百合（lilium spp.）属百合科百合属多年生草本鳞茎植物,兼具观赏、食用、和药用价值。观赏百合花大,花姿雅致,叶片青翠娟秀,茎干亭亭玉立,寓意百事合意,象征团圆、幸福纯洁,可用于庭院装饰、小型盆栽及切花等。但是百合在冷[1,2]、热[3,4]、干旱[5,6]、病毒[7,8]等逆境胁迫下抗性较弱的因素极大的限制了其推广应用,盲目引种不仅浪费人力、物力、财力,而且缺乏科学性。尤其在长江以南地区降水量大,容易产生洪涝等自然灾害,然而百合耐涝性相关研究目前尚未见报道,因此,开展百合耐涝性评价对抗性育种和引种驯化具有重要的指导意义。
植物响应淹水胁迫主要通过分子、生理与表型等方面调控。van Veen等[9]报道淹水胁迫首先会诱导乙烯等激素的积累,从而调控基因的表达。在拟南芥和水稻中的研究发现,淹水胁迫会诱导VII类ERFs转录因子RAP2.2/HRE1/HRE2/ Sub1A/SK1/SK2[10,11,12,13]、糖酵解途径中的ADH1/ PDC1/LDH1、糖代谢途径中SUS1/SUS4,乙烯合成途径中ACS7/ACO1[14]以及WRKY22[15]等基因转录调控。生理上,淹水胁迫主要影响植物的渗透调节、膜脂过氧化、活性氧的积累与清除、光合作用、呼吸作用等生理过程[16,17],这些生理过程还伴随着丙二醛、脯氨酸、SOD、POD、CAT、活性氧（ROS）、叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白等含量的变化[18,19]。表型上,部分植物会形成不定根、通气组织或皮孔,促进氧气的运输和有毒物质的释放[20,21]。随着淹水胁迫时间的延长,植物还会出现叶片黄化、萎蔫、茎秆褐化、水渍状溃烂,根系腐烂[22,23]等现象。不同植物在淹水胁迫下,其转录表达、生理指标、表型性状随植物耐涝性的大小呈现出差异,因此,可通过基因定量表达分析、生理指标检测、表型性状变化鉴定不同品种植物的耐涝性。基因定量表达分析和生理指标检测操作复杂,特别是评价较多品种时,需耗费大量人力、物力、财力,因此,建立精确的耐涝性表型性状评价体系可在短时间内进行大量品种的耐涝性鉴定,方法简便、快速、准确。
本研究拟通过百合在淹水胁迫后根、鳞茎、茎、叶的表型性状变化,建立观赏百合耐涝性表型性状量化评价标准,结合积分评价法和聚类分析法鉴定观赏百合耐涝性,以便快速筛选耐涝性百合品种,指导观赏百合引种和抗性育种。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验所用材料由上海市农业科学院收集保存,共计32份。包括16份亚洲百合（Asiatic lilies,A）、16份亚洲百合与麝香百合杂交系（LA）,种球围径均为14~16 cm。材料于2019年3月15日种植于盆径20 cm,高30 cm的花盆中,采用泥炭:珍珠岩:蛭石比例为3:1:1的基质,露天栽培,正常肥水管理。
1.2 方法
2019年6月,挑选生育期约90 d,生长一致,无病虫害的百合植株进行淹水胁迫实验。设置2个处理：（1）淹水处理（TR）。参考双套盆法,将百合植株带花盆浸入大的塑料箱中,淹水至土层以上2~3 cm,定期观察保证水位。（2）对照（CK）,无淹水处理,正常水分管理。每个处理设3次重复。试验于塑料大棚内进行,控制光照、温度、湿度等外界条件一致,每天定时观察植株受害程度,包括地上部植株的叶片形态和颜色以及淹水处茎的形态和颜色,根据预实验确定淹水处理的时间为13 d,并详细观察记录13 d时不同品种百合根、鳞茎、茎和叶涝害表型症状。13 d后将植株转移至正常生长条件,继续培养15 d,观察不同品种百合恢复生长情况。
1.3 数据处理
根据观察记录的百合表型性状分布特征,建立百合耐涝性表型性状量化评分体系。记录淹水胁迫下,不同品种百合量化评分结果,采用Microsoft Excel 2010软件分析数据,R 3.5.3分析百合根、鳞茎、茎、叶涝害性状特征分布（星状图、相关性分析图）以及百合耐涝性分类（聚类分析图）。
