植物在整个生长发育过程中不可避免的会遭受低温、干旱和高盐等非生物胁迫危害,导致作物品质及产量下降。植物为保证自身正常的生长发育进化出一套完整的抗逆机制,其中包括对胁迫信号的感知和传导。蛋白质的磷酸化和去磷酸化在植物细胞信号传导过程中发挥着重要的调节作用。磷酸化反应中的蛋白激酶可将ATP或GTP提供的磷酸基团转移到特定底物蛋白上,起到调节蛋白活性和逐级放大信号的作用。真核生物中普遍存在的丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）级联途径是一种重要的细胞信号传导模式。MAPK级联途径包括丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK/MAP3K/ MEKK/MKKK）、丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK/MEK/MKK）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK/MPK）[1,2]。MAPKKK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,位于MAPK级联途径最上游。一旦被信号传导组分触发,MAPKKK可选择性地磷酸化下游保守的丝氨酸/苏氨酸-X3-5-丝氨酸/苏氨酸（S/T-X3-5-S/T）基序中Ser/Thr残基[3],从而激活MAPKK。活化后的MAPKK同样可通过磷酸化的方式激活下游的MAPK。活化的MAPK能磷酸化转录因子、激酶和其他功能性蛋白质等多种底物,最终启动植物细胞对逆境胁迫的一系列应答反应[4,5,6]。植物体内MAPK级联途径在非生物胁迫响应过程中发挥重要作用[7,8]。
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg）原产于巴西亚马逊河流域,为多年生高大落叶乔木。因其具有产胶量高、性能优、易栽培、易采胶、种植成本低和经济寿命长等优势,巴西橡胶树已成为热带地区重要的产胶经济作物。我国植胶区为非传统植胶区,植胶区域纬度偏高,热量和降水量不足。低温和干旱等非生物胁迫严重影响我国天然橡胶的产量[9]。因此,阐明橡胶树抗逆机制能有效促进我国天然橡胶产业的发展。本课题组前期研究发现,冷胁迫下橡胶树抗寒品种93-114和不抗寒品种热垦501中MAPKKK基因均上调表达,但随着冷胁迫时间的延长,抗寒品种CATAS93-114中MAPKKK基因的表达量高于不抗寒品种热垦501,说明MAPK级联途径可能参与橡胶树低温胁迫响应[10]。植物MAPKKK是MAPK级联途径中成员最多的一类,如拟南芥中有80个[1]、水稻中有75个[11]、黄瓜中有59个[12]、麻风树有65个[13],其中大部分MAPKKK基因功能未被鉴定。鉴于目前橡胶树转基因体系仍不成熟,目前借鉴模式植物拟南芥同源基因的功能来解析橡胶树基因的功能为一种行之有效的研究手段。序列比对发现拟南芥MAPKKK15基因与橡胶树MAPKKK基因同源,但AtMAPKKK15功能仍不清楚。鉴于此,本项目筛选和鉴定了拟南芥mapkkk15纯合突变体植株,并对在低温和干旱胁迫下纯合突变体的功能进行分析。通过对拟南芥MAPKKK15基因功能的研究,旨在揭示该类基因在植物逆境胁迫应答中的作用,为进一步解析橡胶树MAPKKK基因的功能提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用拟南芥（Arabidopsis thaliana）生态型为Columbia（Col）。MAPKKK15基因的T- DNA插入突变体SALK_084817、SALK_102722和SALK_102721c（分别简称为mk3-15-1、mk3- 15-2和mk3-15-3）种子购于TAIR库（http://www.arabidopsis.org）。
1.2 方法
1.2.1 橡胶树MAPKKK基因与拟南芥MAPKKK15序列比对 利用DNAMAN软件对橡胶树基因组数据库（http://hevea.catas.cn/home/index）中scaffold0552_396232蛋白序列和拟南芥MAPKKK15蛋白序列进行比对分析。
