辣椒（Capsicum annuum L.）原产于中南美洲墨西哥地区,15世纪末哥伦布发现美洲后传入欧洲,随后传播到世界各国[1]。近年来,随着国民经济的发展,人们对辣椒的消费需求迅速增加,世界各国的辣椒生产规模和总产量也相应扩大[2]。明末清初时期（16世纪末）辣椒传入中国,最初用作观赏植物或药物,随后成为常见的蔬菜和香辛料,种植范围也扩大到几乎所有的农耕区。目前中国辣椒种植面积约200万hm2,占全世界辣椒种植面积的40%及国内蔬菜面积的12%以上[3],年产量约2800万t,占世界辣椒总产量的46%,年产值700多亿元,占世界蔬菜总产值的16.67%,辣椒产业已成为我国最大的蔬菜产业[4]。
海南位于我国最南端,地处热带北缘,素有“天然大温室”的美称,是比较适宜辣椒种植的地区之一。近年来,海南辣椒产业发展迅猛,已成为当地第一大冬种蔬菜[5]。辣椒喜温喜光,栽培中常受到病虫害的危害,其中炭疽病、疮痂病、细菌性叶斑病等为海南地区常见的叶部病害。在对海南地区辣椒病害的调查中,笔者发现线椒叶片上出现一种新的叶斑病,其典型症状为受叶脉限制、有黑褐色晕圈的褐色长条型病斑。该病在海南省文昌市的多个田块发生,发生范围有不断扩大的趋势。本研究在田间采集典型病样,开展病原菌的分离鉴定、生物学特性研究及室内药剂筛选等工作,为进一步开展相关防控技术的研发提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试病样和辣椒品种 辣椒叶斑病病样采自海南省文昌市潭牛镇。供试辣椒（线椒）品种为‘琼辣三号’,由海南省农业科学院提供。
1.1.2 供试培养基和试剂 真菌菌株培养采用PDA、PSA、CMA、OA、MEA、CA等培养基,大肠杆菌培养采用LB培养基,配方参见《植病研究方法》[6]。
DNA片段胶回收试剂盒和pMD19-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司;Taq酶和dNTP购自天根生化科技（北京）有限公司;引物ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4: 5′-TC CTCCGCTTATTGATATGC-3′;ef-1f2: 5′-GCGCCA TTCTCATCATTGCC-3′和ef-1r2: 5′-GGAGGGTA GTCAGTGAAAGC-3′由生工生物工程（上海）有限公司合成;大肠杆菌JM109感受态细胞购自北京全氏金生物技术有限公司;其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 供试杀菌剂 供试杀菌剂共12种,其中,可湿性粉剂（WP）共10种,水分散粒剂（WG）1种,水乳剂（EW）1种,种类及其浓度见表1。
表1 供试杀菌剂的种类及浓度Tab. 1 Type and concentration of the tested fungicide |
| 杀菌剂Fungicide | 厂家Manufacturer | 浓度Concentration/(mg·L-1) |
|---|---|---|
| 25%三唑酮WP | 山东荣邦化工有限公司 | 0.1、1、10、100、1000 |
| 65%代森锌WP | 上海慧光环境科技有限公司 | 0.1、1、10、100、1000 |
| 10%多抗霉素B WP | 乳山韩威生物科技有限公司 | 0.1、1、10、100、1000 |
| 70%甲基硫菌灵WP | 江苏龙灯化学有限公司分装 | 1、10、100、1000、8000 |
| 8%噁霜灵56%代森锰锌WP | 先正达苏州作物保护有限公司 | 0.5、1、2、4、10 |
| 16%乙霉威10%嘧霉胺WP | 青岛恒丰作物科学有限公司 | 0.01、0.1、1、10、100 |
| 64%代森锰锌8%霜脲氰WP | 上海杜邦农化有限公司 | 1、2、5、10、100 |
| 80%多菌灵WP | 上海悦联化工有限公司 | 100、1000、2000、5000、8000 |
| 45%咪鲜胺EW | 浙江天丰生物科学有限公司 | 0.0005、0.001、0.01、0.1、1 |
| 6%春雷霉素WP | 华北制药河北华诺有限 | 10、100、1000、2000、5000 |
| 80%代森锰锌WP | 美国陶氏益农中国有限公司 | 0.1、1、2、4、6 |
| 3%中生菌素WP | 河北中保绿农作物科技有限公司 | 200、400、600、800、1000 |
