山茶油（camellia oil）,又名茶油、油茶籽油、茶籽油,富含不饱和脂肪酸、维生素E、茶多酚、β-谷甾醇等营养功能成分,具有预防心血管疾病、抗氧化、清除自由基等功效,素有“东方橄榄油”“液体黄金”“油中之王”等美称[1,2]。但山茶油因不饱和脂肪酸含量高（>90%）,对氧气、温度、光照、湿度等较为敏感,在加工和贮运过程中易氧化劣变,影响其营养价值和食用安全性[3]。同时,山茶油本身的水不溶性及特殊气味也极大限制了其在食品中的应用。油脂通过微胶囊化可有效防止不饱和脂肪酸氧化变质、降低或掩盖不适风味、改善油脂口感、便于运输和保存,克服传统油脂的应用局限[4]。
目前,喷雾干燥、复合凝聚、原位聚合、层层自组装等技术被用于油脂的微胶囊化,其中,喷雾干燥法以其干燥过程简便、产品分散性好等优点成为油脂微胶囊化的最常用技术,但该方法存在高温干燥过程会对芯材的油脂产生破坏,导致制备的微胶囊产品部分凹陷破裂、吸附在表面的油脂易氧化变质等问题[5,6,7,8],而复合凝聚法是利用两种及两种以上带相反电荷的壁材相互作用形成复合凝聚物,再经固化工艺形成三维网状刚性结构的微胶囊化过程,其较常规喷雾干燥法具有制备过程条件温和、芯材高产、耐高温、耐高湿等特点[9]。因此,本研究以明胶-阿拉伯胶为壁材,茶多酚为固化剂,采用复合凝聚法制备山茶油微胶囊,考察壁材比例、凝聚pH、凝聚时间、壁材浓度和芯壁比等因素对山茶油微胶囊包埋效果的影响,并对山茶油微胶囊的流动性和贮藏稳定性进行分析,以期为复合凝聚法制备山茶油微胶囊提供依据和实践指导,为山茶油的开发利用提供新的思路和途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 山茶油（冷榨油）,福建优创农业发展有限公司提供;阿拉伯胶、明胶、茶多酚等均为食品级,北京索莱宝科技有限公司;氢氧化钠、正己烷、无水乙醇、冰乙酸等均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。
1.1.2 仪器与设备 BSA-224S电子分析天平,北京赛多利斯科学仪器有限公司;Q500热重分析仪,美国TA公司;FDU-1200冷冻干燥机,日本东京理化器械株式会社;BX51生物荧光显微镜,奥林巴斯（北京）销售服务有限公司;UV-2200紫外可见分光光度计,岛津仪器（苏州）有限公司;FG200-S高速剪切均质机,上海标模厂;DK-S26型电热恒温水浴锅,上海精宏实验设备有限公司;DHG-9240A电热鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;H2050R高速冷冻离心机,长沙湘仪仪器有限公司;PB-10型pH计,北京赛多利斯科学仪器有限公司;HXC-500-6A多点磁力搅拌恒温槽,常州诺基仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 山茶油微胶囊的制备工艺 山茶油微胶囊的制备工艺流程如图1所示。
壁材溶解：分别将一定质量比的明胶和阿拉伯胶加蒸馏水静置过夜,充分溶胀后升温至60 ℃使其溶解,置于45 ℃水浴锅中待用;
均质：将山茶油缓慢加入溶解后的明胶和阿拉伯胶溶液中,45 ℃、10 000 r/min均质3 min,为避免高速长时均质造成乳化液温度上升,产生大量泡沫,分3次间歇均质;
复合凝聚：乳化液45 ℃下低速搅拌,用10%冰乙酸调节体系pH,反应一定时间;
降温：乳化液先经冷水浴降温至30 ℃,防止降温过快导致壁材析出,随后冰浴迅速降温至15 ℃,提升体系黏度,避免微胶囊间粘连聚集;
固化：按100 mg/g明胶量添加茶多酚,用0.1 mol/L NaOH溶液调节反应体系pH至10,固化12 h后经离心、洗涤、抽滤得微胶囊湿囊,并经冷冻干燥得山茶油微胶囊产品。
1.2.2 壁材比的确定 根据吕怡[10]的浊度分析方法,分别配制0.2%的明胶和阿拉伯胶溶液,并按1∶1、1∶2、2∶1（W/W）配制系列明胶-阿拉伯胶混合液,在45 ℃下边搅拌边缓慢滴加冰乙酸溶液至不同的pH,并测其在600 nm下的吸光值A600。
1.2.3 复合凝聚工艺单因素试验 在1.2.2确定的壁材比下进行山茶油微胶囊复合凝聚工艺的单因素试验,考察pH、芯壁比（W/W）、壁材浓度、凝聚时间等对微胶囊包埋率及其形态的影响。pH设定为3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6;芯壁比设定为1∶2、1∶1、3∶2、2∶1;壁材浓度设定为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%;凝聚时间设定为5、10、20、30、40、60 min。每组单因素试验做3组平行。