1.2.2 拟南芥的培养 拟南芥种子用75%乙醇表面消毒5 min,加入50%次氯酸钠（含0.05%吐温-20）溶液消毒10 min,无菌蒸馏水洗5~6次,置于灭菌滤纸上吹干,播种于1/2 MS培养基上。4 ℃放置2~3 d后转移至16 h光照/8 h黑暗,22 ℃条件下生长。7 d后将拟南芥幼苗移植到混合基质（营养土:蛭石=3:1）中继续培养1~5周。
1.2.3 mapkkk15纯合突变体的筛选 将拟南芥突变体幼苗培养2周左右,参考陈相等[14]方法快速提取拟南芥基因组DNA。在SALK网站（http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html/）上根据拟南芥突变体的编号查询genotyping引物（表1）,其中MK3-15-1LP和MK3-15-1RP、MK3-15- 2LP和MK3-15-2RP、MK3-15-3LP和MK3-15-3RP分别与LBb1.3组合,利用三引物法鉴定mapkkk15纯合突变体。PCR反应体系包括1 µL模板,3条引物各0.5 µL,2×PCR Mix 10 µL,用ddH2O补足至20 µL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min,循环30次;最后72 ℃延伸7 min。
表1 本研究所用PCR引物Tab. 1 PCR primers used in this study |
| 引物名称Primer name | 引物序列（5′-3′）Primer sequence (5′-3′) | 用途Application |
|---|---|---|
| MK3-15-1LP | TAAACGCTGGACTCAACCATC | genotyping |
| MK3-15-1RP | TTATGTCACCGGAGGTAGCAC | genotyping |
| MK3-15-2LP | AGTTTGGTATCGGGTAGGGTG | genotyping |
| MK3-15-2RP | TTGGGGTGTACGGTGATAGAG | genotyping |
| MK3-15-3LP | AGTTTGGTATCGGGTAGGGTG | genotyping |
| MK3-15-3RP | GGTTTGGTTATCGGAGAAAGG | genotyping |
| LBb1.3 | ATTTTGCCGATTTCGGAAC | genotyping |
| MK3-15-QF | TCACATCATCACAAGTCTTTGCTT | qPCR |
| MK3-15-QR | AAGTGAGACAGTAGCTGTTGAGC | qPCR |
1.2.4 野生型和mapkkk15突变体植株中MAPKKK15基因表达量分析 使用QIAGEN公司的RNeasy® Plant Mini Kit提取拟南芥叶片总RNA,具体操作按照试剂盒说明书进行。参照Thermo Fisher公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书制备cDNA第一链。以拟南芥叶片cDNA为模板,MK3-15-QF和MK3-15- QR为引物,拟南芥Actin为内参基因,使用TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）进行实时荧光定量PCR（qPCR）分析。设置3个生物学重复和无模板对照。扩增条件为95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,共进行40个循环。相对表达量用2-ΔΔCT法计算。
1.2.5 低温胁迫对拟南芥植株的影响 （1）低温胁迫对mapkkk15突变体的表型影响：各选取2盘生长4~6周的野生型及突变体幼苗,其中一盘放于22 ℃人工气候室培养,另一盘放于4 ℃培养箱中进行低温驯化。2 d后将驯化和未驯化的幼苗均放入0 ℃培养箱中,设置培养箱温度每小时降低1 ℃并保持在-6 ℃。-6 ℃处理后0、4、8、24 h取出幼苗置于4 ℃培养箱中培养12 h,然后再转移至22 ℃人工气候室继续培养,一周后观察表型并拍照记录。