2 结果与分析
2.1 百合淹水胁迫处理后表型变化
百合在模拟淹水胁迫处理的前6 d,地上部表型性状变化与对照组无明显差异,未出现受害症状。7 d开始,‘Fangio’‘Levi’‘Fata Morgana’等品种下部叶片从叶尖开始出现黄化现象,‘Elodie’和‘Touchstone’下部叶片从叶尖开始呈现深紫色,未出现萎蔫,淹水处茎的形态和颜色与对照无差异。淹水胁迫9 d,超过一半的品种出现下部叶片黄化或变为深紫色现象,并从叶尖逐渐延伸至整个叶片,然后从下部叶片向上部叶片延伸。‘Fangio’‘Levi’‘Elodie’‘Viviana’‘Lancifolium Flore Pleno’‘Profundo’‘Souvenir’等品种接近2/3的叶片出现黄化或变为深紫色的现象,下部叶片完全黄化,并出现萎蔫下垂现象。淹水胁迫处理11 d,‘Fangio’‘Viviana’‘Sheer Blonde’‘Levi’等茎上出现少量棕褐色斑块。淹水胁迫处理13 d时,几乎所有胁迫处理品种均出现不同程度受害症状,‘Fangio’‘Viviana’‘Elodie’‘Levi’‘Passion Moon’‘Sheer Blonde’‘Fata Morgana’等整株叶片黄化或变为深紫色,部分植株叶片脱落,淹水处茎呈现黄褐色水渍状,手轻触表皮即溃散,茎秆整个变黄。而‘Brindisi’‘Nashville’‘Mynnou’等仅下部少数叶片尖端出现黄化或变为深紫色（图1）。‘Viviana’‘Lancifolium Flore Pleno’‘Profundo’‘Competition’‘Souvenir’等少数品种在2~3 d的时间内受害症状便从下部叶片蔓延至整个植株,受害症状发生短暂迅速。
图1 淹水胁迫对亚洲百合和亚洲百合与麝香百合杂种系表型性状影响A：亚洲百合涝害症状,B：LA百合涝害症状。 Fig. 1 Effects of waterlogging stress on phenotypic characters of Asiatic lilies and Asiatic lily and longiflorum lily hybrids A: Symptoms of waterlogging in Asiatic lilies; B: Symptoms of waterlogging in Asiatic lily and longiflorum lily hybrids. |
2.2 百合耐涝性形态指标量化评价方法的建立
表1 叶形态指标定级范围及评分标准Tab. 1 Leaf morphology index rating range and scoring criteria |
| 实测值定级范围 Grading of measured values | 表型 Phenotype | 得分 Scoring |
|---|---|---|
| Ⅰ | 叶片自然伸展,与对照一致。 | 7 |
| Ⅱ | 1/3以下叶片出现受害症状,叶片轻微萎蔫,叶尖出现黄化或变为暗紫色,少量叶片枯萎下垂。 | 5 |
| Ⅲ | 1/3以上,2/3以下叶片出现受害症状,受害叶片萎蔫,1/3以下叶片萎蔫下垂,黄化和变为暗紫色的现象从叶尖开始延伸至整个叶片。 | 3 |
| Ⅳ | 全部叶片出现受害症状,受害叶片萎蔫,1/3以上,2/3以下叶片枯萎下垂,下部叶片完全黄化或变为暗紫色。 | 1 |
| Ⅴ | 全部叶片萎蔫黄化,植株死亡。 | 0 |
表2 茎形态指标定级范围及评分标准Tab. 2 Stem morphology index grading range and scoring standard |
| 实测值定级范围 Grading of measured values | 表型 Phenotype | 得分 Scoring |
|---|---|---|
| Ⅰ | 颜色自然,与对照无差异 | 7 |
