蛋白质可逆磷酸化是通过蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化蛋白质磷酸化和去磷酸化[1,2],这一过程几乎涉及细胞所有的生命活动,如生长发育、代谢调控、信号感知与转导、分化与衰老等[3,4,5,6]。蛋白磷酸酶催化的去磷酸化负调控蛋白激酶的生化作用,从而抑制蛋白激酶的细胞学功能,并在细胞应答信号通路中起到重要的作用,特别对于调控植物生长发育和响应逆境胁迫具有重要意义。
蛋白磷酸酶是一个庞大的蛋白家族,主要分为丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PSP）和酪氨酸蛋白磷酸酶（PTP）两大类,根据蛋白质系统演化分析PSP大家族又分为PPP家族和PPM家族,其中PPP家族主要包括PP1、PP2A、PP2B（PP3）、PP4、PP5、PP6、PP7、SLP、Kelch、PPP Unique共10个亚家族[7,8]。这10个亚家族中,只有PP1、PP2A和PP2B的功能研究比较多,而其他亚家族的功能研究鲜有报道[9,10,11,12]。PP5和PP7的蛋白组分与结构、理化特性在进化史上的亲缘关系较近[13,14],与其他亚家族存在明显的差异。PP5蛋白通过TPR结构域,与分子伴侣Hsp90或Hsp70结合从而激活PP5蛋白的活性[15]。PP5蛋白在调控植物耐热性、抗病性等逆境胁迫中发挥重要的作用[16,17]。PP7蛋白是植物中第一个报道与钙调素（CaM）相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,在植物耐热性和氧化还原反应调控、光敏色素信号转导及胁迫信号转导中发挥重要作用[13, 18-20]。但是,目前有关PP5和PP7亚家族的功能研究并不多,有待深入研究。
澳洲坚果又称夏威夷果,原产于亚热带雨林,对生长环境条件要求比较高[21,22]。低温、干旱等逆境条件会影响澳洲坚果的正常生长发育,甚至造成澳洲坚果产量下降或死亡[23]。蛋白磷酸酶PP5和PP7在调控植物生长发育和响应逆境胁迫中发挥关键的作用[14, 20],但目前国内外关于澳洲坚果PP5和PP7基因的功能研究还未见报道。因此,本研究从澳洲坚果光壳种中克隆获得PP5基因MiSTPP3和PP7基因MiSTPP7,利用生物信息学分析其编码蛋白的结构特征,并利用RT-qPCR分析其在不同组织和不同胁迫中的表达特性,以期为阐明澳洲坚果PP5和PP7基因在澳洲坚果生长发育及响应冷害、干旱逆境胁迫的分子机制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
植物试材为澳洲坚果光壳种（Macadamia integrifolia）品种‘O.C.’,取自广西农业科学院广西亚热带作物研究所澳洲坚果种质资源圃。采集树龄为5~6年的‘O.C.’植株幼根、幼茎、嫩叶、刚开放的小花及谢花后30~45 d的小果。分别对处于苗期（接穗为4个月苗龄）的嫁接苗进行4 ℃低温处理（0.5、1、3、6、12、24 h）和20％浓度的PEG6000干旱处理（1、3、6、12、24、36 h）,并采集处理后的嫩叶。其中,无胁迫处理的植株作为对照（CK）,每个试验重复3次。
1.2 方法
1.2.1 MiSTPP3和MiSTPP7基因全长cDNA克隆根据蔡元保等[24]的CTAB改良法提取澳洲坚果总RNA,并参照通用型逆转录试剂盒进行澳洲坚果cDNA第1链合成。根据本课题组从澳洲坚果转录组获得的2个蛋白磷酸酶（PP5和PP7）基因,设计扩增这2个基因开放阅读框ORF的PCR引物（表1）,其中PP3-F和PP3-R扩增MiSTPP3,以及PP7-F和PP7-R扩增MiSTPP7。取1.5 μL叶片的cDNA模板进行PCR扩增：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性35 s,53.5 ℃（MiSTPP3基因）或52.6 ℃（MiSTPP7基因）退火35 s,72 ℃延伸100 s,33个循环;72 ℃再延伸7 min,10 ℃保温。
