植原体（phytoplasma）是一类寄生于植物韧皮部通过刺吸式口器昆虫传播的植物毁灭性病原菌,1967年由日本学者土居养二首次发现[1]。植原体很难从植物或昆虫寄主中分离纯化培养,对其遗传信息及表达代谢等了解相对不足,严重制约植原体研究[2,3]。植原体引起的病害寄主种类多、分布范围广、危害程度大,对社会经济、生态环境等影响严重,该病害目前尚无有效的治疗药剂,以防为主。海南省植原体病害种类十分丰富,约占我国已鉴定植原体病害的五分之一,海南植原体病害遍及整个海南岛且危害程度严重,给海南省农林业造成巨大损失[4]。海南省受植原体病害影响的作物有槟榔（Areca catechu L.）、花生（Arachis hypogaea）、苦楝（Melia azedarach）、长春花（Catharanthus roseus）、辣椒（Capsicum annuum）、细圆藤（Pericampylus glaucus）、山黄麻（Trema tomentosa）等海南特色经济作物或绿化植物,对海南的社会经济和生态环境等造成严重的影响[4,5,6,7,8],其中槟榔黄化病（areca palm yellow leaf disease, AYL）在海南发生普遍且严重,影响巨大。
槟榔是我国“四大南药”之首和海南省重要特色经济作物,具有很高的药用价值和经济价值。由植原体引起的槟榔黄化病是海南槟榔种植上的一种毁灭性病害,对海南的社会经济和生态环境造成严重影响。海南槟榔黄化病于1981年首次发现于屯昌县,目前已由发病初期的屯昌县蔓延至海口、文昌、琼海、万宁、陵水、琼中、定安、乐东、保亭、三亚、五指山等多个市（县）[4, 9]。金开璇等[10]通过超薄电镜切片在槟榔黄化病染病组织中观察到了植原体。车海彦[4]、罗大全等[11]、通过超薄电镜切片观察、四环素注射处理、PCR扩增检测等技术进一步证实植原体是海南槟榔黄化病的病原。近年来,在海南不同槟榔种植区均有不同程度的发生,且发病地区及面积仍在不断扩大,严重影响海南槟榔产业的健康可持续发展[4, 9]。目前,海南植原体病害的发生传播、扩散流行等问题尚不清楚,海南不同县（市）、不同生境、不同发病区植原体的来源、传播途径等问题尚不明确,这些问题严重制约海南相关植原体病害的防控管理。
本研究对海南不同代表性地区的槟榔黄化病进行调查,采集槟榔黄化病及疑似植原体引起的其他植物病害样品,通过PCR扩增检测、序列多重比对、系统发育分析等技术方法,从分子水平上对海南槟榔黄化植原体进行检测鉴定,丰富对槟榔黄化植原体分子水平上的认知。对本研究中槟榔黄化植原体与前期已报道的槟榔黄化植原体及亲缘关系或地理分布密切相关的植原体株系间的系统发育关系进行分析,揭示不同寄主植原体株系间遗传变异水平和系统发育关系。为槟榔黄化病在海南的传播扩散、流行监测和科学防控等研究提供科学参考,以促进海南该类病害防控理念的发展与提升。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集 实验材料于2019—2020年采自海南保亭、屯昌、万宁等地疑似槟榔黄化植原体引起的槟榔黄化病植株,每个地点采集3份叶片样品;针对同一株发病槟榔,采集叶片、花穗、心叶、茎皮、根等不同组织部位,每个组织部位采集3份样品,同时采集健康的槟榔样品作为对照,用作阳性对照的泡桐丛枝植原体样品取自中国林业科学研究院,所采样品低温保存备用。
1.1.2 试剂 植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）、2×PCR Master Mix预混液、50×TAE、SYBR Green I染料、6×Loading Buffer、DNA分子量标准DL2000购自天根生化科技（北京）有限公司,其他试剂均为国产分析纯。PCR扩增引物由生工生物（上海）工程股份有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 总DNA提取 叶片、花穗、心叶、茎皮、根等样品取样量均为0.1 g,利用CTAB法提取染病槟榔组织中的总DNA,植原体总DNA提取方法参考天根植物基因组DNA提取试剂盒说明书方法。
1.2.2 PCR扩增测序 槟榔黄化植原体通过植原体通用引物R16mF2/R16mR1、R16F2n/R16R2[2]进行扩增。用引物R16mF2/R16mR1扩增的PCR产物稀释50倍后用作引物R16F2n/R16R2进行巢式PCR扩增的模板,引物序列信息见表1。PCR反应体系和条件如下：PCR反应体系为25 μL,包括1.0 μL DNA模板,1.0 μL上游引物和下游引物（10 μmol/L),12.5 μL 2×PCR Master Mix（包含0.05 U/μL Taq DNA聚合酶,4 mmol/L MgCl2和0.4 mmol/L dNTPs）,用ddH2O补至25 μL。反应条件为94.0 ℃,5 min;94.0 ℃,30 s,53.0 ℃,40 s,72.0 ℃,1 min 30 s（直接PCR）或1 min 20 s（巢式PCR）,共35个循环;72.0 ℃,10 min。PCR扩增产物用SYBR Green I染色、经1.0%（w/V）琼脂糖凝胶、凝胶成像系统检测。相关PCR扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶检测,有明显目的条带的扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。本研究所得核苷酸序列均上传至GenBank数据库。