| Ⅱ | 少量暗褐色的水渍状斑点 | 5 |
| Ⅲ | 成片暗褐色水渍状 | 3 |
| Ⅳ | 全部变为暗褐色水渍状 | 1 |
| Ⅴ | 黄褐色,水渍状腐烂 | 0 |
表3 根形态指标定级范围及评分标准Tab. 3 Root morphology index rating range and scoring criteria |
| 实测值定级范围 Grading of measured values | 表型 Phenotype | 得分 Scoring |
|---|---|---|
| Ⅰ | 根系正常,与对照无差异 | 7 |
| Ⅱ | 根系1/3以下腐烂,腐烂根系水渍状 | 5 |
| Ⅲ | 1/3以上,2/3以下根系腐烂,腐烂根系内含物流出,呈水渍状空心,1/3以下根系因腐烂溶于基质无法收集 | 3 |
| Ⅳ | 全部根系腐烂,根系材料大部分腐烂溶于基质中,2/3以上根系腐烂无法收集 | 1 |
| Ⅴ | 全部根系腐烂,且无法收集,植株上只有少量根系 | 0 |
表4 鳞茎形态指标定级范围及评分标准Tab. 4 Scale range and scoring standard of bulb morphology index |
| 实测值定级范围 Grading of measured values | 表型 Phenotype | 得分 Scoring |
|---|---|---|
| Ⅰ | 鳞茎正常无腐烂迹象 | 7 |
| Ⅱ | 外层鳞片腐烂或脱落 | 5 |
| Ⅲ | 外层鳞片腐烂脱落,内层鳞片基部腐烂 | 3 |
| Ⅳ | 内层鳞茎水渍状腐烂脱落,鳞片外形完整 | 1 |
| Ⅴ | 鳞茎全部腐烂变软,脱落,鳞片外形不完整 | 0 |
2.3 百合耐涝性形态指标评价结果
表5 百合耐涝性形态指标评价结果Tab. 5 Evaluation results of waterlogging tolerance morphological index of lily |
| 种系Species | 英文名 Scientific name | 各指标量化结果Quantitative results of each index | 总计Total | 评价等级Grade | 恢复生长Recovery | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 叶Leave | 茎Stem | 根Root | 鳞茎Bulb | |||||
| A | Levi | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | Ⅲ | 植株死亡 |
| Fata Morgana | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | Ⅲ | 植株死亡 | |
| Elodie | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | Ⅲ | 植株死亡 | |
| Morpho Pink | 0 | 1 | 0 | 0 | 2 | Ⅲ | 植株死亡 | |
| Lancifolium Flore Pleno | 0 | 0 | 0 | 1 | 2 | Ⅲ | 植株死亡 | |
| Trendy Havana | 1 | 1 | 0 | 0 | 2 | Ⅲ | 植株死亡 | |
| Trendy Dakota | 0 | 3 | 0 | 0 | 3 | Ⅲ | 植株死亡 | |
| White Twinkle | 3 | 3 | 1 | 0 | 7 | Ⅱ | 植株死亡 | |
| Heartstrings | 3 | 3 | 3 | 1 | 10 | Ⅱ | 植株死亡 | |
| Tiny Rocket | 0 | 5 | 3 | 5 | 13 | Ⅱ | 部分死亡 | |
