菠萝（Ananas comosus L.,Merr.）又称凤梨,是我国南方最具特色和竞争优势的热带水果之一,为当地经济发展和农民增收做出了重要贡献。水心病菠萝,俗称‘水菠萝',是菠萝果实发育后期（即收获前2~4周）开始出现的一种生理性病害,发病果实果肉呈水浸状,无法通过外观识别,必须剖开后才见到病变（图1）。由于果肉细胞间隙充满液体,所以这种果实不耐存放,并且会随着发病程度的加深散发出酒糟味和恶臭味。近年来,水心病在我国菠萝主产区普遍发生,尤其是2018年给菠萝生产造成了很大的影响,损失惨重。
水心病又称糖蜜病,是一种多发于苹果、梨等蔷薇科树种果实上的生理性病害。目前,关于水心病的发生与防治的研究较多,有研究对世界范围内的100余种苹果品种进行调查发现,大多数苹果品种都有水心病的发病记录,但不同的品种间发病程度各不相同[1]。果实内源激素含量变化也会对水心病的发生产生影响,研究表明,赤霉素的增加可以加剧水心病发病程度,对果实商品性造成影响[1]。也有研究表明,在高海拔地区水心病发生率要显著高于平原地区,而采前低温也会显著增加水心病的症状指数[2,3]。矿质元素与水心病的发生也密切相关,目前认为树体钙元素缺失是造成水心病的主要诱因[4,5]。前人研究发现,菠萝水心病一般在土壤酸性较强（pH值低于4.5）、有机质含量不高和透气性不强的情况下容易发生[6]。Chen等[7]研究表明,菠萝果实发育后期的高细胞壁转化酶（CWI）活性增强了蔗糖向果肉外质体的卸载,从而导致水心病的发生。综上所述,品种,内源激素,温度,矿质元素,山梨糖醇代谢等因素与水心病发生密切相关。
果实在一定程度上发生水心病,并不意味着其完全失去商品性。为了准确度量菠萝水心病的发病级别,结合生产实际中的发生情况,以及国内外对水心病的研究,对菠萝水心病的分级标准制定如下（图2）：
菠萝水心病分级标准（4级）：
一级（轻度）：水心部分在果眼或果心,分散,不连片,病斑面积占整果面积不超过23%。
二级（中度）：水心部分在果眼及其周围,少量连片,病斑面积占整果面积不超过43%。
三级（较严重）：水心部分在果眼及其周围,连片,水心部分未延伸到果皮及果心,病斑面积占整果面积不超过63%。
四级（严重）：水心部分大面积连片分布,水心症状延伸到果皮和果心病斑面积占整果面积超过63%。
水心病菠萝发病程度达到中度以上,果肉散发出酒糟味甚至腐烂变质散发恶臭味,失去商品价值。目前,关于水心病菠萝果实品质和内源激素的变化特征还未见报道。本研究通过测定菠萝主栽品种‘巴厘'不同发病程度果实的品质指标、抗氧化酶活性及内源激素含量,分析其变化规律,为探明菠萝水心病的发病机理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
‘巴厘'菠萝（Ananas comosus cv. Comtede Paris）,于2018年6月采自广东省湛江市徐闻县菠萝试验基地。主要试剂：甲醇和乙腈（色谱级）购自美国Sigma公司。蒽酮、2, 6-二氯酚靛酚、氢氧化钠、草酸等试剂均购自广州鼎国生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 试验设计 挑选无机械损伤并且果实大小基本一致的成熟果,切开后,观察统计水心病发病情况,根据水心病发病程度,选取正常果（CK）、轻度发病果（LS）和中度发病果（MS）果肉,一份用于品质指标及抗氧化酶活性测定,置于-20 ℃冰箱保存备用;一份用于内源激素含量的测定,液氮冷冻后置于-80 ℃超低温冰箱备用。实验重复3次。
1.2.2 品质指标测定 可溶性固形物含量测定采用手持折光仪;可滴定酸含量测定采用酸碱滴定法;维生素C（Vc）含量测定采用2, 6-二氯酚靛酚滴定法。
1.2.3 单糖含量测定 果糖、葡萄糖和蔗糖的提取和测定参照赵智中等的方法[8],并略有改进。采用高效液相色谱法（HPLC）。色谱条件如下：PE 200示差折光检测器,Series 200氨基酸柱,柱温35 ℃,流动相（乙腈:重蒸水=70:30,V/V）,流速1 mL/min。果糖、葡萄糖和蔗糖标样均为分析纯。
1.2.4 内源激素含量测定 由上海鹿明生物科技有限公司测定。采用液质联用（LC-MS）的方法,质谱系统采用的是Waters公司的Waters Xevo® TQ-S质谱检测系统,质谱分析条件如下：Capillary voltage: 2.5 kV(-);Cone voltage: 30 V;Collision：15 V;Source offset voltage: 50 V;Desolvation temperature: 500 ℃;Desolvation gas flow: 800 L/Hr;Cone gas flow: 150 L/Hr;Collision gas flow: 0.17 mL/min。色谱系统采用的是Waters公司超高效液相色谱仪,采用Cortecs uplc C18柱（2.1 mm× 100 mm,1.6 μm）液相色谱柱,流动相A（0.1%甲酸-水溶液）,流动相B（0.1%甲酸-甲醇）,柱温40 ℃,进样量为2 μL。