表1 PCR扩增引物Tab. 1 PCR amplification primers |
| 引物名称Primers name | 引物序列（5°-3°）Primer sequence (5°-3°) | 目的片段长度Length of target fragment/bp |
|---|---|---|
| R16mF2 | CATGCAAGTCGAACGGA | 1400 |
| R16mR1 | CTTAACCCCAATCATCGAC | |
| R16F2n | GAAACGACTGCTAAGACTGG | 1200 |
| R16R2 | TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG |
1.2.3 序列比对分析 获得的核苷酸序列采用DNAMAN 6.0软件（Lynnon Corporation, Vaudreuil-Dorion, Quebec, Canada）进行编辑,并进行多重序列比对,通过多重序列比对揭示不同植原体株系间的相似性及其变异位点。基于槟榔黄化植原体16S rDNA序列进行BLAST分析（ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。
1.2.4 系统发育分析 利用MEGA 7.0软件的邻接法（neighbor-joining, NJ）构建系统发育树[12]。自展值（bootstrap value）设为1000,用以评估软件生成的系统进化树的稳定性和支持率[13]。洋葱黄化植原体（onion yellows phytoplasma）OY-M（AP006628）、翠菊黄化植原体（aster yellow phytoplasma）AYWB（CP000061）、苹果簇生植原体（apple proliferation phytoplasma）CPM（CU469464）、澳大利亚葡萄黄化植原体（Australia grape yellow phytoplasma）CPA（AM422018）和草莓致死黄化植原体（strawberry lethal yellow phytoplasma）SLY（CP002548）等全基因组测序已完成的植原体株系作为构建系统发育树的外类群。
1.3 数据处理
本研究所得核苷酸序列均通过Submission Portal（ https://submit.ncbi.nlm.nih.g-ov/subs/genbank/）上传至GenBank数据库并获得序列号。
2 结果与分析
2.1 槟榔黄化植原体分子检测
在海南保亭、屯昌、万宁等3个地点采集的9份槟榔黄化病样品中,均扩增到植原体目的条带,在健康的槟榔样品中未扩增到目的条带,槟榔黄化病症状及其扩增检测结果见图1。部分样品PCR扩增产物送测序,均获得植原体靶标基因序列。所得靶标基因序列经BLAST比对分析表明：所得序列为植原体16S rDNA序列,与16SrI组植原体的16S rDNA序列同源性极高甚至一致,如本研究所得植原体的16S rDNA序列与GenBank数据库中的16SrI组油菜变叶病植原体（rapeseed phyllody phytoplasma）（CP055264）的16S rDNA序列的同源性为100%,覆盖率为100%。所得序列已上传至GenBank数据库,采自海南省保亭县的槟榔黄化植原体株系AYL-hnbt的16S rDNA基因序列号为MZ427307,采自海南省屯昌县的槟榔黄化植原体株系AYL-hntc的16S rDNA基因序列号为MZ427308,采自海南省万宁市的2个槟榔黄化植原体株系AYL-hnwn1和AYL-hnwn2的16S rDNA基因序列号分别为MZ427309和MZ427310。
图1 槟榔黄化植原体引起的病害症状和PCR检测A：槟榔黄化病症状;B：M2000代表Marker 2000分子标记,植原体目的条带大小约为1200 bp;AYL：采自万宁的槟榔黄化病样品;PaWB：泡桐丛枝植原体作为阳性对照;CK：健康槟榔样品。 Fig. 1 Diseased symptoms and PCR detection caused by areca palm yellow leaf phytoplasma A: Symptoms of areca palm yellow leaf disease; B: M2000 represents Marker 2000 molecular marker. The length of target fragment of phytoplasma is about 1200 bp; AYL: Areca palm yellow leaf disease sample from Wanning county; PaWB: Paulownia witches’ broom phytoplasma used as positive control; CK: Healthy sample of areca palm. |
2.2 序列同源性分析