| Tribal Dance | 5 | 5 | 1 | 5 | 16 | Ⅱ | 长势较弱 | |
| Tribal Kiss | 3 | 5 | 1 | 7 | 16 | Ⅱ | 长势较弱 | |
| Pink Giant | 3 | 7 | 1 | 5 | 16 | Ⅱ | 部分死亡 | |
| Tresor | 3 | 7 | 3 | 7 | 20 | Ⅰ | 生长正常 | |
| Pink Flight | 3 | 5 | 5 | 7 | 20 | Ⅰ | 生长正常 | |
| Pearl Frances | 5 | 7 | 3 | 7 | 22 | Ⅰ | 生长正常 | |
| LA | Golden Stone | 1 | 1 | 3 | 7 | 12 | Ⅱ | 部分死亡 |
| Armandale | 0 | 7 | 1 | 5 | 13 | Ⅱ | 部分死亡 | |
| Bonsoir | 3 | 7 | 0 | 3 | 13 | Ⅱ | 长势较弱 | |
| Royal Sunset | 3 | 5 | 3 | 7 | 18 | Ⅰ | 生长正常 | |
| Albufeira | 3 | 7 | 3 | 7 | 20 | Ⅰ | 生长正常 | |
| Honesty | 3 | 7 | 3 | 7 | 20 | Ⅰ | 生长正常 | |
| Indian Summerset | 5 | 5 | 3 | 7 | 20 | Ⅰ | 生长正常 | |
| Beau Soleil | 5 | 5 | 3 | 7 | 20 | Ⅰ | 生长正常 | |
| Eyeliner | 3 | 5 | 5 | 7 | 20 | Ⅰ | 生长正常 | |
| Pavia | 3 | 7 | 5 | 7 | 22 | Ⅰ | 生长正常 | |
| Dynamix | 3 | 7 | 5 | 7 | 22 | Ⅰ | 生长正常 | |
| Merlet | 3 | 7 | 5 | 7 | 22 | Ⅰ | 生长正常 | |
| Flamington | 3 | 7 | 5 | 7 | 22 | Ⅰ | 生长正常 | |
| Mynnou | 5 | 7 | 3 | 7 | 22 | Ⅰ | 生长正常 | |
| Brindisi | 5 | 7 | 5 | 7 | 24 | Ⅰ | 生长正常 | |
| Nashville | 5 | 7 | 5 | 7 | 24 | Ⅰ | 生长正常 | |
相关性分析显示（图2B）,鳞茎与根、茎、叶均具有较高的相关性,相关系数分别为0.79、0.78、0.67,鳞茎腐烂的百合品种,其根、茎、叶受害程度较严重,鳞茎可能在百合耐涝性中起着重要作用。根系与叶的相关性较小,相关系数为0.58,因而,根系的受害程度对叶影响较小。根、鳞茎、茎、叶表型性状之间均呈现正相关,表明百合在受到淹水胁迫时,根、鳞茎、茎、叶涝害症状变化趋势一致。
2.4 百合耐涝性综合评价
百合耐涝性表型性状综合评价采用聚类分析和积分评价法。聚类分析采用K-means算法,对百合根、鳞茎、茎、叶各个组织器官的表型性状近似程度进行聚类（图3）。聚类分析结果将32份供试观赏百合划分为为3类,结合淹水胁迫百合涝害症状,3类聚类结果分别归为敏感型、中间型、耐涝型。其中,敏感型百合品种包括‘Levi’‘Fata Morgana’‘Elodie’‘Morpho Pink’‘Lancifolium Flore Pleno’‘Trendy Havana’‘Trendy Dakota’‘White Twinkle’‘Heartstrings’;耐涝型百合品种包括‘Tresor’‘Pink Flight’‘Royal Sunset’‘Honesty’‘Dynamix’‘Merlet’‘Indian Summerset’‘Beau Soleil’‘Eyeliner’‘Pavia’‘Flamington’‘Mynnou’‘Nashville’‘Brindisi’;中间型百合品种包括‘Tiny Rocket’‘Tribal Dance’‘Tribal Kiss’‘Pink Giant’‘Pearl Frances’‘Golden Stone’‘Armandale’‘Bonsoir’‘Albufeira’。聚类分析结果结合积分评价法对比不同品种积分差异,鉴定出‘Nashville’‘Brindisi’为极端耐涝品种,‘Levi’‘Fata Morgana’为极端敏感品种。
