香蕉（Musa spp.）与柑橘、葡萄、苹果共同被联合国粮农组织列为世界四大水果。但近年来,香蕉枯萎病在世界大部分的种植区域爆发,导致香蕉种植面积急剧减少,香蕉市场受到严重打击[1,2],因此探究香蕉枯萎病防御反应的分子机理对于枯萎病的防治意义重大。
TGA转录因子是bZIP（basic leucine zipper,bZIP）家族的D亚族[3],能够特异性识别并结合TGACG为核心的激活序列（activation sequence, as-1）,调节下游靶标基因的表达,在调节植株抗性及花器官发育中发挥着重要作用[4]。研究表明as-1是PR-1中启动子的顺式作用元件,而水杨酸（salicylic acid, SA）介导的信号转导途径中病程相关基因NPR1可以增强TGA与PR的结合,提高植物抗病能力[5]。因此植物受到病害时SA积累,NPR1解聚成单体在细胞核内与TGA因子相互作用,促进PR基因的表达,提高植物的抗病性[6,7]。
自TGA转录因子首次在烟草发现后,拟南芥中分离鉴定出10个TGA转录因子,可分为5类：第Ⅰ类AtTGA1和AtTGA4、第Ⅱ类AtTGA2、AtTGA5、AtTGA6、第Ⅲ类AtTGA3和AtTGA7、第Ⅳ类AtTGA9和AtTGA10、第Ⅴ类AtPAN[8]。其中AtTGA1-AtTGA7基因广泛参与植物抗病反应引起的基础抗性和系统获得抗性（Systemic Acquired Resistance, SAR）[9,10]。随后,在水稻[11]、苹果[12]、小麦[13]等多种植物中发现TGA转录因子家族。研究发现苹果中MdTGA2.1、水稻中rTGA2.1、rTGA2.2、rTGA2.3、烟草中TGA2.2等转录因子均能与拟南芥中的NPR1相互作用,说明不同物种TGA成员均能够启动植物抗病性[14]。到目前为止,香蕉中TGA转录因子家族的研究尚未见报道。因此,本研究基于香蕉基因组数据库,通过生物信息学技术系统分析香蕉TGA转录因子家族成员,并进一步研究其在枯萎病菌胁迫下的表达分析,为阐明TGA转录因子参与香蕉枯萎病防御反应的分子机理提供理论依据,为植物的抗性育种提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 香蕉TGA转录因子家族序列检索
以拟南芥TGA转录因子成员蛋白序列为查询序列,在香蕉基因组数据库（ https://banana-genome-hub.southgreen.fr/）中进行Blastp同源序列比对,E值≤1×10-5。搜索并获得香蕉所有TGA转录因子的相关序列,以进行后续生物信息学分析。
1.2 香蕉TGA转录因子生物信息学分析
使用在线软件ExPASy（ https://web.expasy.org/protparam/）,分析所有成员基因所编码蛋白质的基本特性;运用Gene Structure Display Server（GSDS）网站（ http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析成员基因内含子/外显子数量分布;采用邻接法通过MEGA 7软件构建所有成员基因种内进化树;利用SMART网站（ http://smart.embl-heidelberg.de/）进行蛋白质结构预测;利用PRABI网站中SOPMA（ https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）分析蛋白质二级结构,包括α螺旋、延伸链、β折叠和无规卷曲;利用SWISS-MODEL网站（ https://swissmodel.expasy.org/）进行蛋白三维结构同源建模分析;采用在线网站（ http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测成员的蛋白信号肽;使用在线网站（ http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测成员跨膜结构;以在线网站MBC（ https://cello.life.nctu.edu.tw/）对所有成员基因进行亚细胞定位预测。
1.3 香蕉TGA蛋白系统发育树构建及多序列比对
