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2021 , Vol. 42 >Issue 9: 2717 - 2726

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.038

Agricultural Ecology & Environmental Protection

Diversity Analysis of Fungal in Rhizosphere Soils of Rice under Different Tillage Methods Based on High-throughput Sequencing Technique

  • LAO Chengying ,
  • SHEN Zhangyou ,
  • LI Yanying ,
  • WEI Benhui ,
  • ZHOU Lingzhi ,
  • ZHOU Jia , * ,
  • HU Po ,
  • HUANG Yulan
Expand
  • Cash Crops Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning, Guangxi 530007, China
* ZHOU Jia,E-mail： .

Received date: 2020-07-07

  Revised date: 2020-10-09

  Online published: 2021-11-01

Copyright

Copyright reserved © 2021. Office of Acta Agronomica Sinica All articles published represent the opinions of the authors, and do not reflect the official policy of the Chinese Medical Association or the Editorial Board, unless this is clearly specified.
Fold

Abstract

To study the diversity of the rhizosphere soil fungal communities in rice under different tillage practices, this research was carried out using rotary tillage, no tillage, smash and ridging tillage treatments. The structure and diversity of fungal communities were analyzed using high-throughput sequencing techniques in the rhizosphere soil, and Pearson’s correlation analysis was performed combined with soil environmental factors. Ascomycota, Zygomycota Basidiomycota and Glomeromycota were the dominant phyla, and Fusarium, Mortierella, Pyrenochaetopsis, Zopfiella, Chaetomium, Acremonium, Cryptococcus, Westerdykella, Gaeumannomyces, Metarhizium were the top10 dominant genera in the rice rhizosphere soils of the three tillage treatments. Relative abundance of Zygomycota and Mortierella, Acremonium, Cryptococcus and Gaeumannomyces among the three treatments was significantly different. Alpha diversity index analysis showed no significant differences among the three farming treatments. Principal co-ordinates analysis showed that the distribution characteristics of the soil fungal communities under different tillage treatments were significantly different. Redundancy analysis showed that the variation of the soil fungal communities was 87.46% by the first two ranking axes together among the three tillage treatments. The Pearson’s correlation analysis showed that soil pH was highly significantly positively correlated with the abundance of Zygomycota fungi. While the content of soil available phosphorus, alkaline hydrolytic nitrogen and organic matter was highly significantly negatively correlated with the abundance of Zygomycota fungi. And the content of soil available phosphorus was significantly positively correlated with the abundance of Basidiomycota fungi. In summary, it is shown that the structure and diversity of the rhizosphere soil fungal communities in rice are different under short-term different tillage treatments. The distribution of fungal communities is influenced by soil pH, organic matter, alkaline hydrolytic nitrogen and available phosphorus.

Key words： high-throughput sequencing; tillage methods; rice rhizosphere soil; diversity of fungal community

Cite this article

LAO Chengying , SHEN Zhangyou , LI Yanying , WEI Benhui , ZHOU Lingzhi , ZHOU Jia , HU Po , HUANG Yulan . Diversity Analysis of Fungal in Rhizosphere Soils of Rice under Different Tillage Methods Based on High-throughput Sequencing Technique[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2021 , 42(9) : 2717 -2726 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.038

