胁迫。此外,外源添加海藻糖也能较好保护细胞、生物体及生物大分子。目前已在水稻[11]、小麦[12]、油菜[13]、黑麦草[14]、番茄[15]、海锦葵[16]等植物中得到验证,主要体现在抗离子渗透、干旱、高温、低温胁迫等方面。
外源添加海藻糖对植物的保护作用多体现在植株方面,在细胞水平上,外源海藻糖对渗透胁迫下细胞的保护作用的研究鲜有报道。据此,本研究以西瓜悬浮细胞系为试验材料,通过测定和观察外源海藻糖对渗透胁迫下西瓜悬浮培养细胞的生长量、西瓜细胞外pH、细胞内ROS含量、细胞微管骨架结构的变化,初步了解渗透胁迫对西瓜细胞的影响和外源海藻糖对西瓜细胞的保护作用,为后期进一步研究海藻糖对渗透胁迫下西瓜细胞的保护作用机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
选用“FR-32-1B-2n”二倍体西瓜的悬浮细胞系为材料,细胞系通过诱导西瓜叶片愈伤组织建立,继代周期为7 d。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂配制方法 （1）甘露醇（Mannitol,Sigma-Aldrich, 上海）：用MS培养基（Phytotechnology laboratories,美国）做溶剂,工作浓度为100 mmol/L,121 ℃灭菌30 min,4 ℃保存备用。
（2）海藻糖（Sigma-Aldrich,上海）：用超纯水配制,工作浓度为10 mmol/L,用0.22 μm滤膜过滤灭菌,4 ℃保存备用。
（3）Dihydrorhodamine123（DHR123）（Sigma- Aldrich,上海）：用二甲基亚砜（DMSO）溶解配制,工作浓度10 μmol/L,-20 ℃避光保存。
1.2.2 西瓜悬浮细胞生长量的测定 分别以100 mmol/L甘露醇、10 mmol/L海藻糖+ 100 mmol/L甘露醇处理西瓜悬浮细胞,设不加任何处理培养的细胞为对照（CK）,处理后细胞置于150 r/min摇床,25 ℃暗培养7 d,参照Ismail等[17]的方法测定△PCV（Packed cell volume）,并用以表示西瓜悬浮细胞的生长量,△PCV=沉淀细胞体积（VC）/总细胞体积（VT）,其中对照组细胞生长量定为100%。试验设3次重复。
1.2.3 西瓜悬浮细胞培养基pH的测定 吸取2 mL西瓜悬浮细胞于青霉素瓶中,置于150 r/min摇床上平衡稳定后,参照Qiao等[18]的方法,使用梅特利-托利多pH计测定不同处理条件下细胞外pH变化,并将对照组的pH计为1,计算处理的相对pH。
1.2.4 西瓜悬浮细胞ROS的测定 吸取1.5 mL处于指数增长期的悬浮细胞于离心管中,置于150 r/min摇床25 ℃下稳定培养30 min,然后用MS培养液洗脱后预平衡1 h,用终浓度10 μmol/L的DHR123染色,染色孵育洗脱后,处理细胞30 min,然后参考Chang等[19]的荧光显微观察法,测定不同处理下西瓜悬浮细胞内ROS含量的变化。即吸取处理后细胞置于载玻片上,同时进行明场和荧光显微观察及拍照,通过计算整个细胞面积的荧光强度与整幅面积的荧光强度的比值,得到ROS相对荧光强度。
1.2.5 西瓜悬浮细胞微管荧光免疫显微观察 吸取1.5 mL处于指数增长期的西瓜悬浮细胞于2 mL离心管中,分别用对照组、100 mmol/L甘露醇和10 mmol/L海藻糖（预处理12 h）+100 mmol/L甘露醇处理细胞1 h。按参考乔飞等[20]的方法,对处理后细胞依次进行固定、酶解、封闭非特异性结合位点、特异抗体[一抗anti-α-Tubulin DM1A (Sigma-Aldrich)]与抗原的结合、二抗[FITC- conjugated antibody(Sigma-Aldrich)]与一抗结合,保湿温育洗脱,使用Leica SP8激光共聚焦荧光显微镜,在40倍物镜下对其细胞微管骨架进行GFP观察并拍照。
1.3 数据处理
数据使用WPS Office中的 Excel软件进行汇总整理,并使用DPS 15.10软件进行统计分析,经Duncan多重比较各处理组间的差异显著性。
2 结果与分析