（2）低温胁迫下拟南芥叶片电解质渗漏率测定：随机选取抗冻性实验中-6 ℃处理4 h后的拟南芥叶片10 mg,将样品置于15 mL离心管中,将离心管放入防冻剂（乙二醇:水=3:1）中进行-2 ℃低温水浴处理,每半小时降低0.5 ℃直至降至-6 ℃,继续处理4 h,然后置于室温解冻后,将损伤幼苗放入含有5 mL去离子水的15 mL管中,在22 ℃下振荡15 min,测量电导率为S1。然后将试管放入100 ℃的沸水浴15 min,在22 ℃下振荡1 h后,测定电导率为S2。电解质渗漏率表示为（S1-S0）/（S2-S0）（S0为去离子水的电导率）[15]。每个材料设置6个重复。
（3）MAPKKK15基因对低温胁迫的响应：将4~6周的拟南芥野生型幼苗置于22 ℃人工气候室中培养2 d,然后转移至4 ℃培养箱中进行模拟寒害处理,分别于处理后0、0.25、1、2、4、8、24 h取样,采用qRT-PCR技术分析MAPKKK15基因表达模式。
1.2.6 干旱胁迫下拟南芥叶片脱水率测定 剪取3株拟南芥野生型和突变体幼苗叶片,置于培养皿中迅速称取初始鲜重（FW）,每种材料设置6个重复,将培养皿放入人工气候室后2、4、6、8、10、12、14、16、20 h分别测定重量（DW）,叶片脱水率表示为（FW-DW）/FW×100%。
2 结果与分析
2.1 橡胶树MAPKKK基因与拟南芥MAPKKK15基因序列比对
本课题组前期从橡胶树低温胁迫的转录组数据中获得1个橡胶树MAPKKK基因[10],该基因的开放阅读框为1356 bp,编码451个氨基酸。为研究橡胶树MAPKKK基因功能时作为参考,通过同源搜索发现拟南芥MAPKKK15基因（AT5G55090.1）与橡胶树MAPKKK基因一致性为54.57%（图1）,橡胶树MAPKKK基因与AtMAPKKK15基因编码的氨基酸一致性为42.11%（图2）,其中2~257位氨基酸为保守的丝氨酸/苏氨酸激酶催化结构域。AtMAPKKK15基因组序列无内含子。文献检索后发现AtMAPKKK15功能仍未被鉴定。因此,鉴定非生物胁迫下拟南芥MAPKKK15的功能,为进一步研究橡胶树MAPKKK基因功能时有可供参考的研究结果。
2.2 鉴定mapkkk15纯合突变体
TAIR数据库比对发现3个突变体株系的T-DNA都插入在外显子上,mk3-15-1、mk3-15-2和mk3-15-3突变体T-DNA分别插入在MAPKKK15基因ATG下游930、1090、1180 bp左右（图3A）。用三引物法进行PCR扩增,野生型植株扩增产物为1100 bp左右的单一条带;纯合突变体植株扩增产物为560 bp左右的条带;杂合突变体植株扩增产物为560 bp和1100 bp左右2条条带。结果显示,mk3-15-1突变体的1~20号植株中,4、5、8、10和19为纯合突变体,11为杂合突变体;mk3-15-2均为野生型;mk3-15-3均为纯合突变体（图3B）。以拟南芥野生型作为对照,MAPKKK15基因在mk3-15-1和mk3-15-3两个突变体株系中几乎不表达,表明突变体是完全缺失突变体（图3C）。将mk3-15-1和mk3-15-3纯合突变单株收种,扩繁保存备用。
图3 纯合突变体的鉴定A：mapkkk15突变体T-DNA插入位置示意图;B：mapkkk15突变体DNA水平的鉴定（数字表示拟南芥突变体单株）;C：mapkkk15突变体转录水平的鉴定;M：DL2000 marker;**表示差异极显著（P<0.01）。 Fig. 3 Identification of homozygous mutant A: Schematic diagram of the position of the T-DNA insertion for mapkkk15; B: Identification of mapkkk15 mutant at DNA level (Numbers represent the Arabidopsis individual mutants); C: Identification of mapkkk15 mutant at transcription level; M: DL2000 marker; ** denotes extremely significant difference (P<0.01). |
2.3 低温胁迫下mapkkk15突变体表型分析
拟南芥野生型植株经过4 ℃低温处理,然后进行qRT-PCR分析基因表达模式。结果表明,AtMAPKKK15基因在低温胁迫后0.25 h表达明显下调,1 h后轻微上调,随后表达量一直处于较低水平（图4A）。表明AtMAPKKK15基因表达受低温胁迫的抑制。