1.2.4 复合凝聚工艺正交试验 在单因素试验的基础上,以pH、凝聚时间、壁材浓度为试验因素,以山茶油微胶囊包埋率为指标,采用L9(34)正交试验对山茶油微胶囊的复合凝聚工艺进行优化。各因素水平见表1。
表1 正交试验因素与水平Tab. 1 Factors and levels of orthogonal experiment |
| 水平 Levels | A: pH | B: 凝聚时间 Coagulation time/ min | C: 壁材浓度 Wall material concentration/% |
|---|---|---|---|
| 1 | 4.0 | 20 | 0.5 |
| 2 | 4.2 | 30 | 1.0 |
| 3 | 4.4 | 40 | 1.5 |
1.2.5 山茶油含量标准曲线的绘制 （1）山茶油最大吸收峰的测定。用正己烷配制2 mg/mL的山茶油-正己烷溶液,以正己烷进行基线校准后,将待测溶液在200~600 nm波长范围内进行全波长扫描,获得山茶油的最大吸收波长为229 nm。
（2）标准曲线的绘制。用正己烷配置0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL的山茶油-正己烷溶液,在229 nm下分别测其吸光值A229,绘制出浓度（mg/mL）与吸光值A229的标准曲线（图2）,y=0.7923x-0.0127,R2=0.9988。
1.2.6 微胶囊包埋率的测定 根据夏慧亭[6]的方法,稍作修改。表面油的测定：称取1.0 g微胶囊于50 mL离心管中,加入10 mL正己烷震荡60 s,10 000 r/min离心3 min,取5 mL上清液用正己烷定容至10 mL。测其在A229处吸光值,并通过标准曲线计算得到表面油含量M1。总油含量的测定：称取1.0 g微胶囊,加入10 mL热水振荡20 min,随后用20 mL正己烷超声处理30 min使油充分析出,10 000 r/min下离心10 min,取1 mL上清液用正己烷定容至10 mL,测其吸光值A229,并计算微胶囊总油含量M2。包埋率按下列公式计算：
$包埋率=\lgroup 1-\frac{M_1}{M_2}\rgroup×100%$
式中：M1为微胶囊表面油含量,mg;M2为微胶囊总油含量,mg。
1.2.7 微胶囊显微形态观察 取数滴山茶油微胶囊悬浊液,置于洁净载玻片上,于生物荧光显微镜下观察并在200×放大倍数下拍照。
1.2.8 含水率测定 按照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》方法测定。
1.2.9 休止角的测定 根据王晓霞[11]的注入法测定,将10 g微胶囊样品经漏斗倒在水平面上,使微胶囊粉末呈自然堆积状。测量粉堆高度h（mm）和粉堆半径r（mm）,休止角θ根据以下公式计算：
$\theta=arctan\lgroup \frac{h}{r}\rgroup$
1.2.10 热重分析 分别称取10 mg干燥的山茶油、山茶油微胶囊,采用热重分析仪分别对其进行热重测定,升温速率为5 ℃/min,升温至600 ℃,氮气流速20 mL/min,分析山茶油、山茶油微胶囊的热稳定性。
1.2.11 氧化稳定性分析 根据王大为等[12]的方法,并略作修改。将一定量山茶油及山茶油微胶囊粉末分别加入250 mL锥形瓶中,置于(62±1)℃电热恒温干燥箱中进行油脂加速氧化试验,每24 h取样一次,按照GB 5009.229—2016《食品国家安全标准 食品中酸价的测定》、GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》的方法分别测定样品的酸价（acid value,AV）和过氧化值（peroxide value,POV）。
1.3 数据分析
各指标均重复测定3次,采用Origin 8.5软件进行数据处理和分析,并采用Turkey多重比较法进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 复合凝聚最佳壁材比的确定
明胶的表面带电性取决于体系的pH,当体系的pH低于明胶等电点（5.0左右）时呈正电性,而阿拉伯胶是一种由多糖链和蛋白质组成的负电荷聚合物,当体系中明胶与阿拉伯胶所带正负电荷越接近,净电荷越少,凝聚反应越充分,复合凝聚效果越好,体系吸光值越大[6]。如图3所示,明胶/阿拉伯胶系列壁材比在不同pH下对凝聚体系吸光值的影响趋势大致相同,当阿拉伯胶或明胶的添加量增大时,体系的正负电荷失衡,净电荷增多,凝聚反应受抑制,凝聚物减少,吸光值下降。在pH 4.2下,明胶/阿拉伯胶壁材比为1∶1时出现最大吸光值,表明此时体系中明胶与阿拉伯胶所带正负电荷相等,凝聚反应最充分,复合凝聚效果最好。因此,确定明胶/阿拉伯胶壁材比例为1∶1。