土壤真菌作为土壤微生物的主要成员之一,其多样性及其生态功能已成为目前国内外土壤微生态领域的研究热点。近年来多种生态系统中植物根际土壤真菌的研究表明,真菌数量、群落组成和功能多样性受不同的土壤类型、耕作方式、种植模式、施肥方式和植被种类等因素影响[1]。因此,研究不同耕作方式下根际土壤真菌的多样性对解释稻田土壤真菌群落的形成和水稻种植方式的选择具有重要意义。土壤耕作是农业生产中的重要技术措施,通过耕作工具对土壤扰动而改变了耕层土壤物理状况,引起土壤水、肥、气、热等变化,间接影响耕层土壤养分、酶活性和微生物区系等化学和生物学特性,改变土壤微生物数量、结构及其多样性[2,3,4,5,6]。长期以来稻田生产上广泛应用浅旋耕（即常规浆耕）的耕作方式,但频繁浆耕会导致稻田土壤犁底层上移、耕层土壤变浅、表面结膜板结、水分渗透能力和通气性变差、耕性变劣、保水保肥性能降低。免耕是20世纪60年代开始实行的播种前不单独进行任何土壤耕作的耕作方式,部分研究认为免耕可保护土壤结构、提高土壤供肥保肥能力[7,8];但也有研究认为短期免耕能改善土壤物理性状,长期少免耕、轻耕等耕作会使土壤物理性质变差,且单一免耕对土壤养分状况改善效果不显著[6,7,8,9]。近些年兴起深松、粉垄等耕作措施能加深耕层土壤厚度,改善土壤结构,扩大土壤库容,为植物生长创造全新的耕层土壤生态环境[2, 6, 10-15]。粉垄耕作是一种新型全耕层深耕深松耕作技术,通过粉垄机械螺旋型钻头垂直入土将耕层土壤横向切割碎土,改变土壤团聚体颗粒组成增加孔隙度[10]、降低土壤容重[11,12,13,14]、增加土壤蓄水量[12,13],改变耕层土壤养分分布[14],提高土壤的保肥蓄水能力[15]、保持多年提高作物产量和养分效率[11, 16-18],但关于粉垄耕作对土壤微生物的影响尚缺乏研究。
至今,关于免耕、翻耕和旋耕等耕作对土壤真菌的影响研究有少量报道,粉垄耕作对土壤真菌的影响研究尚未见报道。因此,本研究以旋耕、免耕和粉垄耕作不同耕作方式处理的水稻根际土壤为研究对象,采用高通量测序技术分析真菌群落结构和多样性,并结合土壤环境因子进行相关性分析,评价短期旋耕、免耕和粉垄耕作下稻田水稻根际土壤真菌群落结构的多样性,以期从微生态学角度为水稻耕作方式的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究在广西南宁市那桐镇大藤村广西农业科学院经济作物研究所试验基地的稻田进行,试验地为多年常规浆耕种植水稻的稻田,但为了能较好地进行免耕处理,实验处理前半年内将试验区进行休耕（即不进行任何耕作和种植作物）。供试土壤为红壤,耕作处理前,采用“S”取样法分别采集旋耕、免耕和粉垄耕作处理的各3个小区的地块内0~15 cm土层土壤,其基本理化性质为：pH为旋耕5.98~6.26、免耕5.94~6.28、粉垄5.96~6.28;有机质含量旋耕为26.15~27.94 g/kg、免耕25.70~27.54 g/kg、粉垄25.26~27.68 g/kg;全氮旋耕1.38~1.52 g/kg、免耕1.34~1.58 g/kg、粉垄1.36~1.62 g/kg;全磷旋耕0.86~0.92 g/kg、免耕0.86~0.94 g/kg、粉垄0.81~0.90 g/kg;全钾旋耕12.58~14.48 g/kg、免耕12.84~14.38 g/kg、粉垄13.02~14.56 g/kg;速效氮旋耕70.91~ 72.06 mg/kg、免耕70.82~72.84 mg/kg、粉垄70.74~ 72.96 mg/kg;速效磷旋耕46.74~49.22 mg/kg、免耕47.24~ 49.28 mg/kg、粉垄46.22~49.42 mg/kg;速效钾旋耕174.53~187.87 mg/kg、免耕174.96~ 185.96 mg/kg、粉垄175.82~187.35 mg/kg。各试验处理点土壤养分指标均无显著性差异。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 共设置旋耕、免耕和粉垄3种不同耕作方式的处理。