2.5 百合耐涝性评价体系建立
聚类分析根据表型性状受害程度将32份观赏百合分为淹水胁迫耐涝型、中间型和敏感型,分别对耐涝型、中间型和敏感型观赏百合表型性状各指标特征分布进行分析。星状图分析显示（图4）,淹水胁迫敏感型观赏百合各组织器官表型指标较小,即表型上表现为鳞茎、根、茎、叶涝害症状普遍较严重,如‘Levi’‘Fata Morgana’鳞茎、根完全腐烂,淹水处茎腐烂呈水渍状,茎内部腐烂中空,叶片完全黄化萎蔫,恢复正常生长条件,植株死亡;淹水胁迫中间型观赏百合各组织器官表型指标差异较大,存在单个或多个极端最小值,表型上表现为部分组织涝害程度中等,但个别组织涝害症状严重,如‘Golden Stone’鳞茎和根受害程度较轻,茎和叶受害较严重,‘Bonsoir’鳞茎、茎、叶受害较轻,根系严重腐烂,恢复正常生长条件,植株长势较弱或部分植株死亡;淹水胁迫耐涝型观赏百合大部分组织器官表型指标较高,表型上表现为大部分组织器官受害较轻,少数器官受害程度中等,在淹水胁迫处理13 d后,恢复正常生长条件,植株经过一段时间缓苗后,可正常生长。根据各表型指标特征分布及表型观测结果,初步建立观赏百合耐涝性评价体系（表6）,以便其他品种观赏百合耐涝性鉴定。
图4 耐涝型、中间型、敏感型观赏百合表型性状特征分布Fig. 4 Distribution of phenotypic characteristics of waterlogging-tolerant, intermediate and sensitive ornamental lily |
表6 百合耐涝性评价体系建立Tab. 6 Establishment of waterlogging tolerance evaluation system for lily |
| 评价等级 Grade | 耐涝性 Resistance | 综合评分 Score | 特征描述 Character description |
|---|---|---|---|
| Ⅰ | 耐涝型 | <7 | 植株叶片正常或1/3以下出现受害症状,叶片轻微萎蔫,叶尖出现黄化或变为暗紫色,少量叶片枯萎下垂;茎正常或少量暗褐色的水渍状斑点;根系正常或1/3以下根系腐烂;鳞茎正常或外层鳞片腐烂脱落;存在个别组织出现Ⅱ类表型。恢复生长条件后不能正常生长,植株死亡。 |
| Ⅱ | 中间型 | 7~18 | 植株叶片黄化萎蔫程度介于1/3~1之间;淹水处茎呈现大片褐色水渍状;鳞茎盘腐烂,鳞茎脱落呈水渍状;根系大部分腐烂;部分组织出现Ⅰ类表型,受害症状严重。恢复生长条件后植株不能正常生长,长势较差,或部分植株死亡。 |
| Ⅲ | 敏感型 | ≥18 | 植株叶片完全黄化萎蔫;淹水处茎呈水渍状腐烂,内部中空;内外鳞茎均腐烂变软呈水渍状;根系完全腐烂,内含物流出,呈水渍状中空。恢复生长条件后植株正常生长。 |
3 讨论
3.1 耐涝性表型性状量化评价方法的科学性