1.2 方法
1.2.1 病菌的分离和致病性鉴定 （1）病原菌的分离。从田间采集典型病样带回实验室,参照《植病研究方法》[6]进行病原菌的分离、纯化和保存。
（2）辣椒叶斑病病原菌的致病性测定。采用常规方法种植辣椒2个月后,制备浓度为105个/mL的病原菌分生孢子液对叶片进行喷雾接种。保湿培养72 h,随后继续培养至发病。从发病部位重新分离病原菌,观察菌落特征以及分生孢子形状,与最初分离且接种发病的菌株进行比较,确认分离物的致病性。
1.2.2 病原菌的鉴定 （1）病原菌的形态观察。参照时涛等[7]的方法进行病原菌菌落形态、分生孢子等结构的观察和测量。
（2）辣椒叶斑病病原菌rDNA ITS和EF1a序列分析。利用CTAB法对纯化的菌株进行DNA提取,参照White等[8]的方法利用引物对ITS1/ITS4以及根据弯孢属菌株转录延伸因子EF1a部分基因序列设计引物对ef-1f2/ef-1r2进行PCR扩增。扩增产物纯化、克隆后送深圳华大基因科技有限公司进行序列测定。
1.2.4 杀菌剂室内药剂筛选 将所获病原菌在PDA平板上培养一周,用无菌打孔器打取直径7 mm的菌饼备用。采用含毒介质法[11]配制带毒培养基。称取表1中的杀菌剂适量,并计算有效成份含量,WP类加入适量无菌水,EW类加入适量丙酮,制备一定浓度的母液,充分溶解后备用。用系列浓度稀释法制备表1中各杀菌剂处理浓度100倍的母液1 mL,加入灭菌后冷却至约50 ℃的99 mL PDA培养基中,充分混匀后均匀倒入5个培养皿中制备带毒平板,分别用1 mL无菌水（WP类）或丙酮（EW类）作为对照。待培养基凝固后,接种菌饼,于28 ℃培养5 d。用十字交叉法测量菌落直径,每个浓度重复3次,取平均值进行回归分析,按照以下公式计算抑菌率：
抑菌率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×对照菌落%。
1.3 数据处理
用Excel 2010软件处理试验数据,用SAS 9.1.3 Portable统计软件对数据进行统计分析,采用Ducan新复极差法进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 辣椒新叶斑病调查及病原菌分离
2015年12月,笔者在海南省文昌市潭牛镇的调查中发现当地部分辣椒田发生一种新的叶斑病。2016—2019年的调查中,在文昌市潭牛镇、迈号镇等地均发现了该病害。该病在苗期即可发生,受害叶片最初出现小的圆形、水浸状褪绿,随后扩大并变为灰色,潮湿的天气条件下病斑在叶脉间进一步扩展成周围有黑褐色圆晕、黄褐色、不规则的长条形病斑（图1A）,受害叶片最终变枯黄并提前脱落。通常植株上部嫩叶先发病,随后向中部和下部叶片扩散,重病植株所有叶片脱落并死亡。
田间采集典型病样后对其进行病原菌的分离和纯化,获得1株病原菌,人工接种辣椒叶片后形成与田间症状相似的黄褐色病斑（图1B）。从接种后病斑上重新分离获得的培养性状、分生孢子形态均与所获菌株一致,表明所获菌株为该病的致病菌,命名为CU.CAHN2。
2.2 辣椒新叶斑病病原菌鉴定
显微观察结果表明,该菌株和张天宇等[12]的描述一致,为新月弯孢[Curvularia lunata (Wakker) Boedijin],属于半知菌类（Fungi imperfestrainrti）、丝孢纲（Hyphomycetes）、从梗孢目（Moniliales）、暗梗孢科（Dematiaceae）、多孢亚科（Phragmosporoideae）的弯孢属（Curvularia Boedijn）。
2.2.2 病原菌的rDNA ITS序列及EF序列分析 提取菌株基因组DNA后,分别用引物对ITS1/ ITS4和ef-1f2/ef-1r2扩增得到大小约0.6 kb和0.9 kb的扩增产物,分别回收克隆、测序后,获得558 nt和881 nt的序列。序列已登录GenBank数据库,登录号分别为No. KY971620和No. MF422530,通过比对结果表明,这2个序列均与新月弯孢的序列完全一致（No. KY077531.1,No. KX100866.1）。
2.3 病原菌生物学特性研究