旋耕（常规浆耕）处理,在秧苗移栽前1 d使用传统拖拉机将灌水后的稻田进行耕作深度约15 cm的浆耕;免耕处理,稻田除秧苗移栽前1 d灌水软土外不单独进行任何土壤耕作;粉垄处理,在稻田干水时,利用专用粉垄机械（广西五丰机械有限公司生产的自走式粉垄机）的垂直螺旋型钻头刀片对0~28 cm耕层土壤进行快速横向切割碎土的整地耕作,在秧苗移栽的前1 d回水至保留水层约5 cm。本研究采用田间小区试验（面积约30 m2）,各小区四周利用塑料隔板（隔板宽42 cm、插入田面以下深约30 cm）进行分隔,随机区组排列,重复3次。供试水稻品种为‘H两优991’（广西兆和种业有限公司）采用塑盘浆播育秧,三叶一心时抛秧,抛栽密度为30万蔸/hm2。施肥采用田面撒施方式,化肥施用量以常规施氮量为N 225.0 kg/hm2,氮、磷、钾（N:P2O5:K2O）配比为1:0.5:1.2,在移栽前施基肥,抛秧后7、12 d及幼穗分化前7 d施3次追肥。水稻生育期内实行水分干湿交替管理。不同耕作方式处理除种植前的整地方式不同外,其他田间管理措施均保持一致。
1.2.2 土壤样品的采集 水稻根际土壤样品取样方法参照刘波等[19]“抖根法”,在耕作处理后第一季水稻成熟期分别采集旋耕、免耕和粉垄耕作种植的水稻根际土壤分成2份带回实验室,一份土样存放于-80 ℃用于土壤真菌群落结构多样性分析,另一份土样置于通风处晾干用于pH、有机质和速效养分测定,各处理均设置3次生物学重复。
1.2.3 土壤基因组DNA提取、文库构建和高通量测序 不同处理水稻根际土壤样本中基因组 DNA提取采用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒（德国QIAGEN）,提取方法按照试剂盒说明书进行,使用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA质量合格后送样给微基生物科技（上海）有限公司,进行miseq文库制备和高通量测序分析。采用两步PCR扩增的方法构建文库,将纯化的DNA作为模板,使用特异引物ITS1F （5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA A-3'）和ITS1R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATG C-3'）扩增真菌ITS1基因[20],扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段,并利用凝胶回收试剂盒（AxyPrep DNA）回收纯化目的片段,将回收产物作为模板进行二次PCR扩增时将illumina平台测序所需的接头barcode添加到目的片段的两端,再次凝胶回收全部PCR产物;采用FTC-3000TM real-time PCR仪对回收产物进行定量检测,均一化混匀后完成文库制备。按照测序要求使用NGS Illumina MiSeq 2 x 300 bp平台进行上样测序。
1.2.4 生物信息学分析 对Miseq测序结果序列进行质控、过滤和拼接,得到优化序列。利用USEARCH软件将优化序列在97%相似度下进行聚类,得到各样品OTU代表序列。利用mothur（Version 1.33.3）进行Alpha多样性分析（Chao、Ace等物种丰富度统计,Shannon、Simpson等物种多样性统计）、Venn图绘制,Beta多样性分析（PCoA分析）。运用USEARCH和mothur软件将 OTU代表序列与Silva 128数据库进行物种分类学分析。采用R语言的Vegan软件对土壤优势真菌门群落和土壤环境因子进行冗余分析。
1.2.5 土壤环境因子测定 采用酸度计法（土水比为1:2.5）测定pH,采用重铬酸钾容量法测定有机质,采用碱解扩散法测定碱解氮,采用NH4F/HCl浸提钼锑抗比色法测定速效磷,采用醋酸铵浸提火焰光度法测定速效钾[21]。