1.3 数据处理
实验数据采用Excel 2010软件进行计算处理与作图,采用SAS 9.0的Duncan's进行差异显著性检验和相关分析。
2 结果与分析
2.1 不同水心病菠萝果实可溶性固形物、Vc和可滴定酸含量的变化
由图3可以看出,水心病菠萝果实的可溶性固形物含量和Vc含量明显下降,且下降幅度随着果实发病程度的增加而增加。中度水心病菠萝可溶性固形物含量和Vc含量分别比对照降低了14.2%和39.5%,差异显著。轻度水心病菠萝可溶性固形物含量较对照下降10.1%,差异不显著;Vc含量较对照下降28.3%,达到显著差异水平。不同发病程度的水心病菠萝提高了可滴定酸含量,其中,轻度和中度水心病的可滴定酸含量分别比对照提高了39.3%和4.2%,其中,中度水心病的可滴定酸含量与对照没有显著差异。
2.2 不同水心病菠萝果实单糖含量的变化
2.3 不同水心病菠萝果实抗氧化酶活性和丙二醛含量的变化
由图5A、B、C可知,轻度水心病菠萝果实SOD、POD和CAT活性均比对照高,分别提高了1.3%、7.1%和5.0%,方差分析表明差异不显著。中度水心病菠萝果实SOD和POD活性较对照明显下降,分别下降了16.0%和7.2%,而CAT活性较对照明显提高,提高幅度达40.6%,达到了显著差异水平（P<0.05）。
不同发病程度的水心病菠萝果实MDA含量升高（图5D）。轻度水心病和中度水心病菠萝果实中丙二醛含量分别比对照提高了13.7%和18.5%,方差分析表明没有达到显著差异水平。
2.4 不同发病程度水心病菠萝果实内源激素含量的变化
不同发病程度水心病对菠萝果实内源激素含量具有显著影响（图6）。1-氨基环丙烷羧酸（ACC）是乙烯生物合成的直接前体,轻度水心病菠萝果实中ACC含量显著下降,较对照降低7.6%。而中度水心病菠萝中ACC含量显著增加,较对照提高了8.1%。不同程度水心病菠萝果实中玉米素（ZT）、茉莉酸（JA）和脱落酸（ABA）含量极显著降低,轻度水心病菠萝中较对照分别下降25.0%、30.6%和14.5%,中度水心病菠萝中较对照分别下降72.3%,77.5%和79.1%。不同程度水心病菠萝中水杨酸（SA）含量较对照显著提高,轻度和中度水心病菠萝分别比对照提高了17.9%和33.4%。
2.5 水心病菠萝病情级别、抗氧化酶活性和内源激素含量的关系
由表1可知,水心病发病程度与SOD酶活性呈显著负相关,即SOD酶活性越小,水心病发病程度越深;与CAT酶活性呈显著正相关,与POD酶活性相关不显著。除ACC外,水心病发病级别与内源激素ZT、JA和ABA呈极显著负相关,相关系数分别为-0.98、-0.98和-0.94;与SA呈极显著正相关,相关系数为0.93。抗氧酶活性与内源激素含量的相关分析表明,SOD活性与ZT和JA显著正相关,与SA显著负相关。CAT与ACC和SA显著正相关,与ZT、JA和ABA显著负相关。
表1 水心病发病程度、抗氧化酶活性和内源激素含量的相关性Tab.1 Relationship among watercore degree, antioxidant enzymes activity and endogenous hormones content |
| 病级 Disease level | SOD | POD | CAT | ACC | ZT | SA | JA | ABA | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 病级 | 1.00 | ||||||||
| SOD | -0.75* | 1 | |||||||
| POD | -0.52 | 0.05 | 1 | ||||||
| CAT | 0.77* | -0.64 | -0.15 | 1 | |||||
| ACC | 0.51 | -0.24 | -0.18 | 0.72* | 1 | ||||
| ZT | -0.98** | 0.67* | 0.54 | -0.77* | -0.65 | 1 | |||
| SA | 0.93** | -0.67* | -0.43 | 0.77* | 0.46 | -0.88** | 1 | ||
| JA | -0.98** | 0.75* | 0.47 | -0.80** | -0.61 | 0.99** | -0.89** | 1 | |