基于植原体16S rDNA序列多重比对分析表明：海南保亭、屯昌、万宁等3个地点9份样品中检测到的槟榔黄化植原体16S rDNA序列一致,无变异位点,序列同源性为100%（表2）。同源比对分析表明：本研究采自海南保亭、屯昌、万宁等3个地点的槟榔黄化植原体株系AYL-hnbt、AYL-hntc、AYL-hnwn1、AYL-hnwn2与前期已鉴定的来自海南万宁（FJ998269）、印度（KF728948）的槟榔黄化植原体株系的16S rDNA序列同源性为99.9%,与来自海南三亚（FJ694685）的槟榔黄化植原体株系的16S rDNA序列同源性为99.8%。本研究采自海南保亭、屯昌、万宁等3个地点的槟榔黄化植原体株系与前期已鉴定的来自海南的苦楝丛枝植原体（chinaberry witches’- broom phytoplasma）（KP662119、KP662120）、长春花绿变植原体（periwinkle virescence phytoplasma）（KP662136）、马松子变叶植原体（Melochia corchorifolia phyllody phytoplasma）（KX150461）、辣椒黄化皱缩植原体（pepper yellow crinkle phytoplasma）（MT760793）、细圆藤丛枝植原体（Pericampylus glaucus witches’- broom phytoplasma）（MT872515）、蛇婆子绿变植原体（Waltheria indica virescence phytoplasma）（MW353909）及来自日本的洋葱黄化植原体（AP006628）、来自美国的翠菊黄化丛枝植原体（CP000061）等各个植原体株系间的同源性为100%（表2）。
Tab.2 Homology analysis of different phytoplasma strains |
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2.3 系统发育分析
采用MEGA 7.0软件基于邻接法构建系统发育树。本研究中采自海南保亭、屯昌、万宁等地的槟榔黄化植原体与车海彦[4]检测的海南三亚槟榔黄化植原体株系（FJ694685）、周亚奎等[9]检测的海南万宁槟榔黄化植原体株系（FJ998269）、Muddumadiah等[14]检测的印度槟榔黄化植原体株系（KF728948）聚于一个进化分枝,支持率为100%,均为16SrI组植原体（图2）。Ramaswamy等[15]通过16S rRNA基因序列分析发现印度Sullia地区引起槟榔黄化病的槟榔黄化植原体属于16SrXI组植原体株系（JN967909）,与海南槟榔黄化植原体区别明显（图2,表2）。由此可见,槟榔黄化病可以由不同组或亚组的植原体导致,但目前未见2种以上植原体复合侵染引起槟榔黄化病的报道。此外,本研究鉴定的海南槟榔黄化植原体AYL-hnbt、AYL-hntc、AYL- hnwn1、AYL-hnwn2与海南引起苦楝丛枝（KP662119、KP662120）、长春黄花绿变（KP662136）、马松子变叶（KX150461）、辣椒黄化皱缩（MT760793）、细圆藤丛枝（MT872515）、蛇婆子绿变（MW353909）等相关病害的植原体株系聚于一个进化分枝,支持率为100%（图2）。
2.4 发病槟榔不同组织部位植原体检测
在海南保亭、屯昌、万宁采集表现黄化症状的同一株槟榔的不同组织部位进行检测,基于植原体16S rRNA基因序列扩增分析表明：在发病槟榔的叶片、花穗、心叶这3个组织部位中均检测到植原体16S rRNA基因序列目的条带,目的条带约为1200 bp;在发病槟榔的根、茎皮这2个组织部位均未检测到植原体16S rRNA基因序列目的条带;在健康无症状的槟榔叶片、花穗、心叶、茎皮、根等不同组织部位以及去离子水阴性对照中均未检测到植原体16S rRNA基因序列的目的条带（图3）。
3 讨论
本研究对我国海南保亭、屯昌、万宁等地的槟榔黄化植原体检测鉴定表明不同地区槟榔黄化植原体同源性很高甚至一致,本研究中不同槟榔黄化植原体株系间序列相似性为100%,均归类于16SrI组植原体。研究结论与海南前期已报道的槟榔黄化植原体株系为同一组,但存在一定程度的变异。车海彦[4]基于16S rRNA基因在海南屯昌、琼海、定安、万宁、三亚等地均检测到槟榔黄化植原体,通过序列比对和系统发育分析确定其鉴定的槟榔黄化植原体归属于16SrI组;周亚奎等[9]基于16S rRNA基因PCR扩增分析也表明海南槟榔黄化病是由16SrI组槟榔黄化植原体引起的。本研究中来自海南的槟榔黄化植原体与车海彦[4]、周亚奎等[9]检测的海南槟榔黄化植原体的16S rDNA序列同源性极高,分别为99.9%和99.8%。
植原体主要通过寄主种苗、媒介昆虫、菟丝子（Cuscuta chinensis）等传播介体进行长距离或短距离传播。本研究发现海南槟榔黄化植原体与海南苦楝丛枝、长春黄花绿变、马松子丛枝、辣椒黄化皱缩、细圆藤丛枝等植原体[5,6,7]同源性高达100%,相关植原体株系亲缘关系极近,侵染槟榔引起槟榔黄化病的植原体可能侵染苦楝、长春花、马松子（Melochia corchorifolia）等寄主植物引起相关植物丛枝、绿变等症状,即槟榔黄化植原体的传播除了可以通过槟榔种苗、媒介昆虫、菟丝子等载体进行传播,也可能会通过苦楝、辣椒、长春花等植原体寄主植物的运输流通而进行传播扩散。因此,在槟榔黄化病的防控过程中,除了对槟榔种苗、媒介昆虫等进行防控管理外,也应对苦楝、辣椒、长春花等相关植原体寄主植物的运输流通加强检疫管理,从源头上切断病原传播途径,杜绝病害传播扩散。
责任编辑：谢龙莲