2.2 凝聚pH对微胶囊包埋率及其形态的影响
图4 凝聚pH对山茶油微胶囊包埋率（A）及其形态（B）影响不同小写字母表示差异显著（P<0.05）,显微图片为200×放大倍数下拍摄。 Fig. 4 Effects of coagulation pH on the microencapsulation efficiency (A) and morphology (B) of camellia oil microcapsule Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The micrographs were taken at a magnification of 200 times. |
2.3 凝聚时间对微胶囊包埋率及其形态的影响
图5 凝聚时间对山茶油微胶囊包埋率（A）及其形态（B）的影响不同小写字母表示差异显著（P<0.05）,显微图片为200×放大倍数下拍摄。 Fig. 5 Effects of coagulation time on microencapsulation efficiency (A) and morphology (B) of camellia oil microcapsule Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The micrographs were taken at a magnification of 200 times |
2.4 不同芯壁比对微胶囊包埋率及其形态的影响
图6 芯壁比对山茶油微胶囊包埋率（A）及其形态（B）的影响不同小写字母表示差异显著（P<0.05）,显微图片为200×放大倍数下拍摄。 Fig. 6 Effects of core-wall ratio on microencapsulation efficiency (A) and morphology (B) of camellia oil microcapsule Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The micrographs were taken at a magnification of 200 times. |
2.5 壁材浓度对微胶囊包埋率及其形态的影响
图7 壁材浓度对山茶油微胶囊包埋率（A）及其形态（B）的影响不同小写字母表示差异显著（P<0.05）,显微图片为200×放大倍数下拍摄。 Fig. 7 Effects of wall-material concentration on the microencapsulation efficiency (A) and morphology (B) of camellia oil microcapsule Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The micrographs were taken at a magnification of 200 times. |
2.6 正交试验结果分析
表2 正交试验结果与分析Tab. 2 Results and analysis of orthogonal experiment |
| 试验号 Code | A: pH | B: 凝聚时间 Coagulationtime/min | C: 壁材浓度 Wall material concentration/% | 包埋率 Microencapsulation efficiency/% | |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 1 | 1 | 1 | 75.58 | |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 78.75 | |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 70.37 | |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 81.63 | |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 79.56 | |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 80.25 | |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 72.67 | |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 75.15 | |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 74.28 | |