1.3 数据处理

使用Excel 2019软件整理土壤环境因子试验数据,运用SPSS 22.0软件进行土壤环境因子和真菌相对丰度数据的方差分析（ANOVA）显著性检验,以及真菌群落与土壤环境因子间的Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 土壤真菌群落高通量文库评价

从旋耕、免耕和粉垄处理的9个样品采用Illumina MiSeq高通量测序后共获得491 814条有效序列,经对原始数据进行整理、去噪、去除嵌合体和非真菌序列后,共获得394 764条优化序列（旋耕、免耕和粉垄处理分别为45 071条、42 393条和44 123条）,优质序列主要集中在225~350 nt,各处理样品文库覆盖率均达到99.96%以上,在97%相似度下共获得1 074个OTU。表明测序数据量合理,可以反映出样品中的物种组成特征,更深的测序几乎不会产生更多新的 OTU,所构建的文库能够较好地反映土壤真菌群落结构情况,可用于后续分析。

2.2 土壤真菌群落Alpha多样性分析

通过对不同耕作处理的水稻根际土壤真菌群落丰富度指数（Chao指数和Ace指数）和群落多样性的指数（Shannon指数和Simpson指数）分析表明,Chao指数和Shannon指数是粉垄大于旋耕和免耕,Ace指数是免耕大于旋耕和粉垄,Simpson指数粉垄小于旋耕和免耕,但在不同耕作方式处理间均无显著性差异（表1）。
表1 不同耕作处理对水稻根际土壤真菌Alpha多样性指数的影响

Tab. 1 Effects of different tillage treatments on the Alpha diversity index of fungal communities in rice rhizosphere soils

处理
Treatments		 Chao 指数
Chao index		 Ace指数
Ace index		 Shannon指数
Shannon index		 Simpson 指数
Simpson index		 文库覆盖率
Coverage/%
旋耕 289±16.80a 288±13.65a 4.240±0.17a 0.044±0.019a 99.96±0.002a
免耕 289±23.44a 321.67±37.95a 4.213±0.29a 0.047±0.018a 99.96±0.009a
粉垄 332±33.72a 284.33±24.13a 4.327±0.06a 0.033±0.004a 99.96±0.008a

注：相同小写字母表示差异不显著（P>0.05）。

Note: The same lowercase letters indicate no significant difference.

2.3 不同耕作处理OTU分布分析

经对有效序列进行质控、拼接和优化,通过RDP 数据库的注释以及在97%的相似水平下的OTU 进行生物信息统计分析,在旋耕、免耕和粉垄水稻根际土壤中分别获得535、612和547个真菌OTU。Venn图可以直观地表现土壤真菌群落的OTU数目组成相似性、重叠情况以及特异性。通过Miseq测序,旋耕、免耕和粉垄3个不同处理下根际土壤真菌的OTUs-Venn图表明,9个样品共获得1074个真菌OTUs,旋耕、免耕和粉垄共有OTUs数量为204,只占OTUs总数的18.99%;特有的OTUs数量分别为188、260和210,分别占17.50%、24.21%和19.55%;旋耕和免耕共有的OTUs数量为79,旋耕和粉垄共有的 OTUs数量为64,免耕和粉垄共有的OTUs数量为69（图1）。说明旋耕、免耕和粉垄等3个处理栽培的水稻根际土壤中真菌多样性存在差异且各自都有其独特的OTUs,群落结构也较复杂。对OTU从门到种依次进行分类,总共获得真菌群落7门、23纲、55目、90科、124属、116种。
图1 旋耕、免耕和粉垄处理的水稻根际土壤真菌OTU分布Venn图

Venn 图中不同颜色代表不同的处理,圆圈重叠区域标注的数字代表几个样品重复的OTU个数。XG表示旋耕,MG表示免耕,FL表示粉垄栽培。

Fig. 1 OTUs-Venn graph of fungi in rice rhizosphere soils by rotary tillage, no tillage and smash and ridging tillage

In the Venn plots different colors represent different treatments, and the numbers in the overlapping areas of the circles represent the number of OTUs repeated for several samples. XG indicated rotary tillage, MG indicated no tillage and FL indicated smash and ridging tillage.

2.4 不同耕作处理下的土壤真菌群落Beta多样性分析

为了解不同耕作方式处理的水稻根际土壤真菌群落组成,在OTU水平上对样本的土壤真菌群落进行基于unweighted UniFrac距离算法的主坐标分析（PCoA）,研究不同耕作处理下水稻根际土壤真菌Beta多样性差异。PCoA分析结果显示,相同耕作处理的水稻根际土壤真菌群落聚在一起,不同耕作处理分布在不同象限内能明显分开, 说明不同耕作处理下的水稻根际土壤真菌群落存在明显差异（图2）。在土壤真菌群落中PC1的贡献率为24.80%,旋耕和免耕处理受PC1影响较大;PC2的贡献率为22.74%,免耕和粉垄处理受PC2影响较大。结果表明,耕作方式能够影响水稻根际土壤真菌群落组成。
图2 OTUs水平的不同处理水稻根际土壤真菌的PCoA分析

