油茶是山茶属（Camellia）植物中种子含油率较高、具有一定栽培经济价值的树种的总称,原产和主栽于中国,与椰子、油棕、油橄榄并称为世界四大木本油料植物[1,2],其主要产品茶油的不饱和脂肪酸含量高达90%,被誉为“东方橄榄油”“油中软黄金”和“长寿油”[3,4],已成为联合国粮农组织重点推广的健康型食用油[5]。其副产物果壳、茶粕等经加工也是重要的医药、化工等工业原料[6]。陆川油茶（Camellia vietnamensis）也称越南油茶、高州油茶,分布于越南、老挝和我国广东、海南、广西等省（区）,在海南和广西广为种植,是我国继普通油茶和小果油茶之后,栽培面积居第3位的重要油茶种[1]。陆川油茶枝叶茂密,开花时满树繁花;抗性强,在干旱贫瘠的生境条件下也能正常生长;其果实大于普通油茶,且果大籽多,在适宜生态环境下年产油可达1050 kg/hm2,集观赏、生态和经济价值于一身,极具发展潜力[7]。
研究表明,油茶属于自花不孕、异花授粉植物,自交不亲和[8]、授粉受精不良、花期不遇等原因导致其单株产果率差异大、大小年明显等低产低效现象,已成为油茶产业发展的瓶颈问题[9]。陆川油茶也存在同样问题,致使其潜在优势尚未得以利用。生产上常需要人工辅助授粉和配植授粉树的方法来解决,而陆川油茶花粉在自然条件下寿命短,低温贮藏花粉可以适当延长花粉的寿命,既可解决因花期不遇、异地授粉问题,又可使种质资源以花粉的形式保存,为杂交育种培育新品种解决了花粉的时空限制,是一种简便经济、应用广泛的花粉保存方法[10],此外,花粉正常萌发是确保成功受精的前提,花粉能否成功萌发除与自身活力有关外,还与外部环境条件密切相关,培养基成分及其浓度对花粉萌发率和花粉管生长有很大影响,适宜花粉的萌发培养基成分因植物不同而异[11],温度是保证花粉内各种酶促反应正常进行的重要外界条件[12]。通过花粉离体萌发研究,探讨提高花粉萌发率的培养条件,可为调控花粉萌发有效途径、人工辅助授粉提供理论指导。因此,开展油茶花粉贮藏和离体萌发条件的研究显得格外重要。
目前,我国在油茶品种选育、良种繁育、丰产栽培及加工利用等方面的研究取得了可喜成就[13],对油茶花粉活力、花粉数量、贮藏特征及柱头可授性也进行了一系列的研究[14,15]。但有关陆川油茶花粉贮藏和离体萌发条件的研究罕见报道,缺乏对其花粉较为系统的研究,陆川油茶花期遇雨季和采用喷雾法进行人工授粉时,花粉泡在水中是否影响花粉活力?也未见不同湿度下陆川油茶花粉活力的研究,使得进行人工授粉时仍存在一定的盲目性,严重制约了陆川油茶的进一步发展。为此,本研究以陆川油茶花粉为试验材料,研究不同湿度、不同贮藏温度和时间对花粉活力的影响,筛选出陆川油茶花粉贮藏的条件,同时研究其离体萌发的适宜条件,为解决陆川油茶自交不亲和、授粉受精不良、花期不遇等问题提供理论基础,也为油茶人工辅助授粉和杂交育种提供实践指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料
试验植株位于广西壮族自治区林业科学研究院老虎岭油茶种质资源收集圃（22°56′ N,108°21′ E）,地处南宁市市郊,属湿润的亚热带季风气候,年均温20~21 ℃,1月平均气温11.8 ℃以上,7月平均气温27.6 ℃,年均降雨量达1304.2 mm,平均相对湿度为79%。选择生长健康的5年生陆川油茶优良无性系作为试验材料,于大蕾期采摘植株上带有待开花蕾的枝条,带回实验室,常温下进行水培,待花蕾开放、花药开裂后,将花粉抖落在铺有硫酸纸的培养皿中,收集花粉,备用。
1.2 方法
1.2.1 不同湿度下花粉活力测定 取新鲜花粉均匀分为2组（泡水、干燥）分别放入称量瓶中,泡水组：向称量瓶中加入蒸馏水浸泡花粉,用解剖针搅拌均匀,分别泡水0、3、6、12、24、36、48 h;干燥组：将盛有花粉的称量瓶放入25 ℃人工气候箱内干燥,分别干燥0、3、6、12、24、36、48 h。采用TTC法[16]检测花粉活力。每个处理设置3个重复,每个重复观察5个视野,计算花粉活力,花粉活力=视野中显红色或粉红色的花粉粒数/视野中总花粉粒数×100%。
1.2.2 不同贮藏条件下花粉活力测定 将收集的新鲜花粉分为8组：RT新鲜（常温条件下新鲜花粉放入2 mL离心管,密封,每管花粉量为1/10离心管体积,下同）、4 ℃新鲜、-20 ℃新鲜、-80 ℃新鲜、RT干燥（常温条件下新鲜花粉放入2 mL离心管中,每管花粉量为1/10离心管体积,置于装有硅胶的小瓶密封,其他干燥处理相同）、4 ℃干燥、-20 ℃干燥、-80 ℃干燥,分别于贮藏后的第0、5、10、15、20、25、30、60、90、120、150、180天,采用TTC法检测花粉活力。每个处理设置3个重复,每个重复观察5个视野,计算花粉活力,花粉活力=视野中显红色或粉红色的花粉粒数/视野中总花粉粒数×100%。