| k1 | 74.900 | 76.627 | 76.993 | ||
| k2 | 80.480 | 77.820 | 78.220 | ||
| k3 | 74.033 | 74.967 | 74.200 | ||
| R | 6.447 | 2.853 | 4.020 | ||
| 主次顺序 | A>C>B | ||||
| 优水平 | A2B2C2 | ||||
2.7 流动性分析
2.8 热重分析
山茶油及山茶油微胶囊的热重变化曲线如图9所示。由图9A可以看出,山茶油本身热稳定性较高,325 ℃左右开始分解,在此之前,由于其含水量极低,质量基本不发生变化;但当温度超过325 ℃后分解加速,至450 ℃仅有少量存余;超过470 ℃山茶油基本完全裂解,残余量<1%。而山茶油微胶囊在开始升温期间（25~200 ℃）,质量有所减少,这主要是微胶囊中所含的水分蒸发造成的,但由于受到微胶囊壁的保护作用,水分蒸发较缓慢,热重变化较小;当温度超过280 ℃,微胶囊壁材的稳定性下降,结构受热缓慢分解[13],质量逐渐下降,但下降幅度远低于山茶油;在470 ℃左右下降缓慢,达到550 ℃,山茶油微胶囊完全裂解,剩余部分为壁材混合物,残留质量为15.32%（图9B）。由此可知,山茶油微胶囊可以在一定程度上保持山茶油的稳定性,但高温（超过280 ℃）条件下也会导致以明胶和阿拉伯胶为主的壁材分解,因此山茶油微胶囊在贮藏期间或食品加工过程中,温度不宜过高。
2.9 氧化稳定性分析
从图10可以看出,微胶囊化山茶油初始AV（0.42 mg/g）和POV（2.53 meq/kg）均高于山茶油（0.35 mg/g,1.2 meq/kg）,这是由于在微胶囊制备过程中的乳化均质及后续干燥环节发生了氧化反应所致[14]。在(62±1)℃加速氧化贮藏试验中,微胶囊化前后山茶油的AV和POV均随贮藏时间的延长而增大,但山茶油微胶囊的AV和POV上升速率远低于山茶油。贮藏18 d后,山茶油微胶囊的AV为0.815 mg/g,而山茶油达到1.573 mg/g（图10A）。同时,由于未微胶囊化山茶油与氧气充分接触,其POV增加明显,在贮藏7 d时,其POV为12.61 meq/kg（图10B）,已超过国家标准GB 11765—2003的规定（茶籽油的POV≤12 meq/kg）,而山茶油微胶囊由于受到壁材的保护,有效阻隔了山茶油与氧气的直接接触,减缓了油脂氧化速率,贮藏17 d其POV为11.96 meq/kg,远低于未微胶囊化的山茶油（31.87 meq/kg）。因此,山茶油微胶囊化可有效提高山茶油的氧化稳定性,延长其贮藏时间。
3 讨论
目前,山茶油微胶囊化的研究多集中在喷雾干燥法[15,16,17,18],对复合凝聚法研究较少。复合凝聚过程实质是利用不同带电性质的壁材间通过静电相互作用、氢键以及疏水相互作用共同维持微胶囊的结构。凝聚pH、凝聚时间、壁材种类、壁材浓度、芯壁比等因素对微胶囊的形成和稳定性具有重要的影响。范方宇等[19]利用明胶和阿拉伯胶包埋山茶油,研究了壁材浓度、芯壁比、pH等凝聚条件对微胶囊包埋率的影响,结果表明,在壁材浓度3%、pH 4.6、壁芯比1∶3、反应温度55 ℃条件下山茶油微胶囊包埋率达88.49%。然而,通过壁材凝聚反应生成凝聚物的过程是可逆的,其在外观上虽然形成良好的微胶囊结构,但这种结构并不稳定,易受外界环境如温度、pH、离子浓度等影响而导致凝聚物重新溶解成溶胶态[20]。相关学者研究发现[21,22,23],利用甲醛、戊二醛、乙醛等固化剂与蛋白质发生共价交联作用可有效提高微胶囊结构的稳定性和抗机械能力,但使用甲醛、戊二醛等有毒化学物质作为固化剂,存在安全性问题。据此,张海洋[24]开展了邻苯二酚、绿原酸和茶多酚等酚类物质对微胶囊固化的可能性研究,发现邻苯二酚只有在多酚氧化酶存在下才有固化效果,绿原酸未见效果,而茶多酚处理后的微胶囊具有较好的耐热性,在80 ℃水浴30 min微胶囊形态几乎未发生变化,但目前将茶多酚作为固化剂应用到油脂微胶囊的固化工艺研究报道极少。
因此,本研究以明胶和阿拉伯胶为壁材,山茶油为芯材,茶多酚为固化剂,对山茶油微胶囊的复合凝聚工艺条件和抗氧化稳定性进行了研究。通过单因素试验发现,pH、凝聚时间、壁材浓度对微胶囊的包埋率及形态影响显著（P<0.05）,采用正交试验优化确定出复合凝聚制备山茶油微胶囊的最佳工艺参数为：壁材比1∶1（W/W）、pH 4.2、壁材浓度1.0%、凝聚时间30 min、芯壁比3∶2（W/W）,在此最佳条件下制备的山茶油微胶囊产品呈浅棕色粉末状,平均包埋率达82.36%,含水率低（3.67%）,流动性好（休止角39.2°）,热稳定性高（280 ℃）,且贮藏稳定性较未微胶囊化的山茶油显著提高。