表1 澳洲坚果MiSTPP3和MiSTPP7基因克隆与表达所用的引物Tab. 1 Primers used for cloning and expression of MiSTPP3 and MiSTPP7 |
| 引物名称Primer name | 引物序列（5°‒3°）Primer sequences (5°‒3°) | 退火温度Tm/℃ | 注释Notes |
|---|---|---|---|
| PP3-F | GAAGATTCATAGGTCTCGCATAA | 53.5 | 开放阅读框ORF |
| PP3-R | CACCGTTGAACCAAATAACAT | ||
| PP7-F | TCTACTACTTCAACAACGACCAC | 52.6 | 开放阅读框ORF |
| PP7-R | TCCACTACATCCGAAGAACAT | ||
| QPP3-F | ACCATAGAGGTGGAGCCACAATA | 57.5 | 荧光定量PCR |
| QPP3-R | ATATCAACTAGGGAAGGCAGAGC | ||
| QPP7-F | GGAAGGTCTTGTTGCCAGATAG | 56.3 | 荧光定量PCR |
| QPP7-R | CATGTTTCCCTTGGTCTCCATA | ||
| QMDH-F | GCTGGTCTCATCTATTCTTTCC | 58.0 | 参照基因 |
| QMDH-R | CGTCCAACTTCTTCCTTGAG |
1.2.2 蛋白磷酸酶的生物信息学分析 利用NCBI网站的BLAST程序检索蛋白磷酸酶的同源序列,用其保守结构域库（CDD）分析蛋白磷酸酶的结构域,用ORF Finder分析蛋白磷酸酶的开放阅读框ORF,用PROSITE软件预测基元和功能结构域,用ProtParam程序分析蛋白磷酸酶的基本理化性质,用NetPhos 3.1在线程序分析蛋白质的磷酸化位点,用PSORT软件预测亚细胞定位,用TMpred软件和SignalP 4.1软件分别在线预测蛋白磷酸酶的跨膜结构和信号肽,用SOPMA软件预测蛋白质的二级结构组分及其含量,采用同源建模使用SWISS-MODEL在线工具构建蛋白质核心区域的三级结构。在NCBI网站GenBank数据库中搜索其他植物蛋白磷酸酶的同源蛋白,采用DNAMAN 6.0软件进行蛋白质多序列比对,并构建蛋白磷酸酶与其他同源蛋白的系统进化树。
1.2.3 MiSTPP3和MiSTPP7基因的表达分析 采用实时荧光定量RT-qPCR方法分析澳洲坚果MiSTPP3和MiSTPP7基因的表达情况,以澳洲坚果苹果酸脱氢酶基因MDH（GenBank登录号：MN627210）为内参基因[25],引物为QMDH-F和QMDH-R;MiSTPP3基因引物为QPP3-F和QPP3-R;MiSTPP7基因引物为QPP7-F和QPP7-R（表1）。利用RT-qPCR分析澳洲坚果MiSTPP3和MiSTPP7基因在不同组织（根、茎、叶、花和小果）和不同胁迫下（低温和干旱胁迫）的表达情况。RT-qPCR反应程序为：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性20 s,56.3~58.0 ℃（表1）退火20 s,72 ℃延伸30 s,40个循环。每个试验重复3次,根据2‒ΔΔCT方法处理数据以确定MiSTPP3和MiSTPP7基因的相对表达量。
1.3 数据处理
利用Excel软件对基因的相对表达量作图,应用SPSS 18.0软件进行数据的差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 MiSTPP3和MiSTPP7基因的全长序列克隆
PCR扩增、核苷酸测序及蛋白同源检索结果显示（图1）,获得的澳洲坚果PP3基因序列全长2095 bp,包含1455 bp的完整编码区CDS序列,共编码含有484个氨基酸的多肽;PP7基因序列全长1700 bp,包含1338 bp的完整编码区CDS序列,共编码含有445个氨基酸的多肽,其中MiSTPP3蛋白和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP5,以及MiSTPP7蛋白和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP7都具有极高的氨基酸序列相似性。因此,将这2个基因分别命名为MiSTPP3和MiSTPP7,GenBank注册号分别为MT374550和MT374554。