1.2.3 花粉的离体萌发 花粉萌发采用液体培养法,液体培养基的主要成分：蔗糖、H3BO3、MgSO4。试验设计：（1）单因素试验：对蔗糖、H3BO3、MgSO4、pH、温度5个因素进行单因素实验（表1）。（2）正交试验：在单因素试验的基础上,采用L16(45)正交试验设计（表2）探讨花粉萌发和花粉管生长的最佳培养条件。用毛笔蘸取新鲜花粉均匀撒于凹形载玻片上的培养基表层,将载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿内,放在气候箱中黑暗保湿培养6 h,以花粉管长度等于或大于花粉粒直径视为萌发[17],统计最长花粉管长度,花粉管长度计数单位：1 D=1倍的花粉粒长度。每个处理设置3个重复,每个重复观察5个视野,计算花粉萌发率,萌发率=已萌发花粉数/花粉总数×100%
表1 单因素试验的水平设计Tab. 1 Level design of single factorial experiments |
| 因素 Factors | 水平Level | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 蔗糖/(g·L-1) | 0 | 100 | 150 | 200 | 250 |
| H3BO3/(g·L-1) | 0 | 0.10 | 0.15 | 0.20 | 0.25 |
| MgSO4/(g·L-1) | 0 | 0.03 | 0.05 | 0.07 | 0.09 |
| pH | 5.0 | 6.0 | 7.0 | 8.0 | 9.0 |
| 温度/℃ | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
注：除作为影响因素外,其他因素试验时采用蔗糖150 g/L,pH为6.0,温度为25 ℃。 | |
Note: Sucrose 150 g/L, pH 6.0 and temperature 25 ℃ were used in other factors experiment except as the influencing factors. |
表2 正交试验因素水平L16(45)Tab. 1 Orthogonal test factor level L16(45) |
| 因素 Factors | 水平Level | |||
|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 蔗糖/(g·L-1) | 100 | 125 | 150 | 175 |
| H3BO3/(g·L-1) | 0.10 | 0.15 | 0.20 | 0.25 |
| MgSO4/(g·L-1) | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.06 |
| pH | 6.0 | 6.4 | 6.8 | 7.2 |
| 温度/℃ | 15 | 20 | 25 | 30 |
1.3 数据处理
结果在LEICA DM2500型数码生物显微镜下观察拍照,并用Image J统计每个视野下不同状态花粉数量;采用正交设计助手ⅡV 3.1进行花粉萌发正交试验设计,并对试验结果进行极差分析;采用Excel 2016软件对不同湿度、贮藏温度和时间下花粉活力变化进行常规数据统计和作图,统计结果以平均值±标准误（Mean±SE）表示;采用SPSS 19.0软件对花粉萌发和花粉活力测定试验结果进行方差分析、多重比较,统计分析显著性水平均设定为P=0.05。
2 结果与分析
2.1 湿度对花粉活力的影响
由图1可知陆川油茶新鲜花粉（处理0 h）活力最高,为97.29%,但与泡水3 h花粉活力（93.83%）无显著差异,说明花粉经过短暂的泡水（时间≤3 h）对花粉活力的影响不大。随着泡水和干燥时间的延长,花粉活力逐渐下降,对比处理相同时间下泡水组和干燥组的花粉活力发现,处理前6 h泡水组花粉活力下降速度快于干燥组,处理6 h后干燥组花粉活力下降速度快于泡水组,泡水与干燥48 h后花粉活力仅为16.96%和13.24%,说明长时间（>6 h）泡水或干燥严重影响陆川油茶的花粉活力。