使用在线Phytozome（ https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）网站,以TGA为关键词搜索其他物种的TGA蛋白,下载不同植物所有TGA家族成员的氨基酸序列。与水稻和拟南芥的TGA转录因子家族进行多序列比对,通过MEGA 7.0构建系统进化树,采用邻接法在默认参数下生成系统发育树[15]。
1.4 香蕉‘威廉斯’和‘南天黄’TGA转录因子表达分析
易感香蕉枯萎病品种‘威廉斯’和抗香蕉枯萎病品种‘南天黄’由广州石生源生物科技发展有限公司提供。选取健康、长势一致的香蕉苗,采用蘸根接菌法将抗、感病品种的香蕉苗植株根系分别浸泡在配制好的Fusarium oxysporum f. sp. Cubense race 4（Foc TR4）孢子悬浮液（1×106孢子/mL）中2 h。取样时间为接种Foc TR4后0、2、4、6 d,每个时间点分别取3株香蕉根系混合,迅速置于液氮中,-80 ℃保存。
利用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取上述香蕉根系样品的总RNA,通过RNA的完整性、纯度及浓度检测后,将质量符合要求的RNA利用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara）试剂盒逆转录合成cDNA。最后利用Primer Primer 5.0软件设计定量引物,以香蕉Actin基因为内参（引物序列如表1）,反应程序为95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40个循环,每个反应重复3次。
表1 香蕉TGA转录因子家族成员及内参定量引物Tab. 1 Quantitative prime of members of banana TGA transcription factor family and internal reference |
| 基因名称 Gene name | 上游引物（5°-3°） Forward primer (5°-3°) | 下游引物（5°-3°） Reverse primer(5°-3°) |
|---|---|---|
| MaActin | CGAGGCTCAATCAAAGA | ACCAGCAAGGTCCAAAC |
| MaTGA1 | GCTTCTCAGTTCCTCGTA | TGTCTTCTTCGGTTTCTC |
| MaTGA2 | TATCCGAAATAAACAGGC | GCTAAGAGTTCCACCACC |
| MaTGA3 | CAGCACGGCAACAGGGAA | CACCAGGGCGGACATAAGAA |
| MaTGA4 | GAACCTCTGGTGTTTCGGATTA | CTGCTTGGCGGACTGTGA |
| MaTGA5 | TGGGACAGATGGTGAATG | ACGAAGGCGTTGGAAGTA |
| MaTGA6 | CTCTGGATTGGCGGATTT | GCATTTGCCATCTGTTCC |
| MaTGA7 | ATGGAACAGATGGCAAAT | AAGGCGTTGGAAATAGTC |
| MaTGA8 | AAGTGGTGCCTCCATGACAG | TGTCTTGGCATCAAGTTGCTT |
| MaTGA9 | AATCGGACTTTCCAAATAGC | GAAGCACCACTTGCCATC |
1.5 数据处理
所有试验数据由Excel 2010软件和SPSS 24.0软件进行统计分析,对同一处理随时间变化的差异性采用LSD（Least Significant Difference）多重比较分析,利用Excel 2010软件绘图。
2 结果与分析
2.1 香蕉TGA转录因子家族成员的鉴定与分析
本研究使用拟南芥TGA转录因子家族的序列作为参照序列,在香蕉中共鉴定得到9个TGA转录因子家族成员（表2）。9个TGA基因主要定位在香蕉的Chr.02、Chr.03、Chr.04、Chr.05、Chr.07、Chr.08和Chr.11染色体上,将它们命名为MaTGA1~MaTGA9。香蕉MaTGA转录因子的氨基酸残基数在261~499 aa之间,分子质量（MW）在29.60~54.93 kD之间;蛋白等电点（pI）为5.22~8.87之间,7个成员在酸性范围内,表明该家族蛋白富含酸性氨基酸。利用MBC分析预测香蕉MaTGA转录因子家族成员蛋白的亚细胞定位,发现MaTGA5定位于细胞外,其余MaTGA成员定位于细胞核。