Fig. 2 Principal co-ordinates analysis of soil fungal community structure in different treatments of rice rhizosphere soil at OTUs level

2.5 真菌群落分布特征分析

2.5.1 水稻根际真菌群落在门水平上的组成和群落结构多样性差异 利用Illumina MiSeq高通量测序技术对土壤真菌群落多样性进行分析。测定结果显示,旋耕、免耕和粉垄处理水稻根际土壤微生物真菌群落共检测到7个门类。从门的分类水平看,旋耕、免耕和粉垄处理水稻根际土壤微生物真菌群落组成多样性丰富,主要含有子囊菌门（Ascomycota）、接合菌门（Zygomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）和壶菌门（Chytridiomycota）5个已知菌门和2个分类地位未鉴定菌门,5个已知菌门相对丰度在旋耕、免耕和粉垄处理中分别占比39.04%、45.76%和58.24%（图3）。其中,第一优势菌门子囊菌门相对丰度在旋耕、免耕和粉垄处理分别占比32.19%、39.27%和42.61%;第二优势菌门接合菌门相对丰度在旋耕、免耕和粉垄分别为3.62%、3.80%和13.83%。此外,壶菌门只在旋耕处理中检测到,而在免耕和粉垄处理的水稻根际土壤中未检测到,说明在门的分类水平上,旋耕、免耕和粉垄栽培水稻根际土壤真菌群落组成多样性存在差异。物种差异分析显示,在菌门分类水平上,3种不同耕作处理间的接合菌门相对丰度差异极显著,粉垄（13.83%）处理中显著高于免耕（3.80%）和旋耕（3.62%）分别提高了2.64倍和2.82倍（图4）。结果表明,在菌门水平上,3种耕作处理中粉垄处理显著增加了水稻根际土壤真菌群落多样性。
图3 旋耕、免耕和粉垄栽培水稻根际土壤真菌菌门物种群落组成多样性分析

Fig. 3 Diversity analysis of fungal community composition at phylum level in rice rhizosphere soils under rotation tillage (XG), no tillage (MG) and smash and ridging tillage (FL)

图4 旋耕、免耕和粉垄栽培水稻根际土壤接合菌门相对丰度差异分析

MG：免耕栽培;FL：粉垄栽培;XG：旋耕栽培;**表示样本间的差异显著（P<0.01）。

Fig. 4 Analysis on the relative abundance differences of Zygomycota fungi of rice rhizosphere soil under rotation tillage (XG), no tillage (MG) and smash and ridging tillage (FL)

MG: No-till; FL: Smash and ridging tillage; XG: Rotary tillage.** indicates the significant difference among the treatments(P<0.01).

2.5.2 水稻根际真菌群落在属水平上的组成和群落结构多样性差异 在属的分类水平上对真菌群落组成和相对丰富度进行分析,旋耕、免耕和粉垄栽培水稻根际土壤真菌群落共检测到124个属,3个处理间真菌群落组成属水平多样性比较丰富且差异较大（图5）。其中,Top10的优势菌属为镰刀菌属（Fusarium）、被孢霉属（Mortierella）、Pyrenochaetopsis、柄孢壳属（Zopfiella）、毛壳菌属（Chaetomium）、支顶孢属（Acremonium）、隐球菌属（Cryptococcus）、Westerdykella、顶囊壳属（Gaeumannomyces）、绿僵菌属（Metarhizium）,在旋耕、免耕和粉垄处理分别占比20.10%、23.60%和34.39%。物种群落组成多样性分析显示,被孢霉属（Mortierella）、支顶孢属（Acremonium）、隐球菌属（Cryptococcus）、顶囊壳属（Gaeumannomyces）4个优势菌属在3个处理间存在显著或极显著差异（图6）。被孢霉属的相对丰度分别为旋耕（3.62%）、免耕（3.76%）和粉垄（13.83%）,粉垄处理极显著大于旋耕和免耕处理;支顶孢属的相对丰度分别为旋耕（1.55%）、免耕（0.81%）和粉垄（2.66%）,粉垄>旋耕>免耕,三者间差异显著;隐球菌属的相对丰度分别为旋耕（1.25%）、免耕（0.49%）和粉垄（0.36%）,旋耕处理显著高于粉垄和免耕处理;顶囊壳属的相对丰度分别为旋耕（1.24%）、免耕（0.13%）和粉垄（0.20%）,旋耕处理极显著高于粉垄和免耕处理;Stilbella为旋耕处理特有菌属。结果说明,不同耕作处理改变了水稻根际土壤真菌属水平的群落结构分布,粉垄耕作对提高真菌属群落丰度影响最大。
图5 旋耕、免耕和粉垄栽培水稻根际土壤真菌属水平物种群落组成多样性分析