2.1 外源海藻糖对渗透胁迫下细胞生长量的影响
植物生长受到抑制是遭受逆境的表观生理反应。由图1可见,与对照组相比,100 mmol/L甘露醇诱导处理西瓜悬浮细胞7 d后,西瓜悬浮培养细胞的生长量明显下降,且下降幅度达到57.33%;此外,对照组和甘露醇处理组两者之间的西瓜细胞生长量差异达到极显著水平（p< 0.01）,说明渗透胁迫能够抑制细胞的生长;进一步通过外源添加海藻糖预处理发现：外源海藻糖处理组西瓜悬浮培养细胞的生长量是甘露醇处理组的1.97倍（p<0.01）,说明外源海藻糖对甘露醇胁迫下西瓜悬浮培养细胞的生长量有明显的缓解作用。
图1 外源海藻糖对渗透胁迫下西瓜悬浮培养细胞生长量的影响不同大写字母表示处理间差异极显著（p<0.01）,不同小写字母表示处理间差异显著（p<0.05）。 Fig. 1 Effects of exogenous trehalose on growth of watermelon suspension culturedcells under osmotic stress Different catipal letters show extremely significant differences (p<0.01); different lowercase letters show significant differences (p<0.05). |
2.2 外源海藻糖对渗透胁迫下细胞外pH的影响
质外体碱化是植物应对盐胁迫的保护机制之一[18],为探究外源海藻糖在渗透胁迫下对西瓜细胞外pH的影响,本研究通过测定不同处理下西瓜细胞外pH的变化情况,结果显示,与对照相比,100 mmol/L甘露醇处理组的细胞外pH整体呈现上升后下降的趋势,且在其诱导处理20 min左右细胞外pH达到最大值,此后呈现出下降趋势,但甘露醇处理组细胞外pH依然高于对照组;而加入外源海藻糖预处理后,结果发现西瓜细胞外pH整体呈现先下降后上升的趋势,且其诱导处理20~30 min左右时,外源海藻糖对渗透胁迫下西瓜细胞外pH的缓解程度最大（图2）。说明渗透胁迫可导致西瓜细胞外pH升高,使西瓜细胞发生细胞外碱化（质外体碱化）,而海藻糖参与质外体碱化的调节。
2.3 外源海藻糖对渗透胁迫下西瓜细胞ROS的影响
渗透胁迫条件下会打破植物体内活性氧代谢平衡,为阐明渗透胁迫下外源添加海藻糖对西瓜悬浮细胞内ROS的影响,首先,本研究对渗透胁迫下西瓜细胞体内ROS的含量变化进行探究,研究发现,经100 mmol/L甘露醇处理西瓜悬浮细胞30 min后,西瓜悬浮细胞内ROS荧光强度以及活性氧相对含量明显高于对照组,是对照组的1.4倍左右,说明渗透胁迫打破了西瓜细胞体内的活性代谢平衡,导致活性氧积累;进一步通过外源添加海藻糖发现,甘露醇胁迫下经外源海藻糖预处理的西瓜悬浮细胞内部ROS荧光强度以及活性氧相对含量明显降低,说明外源海藻糖能够缓解渗透胁迫对西瓜细胞的ROS诱导作用（图3）。
图3 外源海藻糖对渗透胁迫下西瓜细胞内活性氧相对荧光强度的影响A、B、C：明场图片;D、E、F：荧光显微图片;标尺：20 μm。 Fig. 3 Effect of exogenous trehalose on reactive fluorescence intensity of reactive oxygen species in watermelon cells under osmotic stress A, B, C: Bright field pictures;D, E, F: fluorescence microscopy images; Scale bar=20 μm. |
2.4 外源海藻糖对渗透胁迫下西瓜细胞微管骨架的影响
为了深入了解西瓜细胞微管骨架对渗透胁迫的应答模式,在100 mmol/L甘露醇诱导处理西瓜细胞1 h后,观察西瓜细胞微管骨架变化,结果发现：对照组西瓜细胞微管骨架呈完整的细平行束排列（图4A）,甘露醇处理组的西瓜细胞微管骨架排列方向混乱,原本呈线状的微管骨架发生了明显的解聚、弥散（图4B）。为进一步探究外源海藻糖对渗透胁迫下细胞微管骨架的作用,经外源海藻糖预处理12 h甘露醇胁迫1 h后,观察西瓜细胞的微管骨架,结果显示：经外源海藻糖预处理过的西瓜悬浮细胞微管骨架结构与对照组的细胞微管骨架基本相同,呈细平行束排列（图4C）。说明外源海藻糖对渗透胁迫下西瓜细胞微管骨架有一定的保护作用,能一定程度上缓解渗透胁迫对细胞微管骨架完整性造成的影响。