2.2 MiSTPP3和MiSTPP7蛋白氨基酸序列比对
采用DNAMAN 6.0软件对澳洲坚果和其他植物的蛋白磷酸酶进行蛋白质多序列比对,并用PROSITE软件分析其功能结构域。分析结果显示（图2）,澳洲坚果MiSTPP3与葡萄VvPP5、玫瑰木属植物RaPP5和辣椒CaPP5的氨基酸序列同源性分别为90.68%、89.63%和89.23%,都含有PP5亚家族的典型结构域MPP_PP5_C和N端的TPR结构域;MiSTPP7与橡胶树HbPP7、麻风树JcPP7和水芙蓉NnPP7的氨基酸序列同源性分别为77.48%、77.48%和77.38%,都含有PP7亚家族的典型结构域MPP_PP7。
图2 MiSTPP3和MiSTPP7蛋白与其他物种PP5和PP7蛋白的氨基酸序列多重比对结构域MPP_PP5_C用方框标出,结构域MPP_PP7用单下划线标出,TPR结构域用双下划线标出;VvPP5：葡萄,XP_010656954;RaPP5：玫瑰木属植物,XP_030516677;CaPP5：辣椒,KAF3628534;HbPP7：橡胶树,XP_021648354;JcPP7：麻风树,XP_012087578;NnPP7：水芙蓉,XP_010270576。 Fig. 2 Multiple comparisons of MiSTPP3 and MiSTPP7 with different plants PP5 and PP7 Domain MPP_PP5_C is boxed, domain MPP_PP7 is underlined with a single line, and the tetratricopeptide repeat (TPR) domain is underlined with the double lines; VvPP5: Vitis vinifera, XP_010656954; RaPP5: Rhodamnia argentea, XP_030516677; CaPP5: Capsicum annuum, KAF3628534; HbPP7: Hevea brasiliensis, XP_021648354; JcPP7: Jatropha curcas, XP_012087578; NnPP7: Nelumbo nucifera, XP_010270576. |
2.3 MiSTPP3和MiSTPP7与其他蛋白磷酸酶的系统发育分析
选择澳洲坚果MiSTPP3和MiSTPP7蛋白与不同物种的代表性蛋白磷酸酶构建系统发育树。结果显示（图3）,25个丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶被聚成PP1、PP2A、PP2B（PP3）、PP5和PP7共5个亚家族,其中澳洲坚果MiSTPP3蛋白属于PP5亚家族,与同一亚家族的玫瑰木属植物RaPP5和葡萄VvPP5的亲缘关系最近;MiSTPP7蛋白属于PP7亚家族,与同一亚家族的水芙蓉NnPP7和枣ZjPP7的亲缘关系最近;而且,在这5个亚家族中,PP5和PP7亚家族的亲缘关系最近,PP5和PP7亚家族又与PP1亚家族的亲缘关系最近,推测具有相同的进化起源和相似的生物学功能。
2.4 MiSTPP3和MiSTPP7蛋白的一级结构和理化性质分析
MiSTPP3蛋白的一级结构和理化性质分析结果显示,其分子质量为54.58 kDa,分子式为C2449H3786N646O719S25,理论等电点（pI）为5.81,带负电荷残基数（Asp+Glu）为69个,带正电荷残基数（Arg+Lys）为58个,不稳定系数为35.42,为稳定蛋白。脂肪族指数为79.79,亲水性系数GRAVY预测为负值（‒0.287）,为亲水性蛋白。因此,MiSTPP3蛋白是一个稳定的亲水性蛋白。