XG表示旋耕,MG表示免耕,FL表示粉垄栽培。

Fig. 5 Diversity analysis of fungal community composition at genus level in rice rhizosphere soils under rotary tillage, no tillage and smash and ridging tillage

XG indicated rotary tillage, MG indicated no tillage and FL indicated smash and ridging tillage.

图6 旋耕、免耕和粉垄栽培水稻根际土壤优势真菌属水平物种相对丰度差异分析

XG表示旋耕,MG表示免耕,FL表示粉垄栽培。同一菌属图柱上不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）

Fig. 6 Analysis on the relative abundance differences of dominant fungi at genus level of rice rhizosphere soils under rotary tillage, no tillage and smash and ridging tillage

XG indicated rotary tillage, MG indicated no tillage and FL indicated smash and ridging tillage. 同一菌门图柱上不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）

2.6 不同耕作处理下的土壤真菌群落与土壤环境因子的关系

为了明确3种栽培方式对水稻根际土壤环境因子的影响,分析了不同处理下水稻根际土壤pH、有机质、碱解氮、速效磷和速效钾。结果如图7所示,土壤pH变化范围在4.48~4.95,偏酸性,粉垄处理显著高于旋耕和免耕,分别增加9.51%和10.49%;旋耕和免耕处理的土壤有机质含量显著大于粉垄处理,分别增加18.15%和19.29%;对于土壤碱解氮含量,旋耕和免耕处理显著大于粉垄,分别增加16.20%和22.35%;旋耕处理的土壤速效磷含量显著大于免耕和粉垄处理,分别增加15.32%和95.35%;免耕处理的土壤速效钾含量显著大于旋耕和粉垄处理,分别增加43.95%和15.70%。结果说明,不同耕作方式下水稻根际土壤理化性质有显著改变。
图7 不同耕作方式对水稻根际土土壤环境因子的影响

不同小写字母表示不同耕作处理下水稻根际土壤相应指标差异显著（P<0.05）。

Fig. 7 Effects of tillage practices on physical and chemical properties of the rice rhizosphere soils

Different lowercase letters indicate significant differences among the different tillage treatments (P<0.05).

为了明确不同处理下土壤环境因子pH、有机质、碱解氮、速效磷和速效钾对真菌群落分布的影响,将土壤理化因子与真菌门群落进行冗余分析（RDA）,结果显示,第一排序轴（RDA1）解释了真菌群落变化的69.67%,第二排序轴解释了真菌群落变化的17.79%,前2个排序轴总共解释了87.46%的群落变化（图8）。除土壤pH与RDA1呈正相关外,其余土壤环境因子与RDA1都呈负相关;除土壤速效钾与RDA2呈正相关外,其余土壤环境因子与RDA2都呈负相关。
图8 基于门水平下不同处理水稻根际土壤理化性质与真菌群落的冗余分析

图中不同绿色圆点（MG）、红色正方形（FL）和蓝色三角形（XG）为样本组;黑色箭头代表物种;红色箭头表示环境影响因子,箭头的长短可以代表环境因子对于物种数据的影响程度。

Fig. 8 Redundancy analysis based on soil fungal community at phylum level and physiochemical characteristics of rice rhizosphere soils

In the figure, the green dots (MG), red square (FL)和blue triangle (XG) are the sample groups; and the black arrow represents the species, while the red arrow represents the environmental impact factors; and the length of the arrow can represent the impact of environmental factors on the species data.