菌株CU.CAHN2在供试的6种培养基上均能生长,其中CMA培养基上菌落生长速率最快,为1.55 cm/d（图4）。最适碳、氮源分别为麦芽糖（1.06 cm/d,图5A）和牛肉浸膏（1.41 cm/d,图6A）。CU.CAHN2菌落生长温度为10~37 ℃（1.00~1.50 cm/d）,最适温度为30 ℃（1.50 cm/d）,而在低温4 ℃及以下,40 ℃及以上菌落均不能生长（图7A）。菌落在pH 4~12均能生长,生长的最适pH为7（1.34 cm/d,图7B）。光照有利于菌株的生长,连续光照和光暗交替处理之间差异不显著,且均优于连续黑暗（图7C）。孢子在5~45 ℃范围内均能萌发,22~33 ℃处理下萌发率均较高（≥59.68%）,且优于其他温度（图8A）,孢子致死温度为60 ℃,10 min（图8B）。
图5 碳源对菌落生长的影响A：麦芽糖;B：D-葡萄糖;C：蔗糖;D：乳糖;E：D-果糖;F：D-木糖;G：D-山梨醇;H：无碳培养基。 Fig. 5 Effect of carbon source on colony growth A: Maltose; B: D-Glucose; C: Sucrose; D: Lactose; E: D-Fructose; F: D-xylose; G: D-Sorbitol; H: Carbon-free. |
图6 氮源对菌落生长的影响A：牛肉浸膏;B：酵母浸膏;C：硝酸钠;D：胰蛋白胨;E：硫酸铵;F：硝酸铵;G：无氮源培养基。 Fig. 6 Effect of nitrogen source on colony growth A: Beef extract; B: Yeast extract; C: Sodium nitrate; D: Tryptone; E: Ammonium sulfate; F: Ammonium nitrate; G: Nitrogen-free medium. |
图7 菌株CU.CAHN2在不同处理条件下的菌落生长速率不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 Fig. 7 Colony growth rate of CU.CAHN2 under different treatment conditions Different small letters indicate significant difference (P<0.05). |
2.4 室内药剂毒力测定
从表2可以看出,45%咪鲜胺EW的抑菌作用最好,浓度为1.0 mg/L时抑菌率达97.8%,其次为16%乙霉威·10%嘧霉胺WP,浓度为100 mg/L时抑菌率达95.4%。65%代森锌WP、25%三唑酮WP和80%代森锰锌WP也有较好的抑菌效果,65%代森锌WP和25%三唑酮WP在浓度为100 mg/L时抑菌率分别达68.6%和84.0%,而80%代森锰锌WP在浓度为6 mg/L时抑菌率达52.5%。8%噁霜灵·56%代森锰锌WP和64%代森锰锌·8%霜脲氰WP也有一定抑菌作用,3%中生菌素WP、6%春雷霉素WP和10%多抗霉素B WP的抑菌效果很差,而70%甲基硫菌灵WP和80%多菌灵WP几乎无抑菌作用,在可溶解浓度8000 mg/L时,抑菌率≤48.9%。
表2 12种杀菌剂对菌株CU.CAHN2的抑制作用Tab. 2 Inhibitory action of 12 fungicides to CU.CAHN2 |
| 杀菌剂 Fungicides | 浓度 Concentration/(mg·L-1) | 抑菌率 Inhibition/% | 杀菌剂 Fungicides | 浓度 Concentration/(mg·L-1) | 抑菌率 Inhibition/% |
|---|---|---|---|---|---|
| 25%三唑酮WP | 0.1 | 29.7 | 6%春雷霉素WP | 10 | 0 |
| 1 | 37.4 | 100 | 1.4 | ||
| 10 | 42.5 | 1000 | 14.3 | ||
| 100 | 68.6 | 2000 | 28.7 | ||
| 1000 | 86.8 | 5000 | 71.4 | ||
| 65%代森锌WP | 0.1 | 17.3 | 80%代森锰锌WP | 0.1 | 0.1 |
| 1 | 38.7 | 1 | 3.7 | ||
| 10 | 39.4 | 2 | 13.5 | ||
| 100 | 84.0 | 4 | 50.7 | ||
| 1000 | 93.8 | 6 | 52.5 | ||
| 10%多抗霉素BWP | 0.1 | 21.9 | 3%中生菌素WP | 200 | 0.7 |
| 1 | 27.3 | 400 | 15.1 | ||
| 10 | 33.5 | 600 | 31.2 | ||