图4 mapkkk15突变体低温胁迫抗性增强A：低温胁迫下AtMAPKKK15基因的表达模式;B：低温胁迫后的拟南芥表型;C：低温胁迫下拟南芥叶片电解质渗漏率;**表示差异极显著（P<0.01）。 Fig. 4 The mapkkk15 mutants were more resistant to low temperature stress than wild-type Arabidopsis A: Expression profiles of AtMAPKKK15 under low temperature stress; B: Phenotypes of Arabidopsis after low temperature stress; C: Electrolyte leakage percentage of Arabidopsis leaves under low temperature stress; ** denotes extremely significant difference (P<0.01). |
以野生型植株作为对照,将拟南芥植株在-6 ℃分别进行冻害处理0、4、8、12、24 h。结果显示,拟南芥经过低温处理后未立即死亡,但恢复培养一周后,仅低温处理4 h的突变体植株部分存活,其余处理植株全部死亡。低温处理4 h的2个突变体株系间幼苗存活株数无差异。电解质渗漏率结果也表明,mapkkk15突变体叶片的渗漏率低于野生型植株,mk3-15-3株系的电解质渗漏率低于mk3-15-1株系,其中mk3-15-3株系与WT相比差异达到极显著水平（图4C）。上述结果表明,与野生型相比,mk3-15-1和mk3-15-3突变体表现出更强的抗冻性,突变体mk3-15-3株系低温胁迫抗性可能高于mk3-15-1株系（图4B、图4C）。
2.4 mapkkk15突变体离体叶片脱水率变化
3 讨论
巴西橡胶树原产于高温、高湿的亚马逊河流域,是一个典型的热带雨林树种。我国植胶区地处热带北缘和南亚热带,属非传统植胶区,橡胶树常遭受低温和干旱等非生物胁迫危害[9]。研究逆境胁迫反应的信号传导机制对于提高橡胶树抗逆性具有重要意义。MAPK级联途径在极端温度和干旱等非生物胁迫应答中发挥着重要作用。MAPKKK作为级联途径最上游的组分,可通过蛋白质磷酸化作用将上游信号级联放大并传递至下游应答分子,从而激活抗逆基因的表达。本课题组前期获得1个低温响应的橡胶树MAPKKK基因,鉴于橡胶树转基因技术仍不成熟,目前通过借鉴同源的模式植物基因的功能来解析橡胶树基因的功能为一种行之有效的研究途径。同源比对发现该基因与拟南芥MAPKKK15基因（AT5G55090.1）一致性为54.57%（图1）,基因编码的氨基酸一致性为42.11%（图2）。但随后文献检索发现AtMAPKKK15功能仍未被鉴定。因此,本研究通过鉴定非生物胁迫下拟南芥MAPKKK15的功能,为进一步研究橡胶树MAPKKK基因功能提供参考依据。
已有研究证明MAPKKK在非生物胁迫过程中发挥重要作用[[7-8, 16-20]。拟南芥MAPKKK的RAF亚族中Raf 43基因的表达受干旱胁迫诱导,raf43-1突变体抗旱性下降[18]。RAF亚群的DSM1基因在水稻中能被盐、干旱、ABA诱导,但不能被低温诱导。DSM1作为早期信号组分通过调控ROS清除来提高水稻干旱胁迫抗性[19]。PEG和NaCl抑制棉花GhRaf19表达,低温和H2O2诱导棉花GhRaf19表达。GhRaf19沉默导致棉花抗旱性和耐盐性增强,抗寒性下降。过表达GhRaf19基因的本生烟干旱和盐胁迫抗性下降,抗寒性提高[20]。Wang等[13]发现低温处理后62个麻风树MAPKKK基因中有8个上调表达,9个下调表达。本研究结果显示AtMAPKKK15基因表达受低温抑制。以野生型植株作为对照,将拟南芥植株在-6 ℃进行胁迫处理,mapkkk15突变体植株的死亡率和电解质渗漏率低于野生型植株,表明与野生型相比mapkkk15突变体抗寒性提高。本研究还发现mapkkk15突变体叶片在随着离体时间延长,脱水率高于野生型,提示mapkkk15突变体抗旱性弱于野生型植株。根据上述结果推测AtMAPKKK15基因在拟南芥中可能反向调控抗寒性,正向调控抗旱性。MAPKKK基因在非生物胁迫过程中是一个关键调节子,其功能复杂,仍需进一步研究才能阐明AtMAPKKK15基因的功能及其作用机制。