为进一步明确3种耕作方式处理的水稻根际土壤真菌群落与土壤理化性质的相关性,对真菌门菌群与土壤理化因子间进行Pearson相关分析,结果表明6个菌群中有3个菌门与土壤理化性质有显著相关（表2）。子囊菌门、球囊菌门和壶菌门群落受土壤因子影响较小,与土壤因子相关性差异不显著。土壤速效磷与接合菌门真菌丰度呈极显著负相关关系,与担子菌门真菌丰度呈显著正相关关系;土壤碱解氮与接合菌门真菌丰度呈极显著负相关关系;土壤pH与接合菌门真菌丰度呈极显著正相关关系,与未分类真菌门丰度呈显著负相关关系;土壤有机质与接合菌门真菌丰度呈极显著负相关关系;土壤速效钾对不同耕作方式下水稻根际土壤真菌群落分布无显著影响。说明土壤真菌群落结构对土壤pH、有机质、碱解氮和速效磷环境因子有响应,其中接合菌门受土壤环境因子影响最大。
表2 不同耕作处理土壤真菌主要菌群与土壤理化性质的Pearson相关性分析

Tab. 2 Pearson’s correlation analysis between the predominant flora of soil fungi and soil physicochemical properties under different tillage treatments

真菌门
Fungal phylum		 pH 有机质
Organic matter		 碱解氮
Alkaline hydrolytic nitrogen		 速效磷
Available phosphorus		 速效钾
Available potassium
子囊菌门Ascomycota 0.396 -0.585 -0.371 -0.610 0.509
接合菌门Zygomycota 0.814** -0.915** -0.863** -0.897** 0.027
担子菌门Basidiomycota -0.452 0.589 0.411 0.717* -0.294
球囊菌门Glomeromycota -0.272 -0.071 0.385 0.108 -0.048
壶菌门Chytridiomycota -0.343 0.198 0.172 0.443 -0.594
未分类菌门unclassified -0.722* 0.364 0.629 0.545 -0.119

注：*表示显著相关（P<0.05）,**表示极显著相关（P<0.01）。

Note: * indicates the significant correlation (P<0.05), ** indicates the very significant correlation (P<0.01).