植物受到淹水胁迫时主要表现为分子、生理、表型上的变化,植物所携带的遗传物质决定了植物耐涝性的大小。遗传物质通过转录翻译,调控生理过程,分子与生理调控能力的大小最终决定了淹水胁迫时植物表型上健康与涝害的程度,相反,植物表型性状健康与受害的程度反映了植物的生理状态和分子调控能力的大小。近年来,许多研究者越来越重视表型性状的研究,通过高通量表型性状的采集反映植物的生理状态,以便生产上作出更科学的决策。本研究为克服表型性状变化多样,没有固定的变化模式问题,前期通过大量淹水胁迫预试验,增加调查频率等手段采集百合在淹水胁迫过程中根、鳞茎、茎、叶的表型性状整体变化趋势,为每一个量化评分划分一个严格的评分区间,精确地反映百合受害的状态。宋钊等[22]对辣椒的耐涝性鉴定中通过形态学方法成功鉴定出1个耐涝品种和2个敏感品种,郑佳秋等[23]以叶片脱落性、叶片颜色、叶片形状、茎颜色和茎形态为指标建立了辣椒耐涝评价标准,尹冬梅等[24]叶色、叶形态、茎色、茎形态4个外观形态指标建立了菊花的耐涝性评价体系,阙友雄等[25],张常青等[26]也利用了表型性状对甘蔗黑穗病抗性和地被菊耐旱性进行评价。因此,表型性状变化可用于植物抗性鉴定,本文在前人研究基础上增加了表型性状的特征分布、相关性分析,分析了表型性状在耐涝性鉴定中可能存在的误差,实际应用中可通过特征分布与相关性分析剔除可能存在误差的品种和优化表型性状指标,另外引入了聚类分析法和积分评价法结合分析弥补传统上单纯应用积分高低经验性鉴定植物抗性的缺陷。
3.2 淹水胁迫对百合表型性状的影响
百合在受到淹水胁迫时,根系由根尖开始腐烂,呈现水渍状;鳞茎先由外层不健康鳞片开始腐烂,接着鳞茎盘开始腐烂,最后鳞片腐烂变软;茎首先在淹水处出现褐色斑块,然后斑块扩大延伸至整个茎秆;叶由叶尖至叶柄,由下至上出现黄化或变为深紫色,并伴随着叶片萎蔫。猕猴桃受淹水胁迫时地上部叶片由叶缘或叶尖开始出现黄化和萎蔫现象,最后干枯,根系腐烂并发黑[27]。玉米在淹涝缺氧时茎生长缓慢、植株矮小、叶片萎蔫黄化[28]。牡丹在淹水胁迫时叶片萎蔫并逐渐干枯[29]。番茄[30]、西瓜[31]、葫芦[32]、大豆[33]等出现了不定根、皮孔等通气组织。百合与其他植物在表型上受害症状一致,但未出现不定根、皮孔等现象。大部分百合品种各组织器官受害程度呈现相同的变化趋势,少数品种单个组织器官呈现出与其他器官不同的变化趋势（图4）,原因可能与不同品种百合组织结构有关,因此,单个性状对耐涝性评价结果可能带有局限性。
鳞茎表型与根、茎、叶表型具有较高的相关性（图2B）,鳞茎腐烂的百合品种,其根、茎、叶受害程度较严重,鳞茎在百合耐涝性中起着重要作用,可能是由于百合鳞茎存储大量的营养[34]以及氧气等有益物质,可短暂缓解观赏百合在淹水胁迫中代谢受阻的问题,从而缓解观赏百合其他器官的受损害程度。根系与茎、叶的相关性较小（图2B）,可能是百合鳞茎起到了代替根系营养供应的功能。Jackson等[35]指出糖类代谢和能量转化是决定植物耐涝性的重要因素,黄瓜[36]、绿豆[37]、玉米[38]、小麦[39]等受淹水胁迫的影响均观测到糖代谢和能量代谢的差异。因此,不同耐涝型百合耐涝性差异可能是由遗传背景造成的鳞茎糖代谢和能量代谢差异所决定的。
3.3 百合耐涝性鉴定结果及应用
极端降水、地下水位上升、不合理的灌溉等因素严重影响百合的引种栽培,筛选培育耐涝性强的百合品种对节省管理成本,提高观赏品质具有重要意义。百合耐涝性表型性状鉴定体系的完善,可以指导百合耐涝性品种选育和耐涝性强百合品种的引种,促进百合产业的发展。百合耐涝性表型性状鉴定体系具有操作简单,节省成本的优点,适合生产上推广应用。
4 结论
本研究调查了16份A系百合和16份LA系百合和品种受到淹水胁迫时根、鳞茎、茎和叶的表型变化,根系由根尖开始腐烂,呈现水渍状;鳞茎先由外层不健康鳞片开始腐烂,接着鳞茎盘开始腐烂,最后鳞片腐烂变软;茎首先在淹水处出现褐色斑块,然后斑块扩大延伸至整个茎秆;叶由叶尖至叶柄,由下至上出现黄化或变为深紫色,并伴随着叶片萎蔫。建立了根、鳞茎、茎、叶的量化评价方法,相关性分析结果显示,鳞茎表型与根、茎、叶表型具有较高的相关性,根系与茎、叶的相关性较小。聚类分析法鉴定出了16个耐涝型品种,9个中间型品种和7个敏感型品种。积分评价法从32个观赏百合品种中鉴定出2个极端敏感型品种‘Levi’‘Fata Morgana’和2个极端耐涝型品种‘Nashville’‘Brindisi’。供试A系百合在淹水胁迫耐涝型、中间型、敏感型中均有分布,耐涝性差异较大,LA系百合主要分布于中间型和耐涝型,耐涝性普遍较强。