表2 香蕉TGA转录因子家族成员基本信息Tab. 2 Basic information of TGA transcription factor family members in banana |
| 转录因子 Transcription factors | 基因ID Gene ID | 所在染色体 Chromosome | 氨基酸残基数 Number of amino acids/aa | 等电点 Isoelectric point | 分子量 Molecular weight/kD | 亚细胞定位 Subcellular localization |
|---|---|---|---|---|---|---|
| MaTGA1 | Ma02_g02920 | Chr.02 | 499 | 6.29 | 54.93 | 细胞核 |
| MaTGA2 | Ma03_g23820 | Chr.03 | 467 | 6.44 | 51.88 | 细胞核 |
| MaTGA3 | Ma04_g02730 | Chr.04 | 261 | 5.22 | 29.60 | 细胞核 |
| MaTGA4 | Ma05_g19490 | Chr.05 | 382 | 8.48 | 42.42 | 细胞核 |
| MaTGA5 | Ma05_g30630 | Chr.05 | 270 | 5.26 | 30.62 | 细胞外 |
| MaTGA6 | Ma07_g20620 | Chr.07 | 369 | 6.48 | 41.58 | 细胞核 |
| MaTGA7 | Ma10_g30440 | Chr.08 | 351 | 8.87 | 40.01 | 细胞核 |
| MaTGA8 | Ma11_g13030 | Chr.11 | 486 | 6.26 | 54.05 | 细胞核 |
| MaTGA9 | Ma11_g24520 | Chr.11 | 484 | 6.77 | 53.33 | 细胞核 |
通过SMART网站对香蕉的TGA转录因子家族蛋白功能结构域进行分析,发现香蕉MaTGA成员蛋白均具有DOG1结构域,该结构域包括TGA蛋白和PERIANTHIA蛋白;MaTGA3和MaTGA5蛋白中无bZIP结构域,其余成员都含有bZIP结构域,bZIP结构域中包含介导序列特异性DNA结合的碱性区域和二聚化所需的亮氨酸拉链区域的蛋白质（图3）。
运用SOPMA进行蛋白二级结构预测,结果显示MaTGA家族主要由α螺旋、延伸链、β折叠和无规卷曲组成（图4）。
2.2 多序列比对及种间进化树分析
将拟南芥（10个）AtTGA家族成员、水稻（15个）OsbZIP家族成员和香蕉（9个）MaTGA家族成员蛋白构建进化树,发现香蕉MaTGA家族种间进化树可分为Class Ⅰ、Class Ⅱ 2类（图5）。Class Ⅰ分为a、b两个亚支,Class Ⅰa中有4个香蕉TGA成员（MaTGA1、MaTGA2、MaTGA8、MaTGA9）、6个拟南芥TGA成员和13个水稻TGA成员;Class Ⅰb中有3个香蕉TGA成员（MaTGA4、MaTGA6、MaTGA7）、4个拟南芥TGA成员和2个水稻TGA成员;Class Ⅱ亚支有MaTGA3、MaTGA5两个成员,该亚支与水稻和拟南芥没有同源基因。比较三个物种的遗传关系,发现香蕉TGA转录因子与同为单子叶植物的水稻TGA转录因子遗传关系更为相近。