3 讨论

土壤的特性差异会对土壤真菌种类及组成有一定影响。其中土壤pH能够直接或间接影响真菌群落结构及多样性[22],本研究中从3种耕作方式的土壤营养指标变化分析,土壤pH、碱解氮和有机质在旋耕和免耕处理间均无显著差异,而二者与粉垄处理间差异显著。粉垄处理的土壤pH显著高于旋耕和免耕处理,土壤有机质和碱解氮显著低于旋耕和免耕处理。菌群群落结构分析也发现,粉垄处理中接合菌门及其被孢霉属菌群约占13.83%,旋耕和免耕处理中分别约为3.62%和3.80%。同时Pearson相关性分析也显示,接合菌门菌群与土壤pH呈极显著正相关,而与土壤碱解氮、有机质和速效磷呈极显著负相关,速效钾对其影响很小。说明一季短期3种不同耕作方式处理主要是改变了土壤pH、碱解氮和有机质的养分条件而引起水稻根际土壤真菌群落的改变,其中短期粉垄耕作对水稻根际土壤养分和真菌群落的影响最大。
接合菌门被孢霉属是土壤习居菌,是一种具有较强分解纤维素能力的真菌。Puget等[23]研究发现,接合菌门中的毛霉属、根霉属和被孢霉属等真菌能分解土壤中的简单糖类和纤维素等物质。Goto等[24]研究表明,接合菌门的被孢霉属是对土壤有益的微生物。段倩倩等[25]对石漠化生态桑林根际土壤微生物资源多样性研究发现,优势真菌中接合菌门被孢霉属为土壤有益微生物,且其具有溶解土壤中磷的功能。李发虎等[26]研究发现,生物炭可显著提高黄瓜根际土壤中真菌子囊菌门和接合菌门丰度,且黄瓜根系体积与被孢霉科比例显著正相关。陈力力等[27]对水稻-油菜双序列复种免耕、翻耕土壤真菌多样性的研究显示,免耕样品被孢霉科相对丰度比翻耕样品的大3~5倍。粉垄栽培的水稻根际土壤中接合菌门被孢霉属相对丰度极显著高于旋耕和免耕处理,说明短期粉垄耕作比免耕和旋耕更有利于接合菌门被孢霉属真菌生长繁殖。
土壤微生物群落的Alpha多样性指数评价微生物群落丰富度和多样性,一般认为较高的多样性指数即具有较高的微生物丰富度和多样性[28]。部分学者认为,与常规旋耕或翻耕相比,免耕可以提高土壤真菌群落结构丰富度和多样性指数[29,30,31,32],但也有研究表明免耕和常规耕作处理间微生物多样性和丰富度指数无显著性差异[33,34,35,36]。本研究中,不同耕作方式间水稻根际土壤真菌群落Alpha多样性指数差异不显著,这与Kuntz等[33]、李丽娜等[34]、王小玲等[35]和沈吉成等[36]的研究结果相似。土壤真菌作为重要的生物指示因子对土壤环境变化具有一定的抵抗和恢复能力[1]。研究结果的差异可能与耕作方式的处理年限有关,土壤微生物丰富度和多样性水平的改变需要经过一段周期。本研究在一季短期耕作处理下,土壤真菌的不同类型微生物群落间的丰富度增加与降低相互抵消[37]而差异不明显。
土壤真菌是土壤微生物的重要成员,推动着土壤生态系统能量流动和物质循环,在土壤中发挥着重要的调控养分转化与分解作用[38]。王小玲等[35]研究表明,在宁夏南部山区免耕覆盖及有机肥施用处理的冬小麦农田中子囊菌门和担子菌门为优势菌门。沈吉成等[36]研究表明,陇中旱农区免耕秸秆覆盖和传统耕作的麦豆轮作系统中子囊菌门和担子菌门为主要优势种群,且其丰度在免耕处理比传统耕作中分别提高3.67%和1.86%。代红翠等[39]研究华北平原地区不同耕作和秸秆还田下褐土真菌群落,结果也表明子囊菌门和担子菌门为优势菌群。陈力力等[27]研究表明,在水稻-油菜双序列复种免耕、翻耕稻田土壤真菌中前三位优势菌群为子囊菌门、接合菌门和担子菌门。Frey等[40]研究认为,土壤中植物残体的分解和有机质的降解过程中子囊菌门和接合菌门真菌起重要作用,而担子菌门有较强分解木质纤维素的能力。本研究不同耕作方式下水稻根际土壤真菌群落组成结果与陈力力等[27]的研究结果相似,主要优势类群依次为子囊菌门、接合菌门和担子菌门。因此,说明在多种生态系统中子囊菌门、接合菌门和担子菌门都作为优势菌群参与养分的循环利用。
Hazard等[41]研究显示,土壤环境因子（如有机质等）对土壤真菌群落结构有重要影响。韩世忠等[42]研究表明土壤pH也是影响真菌群落结构组成的重要环境因子,对土壤真菌的生长繁殖具有显著影响。代红翠等[39]研究不同耕作和秸秆还田下褐土真菌群落变化认为土壤有机碳和碱解氮的改变是影响真菌群落组成的主要因素。周玉杰等[43]研究结果表明,橡胶林的土壤真菌多样性与土壤养分含量密切相关,接合菌门与全磷和有机质含量呈负相关,担子菌门与碱解氮、全氮、全钾和有机质含量呈负相关。本研究中相关性分析也表明接合菌门相对丰度与土壤pH呈极显著正相关关系,与土壤速效磷、碱解氮和有机质呈极显著负相关关系,这与前人研究表明土壤养分是影响土壤真菌群落分布的重要因素的结果相似。说明与短期常规浆耕和免耕栽培相比,短期粉垄耕作可能通过改变土壤环境因子而引起土壤真菌群落变化。
综上,本研究结果表明,与常规浆耕和免耕栽培相比,短期粉垄耕作后水稻根际土壤优势真菌菌群结构组成变化较小,但优势菌门和菌属群落丰富度显著增加,尤其是接合菌门被孢霉属相对丰度显著增加;土壤环境因子中土壤pH、碱解氮、速效磷和有机质含量的改变是影响真菌群落组成的主要因素。研究结果可为解析不同耕作方式对水稻根际土壤真菌群落形成提供理论依据。

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