MiSTPP7蛋白的一级结构和理化性质分析结果显示,其分子质量为49.30 kDa,分子式为C2211H3433N585O665S14,理论等电点（pI）为5.50,带负电荷残基数（Asp+Glu）为57个,带正电荷残基数（Arg+Lys）为47个,不稳定系数为41.81,为不稳定蛋白。脂肪族指数为81.46,亲水性系数GRAVY预测为负值（‒0.319）,为亲水性蛋白。因此,MiSTPP7蛋白是一个不稳定的亲水性蛋白。
2.5 MiSTPP3和MiSTPP7蛋白的基本功能分析
Net Phos 3.1软件预测表明,MiSTPP3蛋白有41个磷酸化位点,包括22个丝氨酸,8个苏氨酸,11个酪氨酸。PSORT软件预测表明,MiSTPP3蛋白定位于质膜可能性最高,为70%。SignalP4.1和TMpred软件预测显示,MiSTPP3蛋白不存在信号肽,有2个跨膜结构域（262~286位,311~331位氨基酸）,故MiSTPP3为非分泌跨膜蛋白。
Net Phos 3.1软件预测表明,MiSTPP7蛋白有50个磷酸化位点,包括32个丝氨酸,11个苏氨酸,7个酪氨酸。PSORT软件预测表明,MiSTPP7蛋白定位于线粒体基质可能性最高,为46.8%。SignalP和TMpred软件预测显示,MiSTPP7蛋白不存在信号肽,有3个跨膜结构域（76~99位,155~177位,225~242位氨基酸）,故MiSTPP7为非分泌跨膜蛋白。
2.6 MiSTPP3和MiSTPP7蛋白的二级和三级结构预测
以丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP5的晶体结构（PDB ID：5obl.1.A）为同源模板,利用在线工具SWISS-MODEL预测MiSTPP3蛋白的三级结构。结果表明,MiSTPP3蛋白的氨基酸序列与模板序列一致性为85.74%,GMQE值为0.98,同源建模区域的组成以α-螺旋和无规卷曲为主,以延伸链为辅（图5A）。目前,SWISS-MODEL软件的蛋白数据库中还没有丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP7的晶体结构,只能以亲缘关系最近的PP5晶体结构（PDB ID：5hpe.1.A）为同源模板,利用SWISS-MODEL在线工具构建MiSTPP7蛋白的三级结构。结果表明,MiSTPP7蛋白的氨基酸序列与模板序列一致性为36.94%,GMQE值为0.55,同源建模区域主要由无规卷曲和α-螺旋组成（图5B）。与MiSTPP3和MiSTPP7蛋白的二级结构预测结果相符合。
2.7 MiSTPP3和MiSTPP7基因的表达分析
图6 MiSTPP3和MiSTPP7在澳洲坚果不同组织中的RT-qPCR分析不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 Fig. 6 RT-qPCR analysis of MiSTPP3 and MiSTPP7 in various tissue of Macadamia integrifolia Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). |
图7 MiSTPP3和MiSTPP7在低温胁迫中的RT-qPCR分析不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 Fig. 7 RT-qPCR analysis of MiSTPP3 and MiSTPP7 in cold stress Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). |
3 讨论
本研究结果表明,MiSTPP3和MiSTPP7可能参与了澳洲坚果植株生长发育和逆境胁迫响应。在后续的工作中,利用转基因技术对澳洲坚果MiSTPP3和MiSTPP7基因功能的深层次研究,有助于阐明这2个基因在响应逆境胁迫的生物学功能和作用机制,尤其是对于揭示植物PP5和PP7亚家族基因的信号转导网络及其亚家族间的相互关系具有重要作用。
责任编辑：黄东杰