图5 拟南芥、水稻和香蕉中TGA蛋白的系统发育分析Fig. 5 Phylogenetic analysis of TGA proteins in Arabidopsis, rice and banana AtTGA1: NC_003076.8;AtTGA2: NC_003076.8;AtTGA3: NC_003070.9;AtTGA4: NC_003076.8;AtTGA5: NC_003076.8;AtTGA6: NC_003074.8;AtTGA7: NC_003070.9;AtPAN: NC_003070.9;AtTGA9: NC_003070.9;AtTGA10: NC_003076.8; OsbZIP03: NC_029256.1;OsbZIP08: NC_029256.1;OsbZIP11: NC_029256.1;OsbZIP17: NC_029257.1;OsbZIP28: NC_029258.1;OsbZIP37: NC_029259.1;OsbZIP41: NC_029260.1;OsbZIP47: NC_029261.1;OsbZIP49: NC_029260.1;OsbZIP63: NC_029262.1;OsbZIP64: NC_029263.1;OsbZIP70: NC_029264.1;OsbZIP74: NC_029264.1;OsbZIP79: NC_029266.1;OsbZIP 83: NC_029267.1 |
多序列比对结果显示,TGA转录因子家族中重要的bZIP和DOG1结构域、氨基酸残基在不同物种间高度保守（图6）。其中bZIP结构域,一部分由14个氨基酸残基组成保守的DNA结合位点,即碱性区域,该区域C-端具有核定位信号（nuclear localization signals,NLS）;一部分是参与形成二聚体的亮氨酸拉链区域,其N-末端的碱性区域与碱性区域紧密结合。
图6 物种间TGA转录因子家族多序列比对Fig. 6 Multiple sequence alignment of TGA transcription factor families between species AtTGA1: NC_003076.8;AtTGA2: NC_003076.8;AtTGA3: NC_003070.9;AtTGA4: NC_003076.8;AtTGA5: NC_003076.8;AtTGA6: NC_003074.8;AtTGA7: NC_003070.9;AtPAN: NC_003070.9;AtTGA9: NC_003070.9;AtTGA10: NC_003076.8; OsbZIP03: NC_029256.1;OsbZIP08: NC_029256.1;OsbZIP11: NC_029256.1;OsbZIP17: NC_029257.1;OsbZIP28: NC_029258.1;OsbZIP37: NC_029259.1;OsbZIP41: NC_029260.1;OsbZIP47: NC_029261.1;OsbZIP49: NC_029260.1;OsbZIP63: NC_029262.1;OsbZIP64: NC_029263.1;OsbZIP70: NC_029264.1;OsbZIP74: NC_029264.1;OsbZIP79: NC_029266.1;OsbZIP 83: NC_029267.1 |
2.3 TGA转录因子家族成员在香蕉‘威廉斯’及‘南天黄’表达分析
为确定香蕉中TGA转录因子家族成员是否参与Foc TR4的胁迫,利用RT-qPCR检测香蕉感、抗病品种在Foc TR4侵染不同时间后TGA转录因子家族成员的表达情况。结果表明,接种Foc TR4后,在感、抗病两个香蕉品种中MaTGA2、MaTGA3及MaTGA8表达量显著下调,而MaTGA4和MaTGA5在易感品种被诱导上调表达（图7）。其中MaTGA4在威廉斯中的表达量呈上调趋势,4 d时表达量最高,是0 d时（CK）的2.5倍。MaTGA5同MaTGA4,在易感品种威廉斯侵染Foc TR4 6 d时达最高,为0 d时（CK）表达量的3.7倍。感、抗品香蕉品种中的MaTGA2、MaTGA3及MaTGA8在Foc TR4侵染下被迅速诱导下调表达,与0 d时相比,表达量受到严重抑制。而MaTGA1、MaTGA6、MaTGA7及MaTGA9在感、抗病香蕉品种呈先降后上升的趋势（图7）。因此推测MaTGA2、MaTGA3及MaTGA8是介导香蕉抗枯萎病的关键基因。