| 100 | 34.8 | 800 | 32.6 | ||
| 1000 | 46.8 | 1000 | 40.8 | ||
| 70%甲基硫菌灵WP | 1 | 10.8 | 8%噁霜灵·56%代森锰锌WP | 0.5 | 14.4 |
| 10 | 13.5 | 1 | 17.5 | ||
| 100 | 16.6 | 2 | 28.0 | ||
| 1000 | 31.7 | 4 | 50.3 | ||
| 8000 | 48.9 | 10 | 68.2 | ||
| 80%多菌灵WP | 100 | 2.5 | 16%乙霉威·10%嘧霉胺WP | 0.01 | 2.7 |
| 1000 | 8.0 | 0.1 | 11.1 | ||
| 2000 | 9.3 | 1 | 21.6 | ||
| 5000 | 9.7 | 10 | 81.4 | ||
| 8000 | 9.9 | 100 | 95.4 | ||
| 45%咪鲜胺EW | 0.0005 | 4.2 | 64%代森锰锌·8%霜脲氰WP | 1 | 6.6 |
| 0.001 | 14.0 | 2 | 18.1 | ||
| 0.01 | 21.9 | 5 | 47.1 | ||
| 0.1 | 70.8 | 10 | 47.5 | ||
| 1 | 97.8 | 100 | 76.0 |
12种杀菌剂的抑菌效果依次为：45%咪鲜胺EW>16%乙霉威·10%嘧霉胺WP>65%代森锌WP>25%三唑酮WP>80%代森锰锌WP>8%噁霜灵·56%代森锰锌WP>64%代森锰锌·8%霜脲氰WP>3%中生菌素WP>6%春雷霉素WP>10%多抗霉素B WP>70%甲基硫菌灵WP>80%多菌灵WP。
3 讨论
生物学特性研究结果表明,玉米粉、30 ℃、pH 7.0、连续光照或光暗交替、麦芽糖和酵母提取物等为病原菌培养的最适条件,分生孢子在5~ 45 ℃范围内均能萌发,最适萌发温度为22~33 ℃,致死温度为60 ℃处理10 min。桑利伟等[17]、苏勇等[18]、郑肖兰等[19]研究发现,侵染香蕉、柚木和玉米的新月弯孢病菌生长最适培养基分别为PDA、玉米粉和PSA,另外,张定发等[20]、白元俊等[21]、朱明琪等[22]、苏勇等[18]研究发现光照条件对新月弯孢菌丝生长无显著影响,这些研究结果和本研究存在一定差异。笔者研究发现麦芽糖为病原菌最适碳源,与苏勇等[18]、郑肖兰等[19]研究结果一致,与桑利伟等[17]、费丹[23]的研究结果不一致。另外,分生孢子的致死温为60 ℃（10 min）,与费丹[23]的研究基本一致,显著高于其他国内报道的菌株[17-18, 22, 24]。这些生物学特性方面的差异,可能和菌株来源不同有关,也表明菌株之间有较丰富的遗传多样性。
危害辣椒叶片的病害有很多,其中炭疽病、疮痂病、细菌性叶斑病等为海南地区的常见病害。本研究发现辣椒叶片受新月弯孢侵染后,最初出现水浸状、灰色、圆形的小斑点,病斑随后扩大,典型症状为周围有黑褐色晕圈、不规则、近长条形的黄褐色病斑。炭疽病发病初期同样形成圆形病斑,但后期病斑为灰白色且常出现轮纹状排列的黑色小颗粒（即产孢组织）。疮痂病最初为黄绿色小斑点,病斑扩大后边缘为深褐色至灰色,中央灰白色,而细菌性叶斑病最初形成黄绿色不规则小斑点,扩大后呈红褐色、深褐色或铁锈色[25]。本研究发现的新叶斑病和这些常见病害的症状存在明显差异。
本研究利用分离自海南辣椒上的新月弯孢菌株,采用菌丝生长速率法进行了12种常见杀菌剂的室内药剂筛选,结果发现各种杀菌剂对该菌株的抑菌效果是不同的。其中,苯并咪唑衍生物类咪鲜胺的抑菌效果最好,浓度为1.0 mg/L时抑菌率达97.8%;取代苯衍生物类中的代森锌和代森锰锌,64%代森锰锌和8%霜脲氰复配以及16%乙霉威和10%嘧胺复配的药剂的抑菌效果较好;而农用抗生素类的中生菌素、春雷霉素、多抗霉素B及苯并咪唑衍生物类的甲基硫菌灵的抑菌效果较差;而苯并咪唑衍生物类中多菌灵抑菌效果最差。桑利伟等[17]、苏勇等[18]、费丹[23]分别对分离自香蕉、柚木和水稻的新月弯孢进行室内药剂筛选,发现咪鲜胺效果最好,与本研究结果基本一致。苏勇等[18]还发现代森锌抑制效果一般,但本研究发现该药剂效果较好,浓度为100 mg/L时抑菌率达84.0%。费丹[23]发现多菌灵对来自水稻的新月弯孢病菌有较好的抑制作用,但本研究效果很差。这些结果表明不同来源的菌株对杀菌剂的敏感性存在着较大差异。
本研究完成了病原菌的生物学特性研究和防治药剂筛选,下一步将开展病害流行规律、主栽品种抗性评价和有效药剂的田间控制作用等方面的研究。