| ABA | -0.94** | 0.65 | 0.48 | -0.85** | -0.77* | 0.98** | -0.86** | 0.97** | 1 |
注：*和**分别表示在P<0.05水平差异显著和在P<0.01水平差异极显著。 | |
Note: *, ** indicate significant difference at 0.05 and 0.01 levels. |
3 讨论
3.1 水心病菠萝果实品质指标变化
菠萝果实品质包括外观品质和内在品质2个方面。外观品质主要包括果实色泽、大小、形状等,而水心病对菠萝果实外观品质没有影响,发病果实无法通过外观识别。内在品质主要包括糖含量、酸含量、维生素含量、香气、果肉纤维素含量等,其中果实中糖、酸含量是决定菠萝品质最重要的指标之一[9]。本研究发现,水心病使菠萝果实的可溶性固形物含量、总糖含量和Vc含量明显下降,轻度水心病与正常果没有显著差异,随着发病程度的加深而下降幅度增加。提高了可滴定酸含量,降低了糖酸比,使菠萝果实品质下降。
3.2 水心病菠萝抗氧化酶系统的变化
现有研究表明,水心病是一种由不利环境条件引发的生理失调。非生物胁迫会诱导植物体内大量活性氧（ROS）产生,过量的活性氧会破坏细胞膜的结构与功能,进而产生有损细胞膜的有害物质MDA, 为减轻活性氧对细胞的伤害, 植物体内存在多种保护机制[10,11,12],其中,抗氧化保护酶SOD、POD和CAT等能够有效地清除这些自由基,是酶促防御系统的重要组成成分[13]。前人研究发现,SOD和POD活性与糜子黑穗病发病率呈显著负相关,说明SOD、POD活性在一定程度上可反应抗性水平[14]。本研究发现,轻度水心病菠萝果实中SOD、POD和CAT活性较对照提高,表明保护酶清除自由基的能力在水心病发病初期有所提高。但中度水心病菠萝果实中SOD和POD活性明显下降,CAT活性升高,表明中度水心病菠萝中保护酶系统的保护能力下降,导致活性氧代谢失调,细胞膜受损。这与前人在干旱胁迫、除草剂胁迫等对抗氧化酶系统影响的研究结果一致[15,16]。MDA是膜脂过氧化的主要产物之一,其含量变化可以反映植物遭受伤害的程度。本研究中,不同发病程度水心病菠萝果实中MDA含量均增加,表明水心病导致膜脂过氧化加剧,造成细胞膜损伤。
3.3 水心病菠萝内源激素含量的变化
SA在植物应对逆境胁迫时起到积极的防御作用,是植物系统获得抗性（SAR）的重要内源信号分子,在植物抵御生物胁迫中起重要作用[17,18,19]。JA具有广谱的生理效应,并作为抗病信号转导途径中的重要信号分子,参与植物的防御反应[20]。ACC作为植物体内乙烯生物合成的直接前体,通常认为其激活植物抗性与乙烯通路密切相关。ABA是一种典型的植物逆境激素,参与作物生长发育的多个过程[21]。ZT作为一种天然的游离态细胞分裂素广泛存在于植物体内,具有促进细胞分裂,延缓植物衰老的作用[22]。本研究中,不同发病程度水心病菠萝中除SA显著增加外,ZT、JA和ABA含量均显著下降,随着水心病胁迫程度加深而增加;ACC在轻度水心病菠萝中含量下降,中度水心病菠萝中含量增加,表明,水心病胁迫下促进菠萝SAR的生成,有利于菠萝对水心病的防御反应。
3.4 水心病发病程度与抗氧化酶系统、内源激素含量间的关系
已有研究表明,SA、ABA、JA等植物激素与植物的抗病性密切相关。植物激素主要作为信号分子参与激发植物的免疫防御反应对抗生物胁迫（病原菌侵染、害虫咬食等）和非生物胁迫（干旱、高低温、盐碱等）[19]。本研究中,水心病发病级别与内源激素ZT、JA和ABA呈极显著负相关,与SA呈极显著正相关,与ACC没有显著相关性,表明,菠萝水心病发病程度与ZT、JA、ABA和SA含量变化密切相关。另外,抗氧化酶系统与激素信号通路之间也存在相互作用的关系,抗氧化酶系统依赖激素浓度影响植物的发育进程,而激素可反馈调控植物对抗氧化酶活性的清除和积累[23]。SA在诱导多种植物对生物或非生物胁迫产生持续抗性上起到信号分子的作用,诱导许多植物抗性相关酶的生成,并调节其活性[24]。JA可以增强SOD、POD、CAT等的活性[25]。本研究中,SOD活性与ZT和JA显著正相关,与SA显著负相关。CAT与ACC和SA显著正相关,与ZT、JA和ABA显著负相关。
综上所述,水心病菠萝果实中可溶性固形物、可溶性糖含量、Vc含量均下降,可滴定酸含量提高,糖酸比降低,造成菠萝果实品质下降。不同发病程度水心病与内源激素JA、ABA、ZT和SA含量密切相关,各激素共同调控以抵抗水心病的胁迫,对ACC影响不大。SOD和CAT活性在不同发病程度水心病菠萝中变化幅度大,与对照存在显著差异,而POD活性与对照没有明显差异。