图4 外源海藻糖对渗透胁迫下西瓜细胞微管骨架的影响A：对照;B：100 mmol/L甘露醇处理1 h;C：10 mmol/L 海藻糖预处理12 h后,100 mmol/L甘露醇处理1 h;标尺：20 μm。 Fig. 4 Effect of exogenous trehalose on the microtubule skeleton of watermelon cells under osmotic stress A: Control; B: Treated by 100 mmol/L mannitol for 1 h; C: Pretreated with 10 mmol/L trehalose for 12 h, then challenged by 100 mmol/L mannitol for 1 h. Scale bar=20 μm. |
3 讨论
植物遇到渗透胁迫时会发生植物组织相对含水量降低[2]、光合作用受损[4]、活性氧代谢系统紊乱[5]以及细胞质膜相对透性增大等胁迫反应。本研究发现,在甘露醇胁迫处理西瓜悬浮培养细胞一个周期后,西瓜细胞的生长量显著降低。此外,有研究表明：细胞内pH是细胞内物理环境以及控制活体细胞内生物化学反应的基本指标和重要因子[21],逆境胁迫可改变H+流向,引起细胞内外pH的变化,而伴随有细胞质酸化的培养基碱化是植物细胞感受外界刺激的早期反应[22],可诱导活性氧的迸发和次生代谢物质合成及一系列防御基因的表达[23]。本研究发现：在甘露醇诱导处理西瓜悬浮细胞10 min左右时,西瓜悬浮细胞外（培养液）pH开始迅速升高,并在其诱导处理后20 min左右达到最大值;与此同时,在甘露醇胁迫处理西瓜悬浮细胞30 min后细胞内ROS荧光强度和相对ROS含量明显高于对照组,进一步说明渗透胁迫可诱导西瓜悬浮细胞系培养基碱化,ROS迸发,推测其原因一方面可能是渗透胁迫下,参与植物细胞内pH调控的有关酶基因NADP-ME（NADP苹果酸酶）,PEPCase（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）被诱导表达[21],植物细胞中的糖酵解反应被促进及大量苹果酸积累由此而引发的氢离子(H+)的生产使细胞内趋于酸性[24],另一方面可能是渗透胁迫导致细胞质膜受损,存在于细胞膜、液泡膜质膜上H-ATPase活性降低,导致质子内流,细胞质酸化,质外体碱化,促进ROS迸发。
微管作为细胞骨架的重要组成部分,在细胞有丝分裂过程中,对纺锤体的形成、染色体的运动、细胞胞质分裂和核膜的裂解、重聚有重要作用[25]。正常生长的细胞中,微管骨架的排列方向通常是垂直于细胞的生长轴[26];Komis等[27]研究发现小麦根尖细胞的微管骨架在高渗胁迫下微管骨架会受到破环;此外,高渗溶液处理拟南芥悬浮细胞时,细胞内的细微管迅速解聚,质壁分离后,随着质膜的内陷,成束的微管被挤压发生弯曲[28]。本研究发现：渗透胁迫对细胞的生长有明显的抑制作用;甘露醇处理条件下,西瓜细胞微管骨架排列方向混乱,成线状的微管骨架发生了解聚,分析其原因可能是渗透胁迫破坏了微管骨架的完整性,抑制了细胞有丝分裂的进程,从而影响西瓜细胞的正常生长。
在渗透胁迫下,植物常常通过自身的防御网络来调控相关的代谢途径——产生渗透调节物质,以降低或消除渗透胁迫产生的伤害。作为重要的渗透调节物质,海藻糖的积累可以提高作物的抗旱、耐盐碱性[29]。本研究发现,外源海藻糖对渗透胁迫下西瓜悬浮细胞生长的抑制有缓解作用,为进一步明确外源海藻糖保护细胞生长提高细胞抗逆性的分子机制,本研究在渗透胁迫的基础上通过外源添加海藻糖测定细胞外培养液pH变化、ROS含量、微管骨架结构,结果发现外源海藻糖能够保护微管骨架的完整性,降低细胞内活性氧水平,调节细胞内外H+的流向。由于微管骨架、ROS和H+不仅直接参与抗性调节,还参与了逆境信号的转导[18-19, 30],而海藻糖是否可以调节这些上游信号转导通路仍有待进一步研究。