2.2 贮藏条件对花粉活力的影响
不同贮藏条件下花粉活力见图2,由图2可知,各贮藏温度下不同贮藏时间花粉活力差异显著。花粉收集当天花粉活力最高,达97.89%。随着贮藏时间的延长,不同贮藏温度下新鲜花粉和干燥花粉活力均逐渐降低。其中,室温（RT）贮藏条件下,贮藏0~5 d新鲜花粉活力下降速度慢于干燥花粉,贮藏5~10 d新鲜花粉活力下降速度超过干燥花粉,新鲜花粉贮藏20 d花粉活力仅为1.73%,与贮藏25~180 d的花粉活力无显著差异,干燥花粉贮藏25 d花粉活力为2.20%,与贮藏30~180 d花粉活力无显著差异。因此,新鲜花粉和干燥花粉活力均随贮藏时间的延长迅速降低,新鲜花粉贮藏20 d后失去活力,干燥花粉在贮藏25 d后完全失去活力。
4 ℃贮藏条件下,新鲜花粉贮藏0~10 d花粉活力下降速度较慢,贮藏10~25 d花粉活力下降速度最快,贮藏25~60 d花粉活力逐渐趋于平缓。干燥花粉贮藏0~15 d活力下降速度最快,贮藏15~120 d花粉活力逐渐趋于平缓。新鲜花粉贮藏90 d花粉活力为2.19%,干燥花粉贮藏120 d和125 d花粉活力分别为3.11%和2.50%,均无显著差异,因此说明,采用4 ℃贮藏,新鲜花粉90 d后失去活力,干燥花粉120 d后失去活力。
-20 ℃贮藏条件下,贮藏前5 d新鲜花粉与干燥花粉活力与采集当天花粉活力无显著差异。新鲜花粉较干燥花粉活力随着贮藏时间的延长下降速度慢,尤其表现在0~60 d;贮藏60 d,新鲜花粉活力仍有87.65%,干燥花粉活力降为61.53%;贮藏180 d,新鲜花粉活力为47.85%,干燥花粉活力为39.75%,表明相同贮藏时间下,新鲜花粉活力高于干燥花粉。
-80 ℃贮藏条件下,相比其他贮藏温度,花粉活力下降速度最慢。贮藏0~15 d新鲜花粉与干燥花粉活力均与采集当天花粉活力无显著差异;贮藏30 d新鲜花粉活力为93.74%,干燥花粉活力为83.51%;贮藏0~60 d,新鲜花粉与干燥花粉活力下降速度趋势基本一致;贮藏60~180 d,干燥花粉下降速度明显快于新鲜花粉,贮藏90 d新鲜花粉活力仍有82.83%,干燥花粉活力为71.56%;贮藏180 d时,新鲜花粉活力为69.64%,干燥花粉的活力为60.59%,花粉仍保持较高的活力,显著高于其他贮藏温度。
综合分析可知,在相同贮藏时间下,贮藏温度越低,花粉活力下降速率越慢。在室温和4 ℃贮藏温度下,干燥处理花粉比新鲜花粉保存时间更长,干燥处理花粉能够适当延长花粉保存时间,在-20 ℃和-80 ℃贮藏温度下,干燥花粉活力较新鲜花粉活力低,其中-80 ℃新鲜花粉在贮藏180 d后花粉活力最高。综上所述,采集新鲜花粉直接贮藏于-80 ℃冰箱较利于陆川油茶花粉保存。
2.3 单因素对陆川油茶花粉离体萌发的影响
图3 单因素对花粉萌发率的影响每一因素5个水平的具体值参见表1,SU代表蔗糖,TE代表温度。不同小写字母表示在0.05水平差异显著。 Fig. 3 Effects of single factorial on pollen germination The specific values of the five levels of each factor are shown in Tab. 1, SU means sucrose, TE means temperature. Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level. |
图4 单因素对花粉管平均长度的影响每一因素5个水平的具体值参见表1,SU代表蔗糖,TE代表温度。不同小写字母表示在0.05水平差异显著。 Fig. 4 Effects of single factorial on average length of pollen tube The specific values of the five levels of each factor are shown in Tab. 1, SU means sucrose, TE means temperature. Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level. |
蔗糖浓度为0时,花粉萌发率仅为3.72%,花粉管平均长度为1.47 D;蔗糖浓度为150 g/L时,花粉萌发率最高,为25.90%;蔗糖浓度为200 g/L时,花粉管平均长度最长,为8.87 D;蔗糖浓度为250 g/L时,花粉萌发率降为12.72%,花粉管平均长度降为3.53 D。说明过高或过低的蔗糖浓度均不利于花粉萌发,相对花粉萌发率适宜的蔗糖浓度而言,较高浓度的蔗糖能够促进花粉管的生长。