图7 接种Foc TR4后香蕉‘威廉斯’及‘南天黄’中TGA转录因子家族成员表达分析小写字母表示差异显著（P<0.05）;大写字母表示差异极显著（P<0.01）。 Fig. 7 Expression analysis of TGA transcription factor family members in banana ‘Williams’ and ‘Nantianhuang’ after inoculated of Foc TR4 Lowercase letters indicate significant difference (P<0.05); Capital letters indicate significant difference (P<0.01). |
3 讨论
转录因子是与转录机制的其他成分相互作用的DNA结合蛋白,以募集或阻止RNA聚合酶进入基因启动子[16],在某些情况下,转录因子可以调节多个基因的表达[17]。据报道研究最多的WRKY转录因子和MYB转录因子家族参与植物对病原体的防御[18,19]。此外,一些研究报道了含有碱性亮氨酸拉链结构域（bZIP）的转录因子,在植物中,调节基因以响应非生物胁迫,种子成熟,花朵发育和病原体防御[20]。本文利用拟南芥TGA转录因子,首次在全基因组水平对香蕉TGA转录因子家族成员进行鉴定,获得9个TGA转录因子成员。蛋白理化性质表明香蕉TGA蛋白富含酸性氨基酸。蛋白结构预测和序列比对发现,MaTGA蛋白中DOG1结构域和bZIP结构域高度保守。研究表明,bZIP结构域中碱性区域通过固定的核定位信号结构N-X7-R/K-X9与DNA结合,从而决定DNA的特异性以及核定位作用[21];对MaTGA蛋白进行二级结构预测,分析表明所有蛋白均具有α螺旋、延伸链、β折叠和无规卷曲结构,且以α螺旋为主,三级结构同源建模发现与bZIP典型三维结构相似[22]。亚细胞定位发现香蕉TGA转录因子主要在细胞核内,与其他植物TGA转录因子所报道的一致[23,24],说明香蕉TGA转录因子在细胞核内发挥作用。
香蕉MaTGA转录因子家族在进化上分为ClassⅠ和ClassⅡ两类,与基因结构及DOG1和bZIP结构域的分布高度一致,通过香蕉与拟南芥和水稻TGA蛋白进化关系远近,推测香蕉TGA转录因子家族基因的生物学特性和功能。其中ClassⅠ分为a、b两个小亚组,ClassⅠa分支中香蕉MaTGA1、MaTGA2、MaTGA8、MaTGA9成员与拟南芥AtTGA2、AtTGA5、AtTGA6、AtTGA9、AtTGA 10、AtPAN成员为同一分支。研究发现拟南芥中AtTGA2、AtTGA5、AtTGA6任一基因缺失,仅3个基因同时缺失则不诱导防御相关PR1基因表达,说明AtTGA2、AtTGA5、AtTGA6参与植物的抗性[10];AtTGA9、AtTGA10、AtPAN三个基因突变导致拟南芥花表型改变[25,26];因此,推测ClassⅠa分支的MaTGA1、MaTGA2、MaTGA8、MaTGA9转录因子依赖于NPR1抗病信号转导途径提高植物抗病性,且与植物花器官发育有关。ClassⅠb分支中香蕉MaTGA4、MaTGA6、MaTGA7成员与拟南芥AtTGA1、AtTGA3、AtTGA4、AtTGA7成员为同一分支。AtTGA4与乙烯反应因子（ERF）相互作用,进一步调控植物抗病反应[27];AtTGA3与ARR2相互作用并在细胞分裂素（CTK）作用下与PR1启动子结合提高植物抗病性[28];推测该分支上的MaTGA4、MaTGA6、MaTGA7转录因子既可依赖NPR1信号转导途径又依赖其他抗病信号转导途径来调节植物抗病性。
越来越多的研究发现,TGA转录因子在植物生物胁迫和非生物胁迫反应中起重要作用[29,30]。草莓[31]中的FaTGA在白粉病侵染过程中,通过SA信号途径响应植物抗病;小麦[13]中TaTGA1对白粉菌胁迫亦有响应;黄瓜[32]中CsbZIP120遗传转化至拟南芥,过表达株系对灰霉菌抗性增强。本研究对香蕉TGA转录因子成员在感、抗病品种上的生物胁迫基因表达分析发现,接种Foc TR4后,不同时间下MaTGA转录因子成员在感、抗病香蕉品种的诱导表达响应程度不同,表达差异明显,如MaTGA4和MaTGA5,在威廉斯中被诱导上调表达,MaTGA2、MaTGA3及MaTGA8,在感、抗香蕉品种中相对表达量被下调最明显。表明MaTGA2、MaTGA3及MaTGA8可能参与香蕉抗枯萎病过程,且在抗病过程中可能具有重要的负调控作用。本课题组将进一步深入挖掘关键TGA转录因子在香蕉枯萎病防御反应过程的分子机制,为香蕉枯萎病的防治提供理论依据。