H3BO3浓度为0时花粉萌发率为25.97%,花粉管平均长度为6.33 D;H3BO3浓度为0.15 g/L时花粉萌发率最高,为58.72%,花粉管平均长度最长,为10.47 D,显著高于H3BO3浓度为0时,但H3BO3浓度为0.20 g/L和0.25 g/L时,花粉萌发率分别降为24.97%和16.35%,花粉管平均长度分别降为4.60 D和1.33 D,说明适宜浓度的H3BO3才能促进花粉萌发。
MgSO4浓度为0.05 g/L时,花粉萌发率最高,为43.66%,花粉管平均长度最长,为11.33 D,且高于其他试验组,说明MgSO4能够促进花粉管的生长。MgSO4浓度提高至0.07~0.09 g/L时,花粉萌发率和花粉管平均长度均显著下降,且低于不添加MgSO4试验组,说明过高浓度的MgSO4会抑制花粉萌发。
当pH为6.0时,花粉萌发率最高,为25.51%,花粉管平均长度最长,为6.33 D;pH为7.0和8.0时,花粉萌发率分别为22.61%和18.48%,花粉萌发率显著下降,花粉管平均长度分别为2.67 D和2.13 D,无显著差异;当pH为9.0时,花粉萌发率仅为0.73%,显著低于其他水平,花粉管平均长度仅为0.47 D,与pH为5.0时无显著差异,均显著低于其他水平,说明偏碱性环境对于花粉萌发较为不利。
温度为10 ℃时花粉萌发率仅为9.58%,花粉管平均长度为1.87 D,显著低于其他水平,随着温度升高,花粉萌发率和花粉管平均长度逐渐提高,温度为25 ℃时花粉萌发率为25.97%,高于温度为30 ℃时的23.81%,温度为30 ℃时花粉管平均长度最长,为9.33 D,说明温度较低不利于陆川油茶花粉萌发,花粉管生长需要较高的温度。
综合分析单因素试验结果,陆川油茶花粉萌发较为适宜的条件为：蔗糖150~200 g/L,H3BO3 0.15 g/L,MgSO4 0.05 g/L,pH 6.0,温度25~30 ℃。
2.4 正交试验对陆川油茶花粉离体萌发的影响
在单因素试验的基础上,为寻求蔗糖、H3BO3、MgSO4、pH和温度的最佳组合,进行L16(45)正交试验,正交试验设计组合及结果如表2所示,各处理对陆川油茶花粉萌发的影响呈差异显著。其中处理12的花粉萌发率最高,为63.26%,处理14花粉管平均长度最长,为12.47 D,均显著高于其他处理。对正交试验结果进行极差分析（表3）,极差值R越大代表其对结果影响越大。结果显示针对花粉萌发率这个指标,各因素的极差分别为：R蔗糖=20.24,RH3BO3=17.36,RMgSO4=14.82,RpH=0.36,R温度=14.75,即因素影响作用的主次顺序为：蔗糖>H3BO3>MgSO4>温度>pH,蔗糖4个水平下萌发率的均值最大为K3,H3BO3四个水平下萌发率的均值最大为K2,MgSO4四个水平下萌发率的均值最大为K2,pH 4个水平下萌发率的均值最大为K2,温度4个水平下萌发率的均值最大为K3,故花粉萌发率最高的组合是：蔗糖（水平3）为150 g/L,H3BO3（水平2）为0.15 g/L,MgSO4（水平2）为0.04 g/L,pH（水平2）为6.4,温度（水平3）为25 ℃。针对花粉管萌发长度这个指标,各因素的极差分别为：R蔗糖=1.72,RH3BO3= 2.14,RMgSO4=4.53,RpH= 2.07,R温度=2.53,即因素影响作用的主次顺序为：MgSO4>温度>H3BO3>pH>蔗糖,蔗糖4个水平下花粉管平均长度的均值最大为K4,H3BO3四个水平下花粉管平均长度的均值最大为K2,MgSO4四个水平下花粉管平均长度的均值最大为K3,pH 4个水平下花粉管平均长度的均值最大为K2,温度4个水平下花粉管平均长度的均值最大为K4,故花粉管平均长度最长的组合是：蔗糖（水平4）为175 g/L,H3BO3（水平2）为0.15 g/L,MgSO4（水平3）为0.05 g/L,pH（水平2）为6.4,温度（水平4）为30 ℃,而萌发率是评价花粉萌发效果的最主要指标,因此,陆川油茶花粉离体萌发的最适条件为：蔗糖150 g/L,H3BO3 0.15 g/L,MgSO4 0.04 g/L,pH 6.4,温度25 ℃。
表2 陆川油茶花粉在正交试验中的萌发情况Tab. 2 Germination conditions of C. vietnamensis pollen in orthogonal design experiment |
| 水平编号 No. | 蔗糖 Sucrose/(g·L-1) | H3BO3 /(g·L-1) | MgSO4 /(g·L-1) | pH | 温度 Temperature/℃ | 花粉萌发率 Germination rate/% | 花粉管平均长度 Average length of pollen tube/D |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 100 | 0.10 | 0.03 | 6.0 | 15 | 18.54±1.40i | 3.33±0.29efg |
| 2 | 100 | 0.15 | 0.04 | 6.4 | 20 | 48.75±1.29b | 5.47±0.37c |
| 3 | 100 | 0.20 | 0.05 | 6.8 | 25 | 29.85±0.46ef | 5.40±0.35c |
| 4 | 100 | 0.25 | 0.06 | 7.2 | 30 | 27.06±0.56fg | 2.20±0.20h |
| 5 | 125 | 0.10 | 0.04 | 6.8 | 30 | 43.57±2.86c | 5.73±0.37c |
| 6 | 125 | 0.15 | 0.03 | 7.2 | 25 | 44.27±0.76bc | 4.33±0.29de |
| 7 | 125 | 0.20 | 0.06 | 6.0 | 20 | 20.20±0.61hi | 2.53±0.13gh |
| 8 | 125 | 0.25 | 0.05 | 6.4 | 15 | 23.62±1.40gh | 7.73±0.41b |
| 9 | 150 | 0.10 | 0.05 | 7.2 | 20 | 46.51±1.36bc | 4.73±0.07cd |
| 10 | 150 | 0.15 | 0.06 | 6.8 | 15 | 46.87±2.49bc | 3.20±0.23fgh |
| 11 | 150 | 0.20 | 0.03 | 6.4 | 30 | 35.42±0.94d | 5.53±0.41c |
| 12 | 150 | 0.25 | 0.04 | 6.0 | 25 | 63.26±2.94a | 4.20±0.53def |
| 13 | 175 | 0.10 | 0.06 | 6.4 | 25 | 32.50±1.87de | 4.27±0.24de |
| 14 | 175 | 0.15 | 0.05 | 6.0 | 30 | 36.86±0.59d | 12.47±0.44a |
| 15 | 175 | 0.20 | 0.04 | 7.2 | 15 | 21.84±1.49hi | 3.47±0.41efg |
| 16 | 175 | 0.25 | 0.03 | 6.8 | 20 | 19.90±1.19hi | 3.07±0.07gh |
注：不同小写字母表示在0.05水平差异显著。 | |
Note: Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level. |
表3 正交试验对陆川油茶花粉萌发影响的极差分析Tab. 3 Range analysis of the effect of orthogonal test on pollen germination of C. vietnamensis |
| 蔗糖Sucrose/(g·L-1) | H3BO3/(g·L-1) | MgSO4/(g·L-1) | pH | 温度Temperature/℃ | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 花粉萌 发率/% | K 1 | 31.05 | 35.28 | 29.53 | 34.72 | 27.72 |
| K 2 | 32.92 | 44.19 | 44.36 | 35.07 | 33.84 | |
| K 3 | 48.02 | 26.83 | 34.21 | 35.05 | 42.47 | |
| K 4 | 27.78 | 33.46 | 31.66 | 34.92 | 35.73 | |
| R | 20.24 | 17.36 | 14.82 | 0.36 | 14.75 | |
| 花粉管平均长度/D | K 1 | 4.10 | 4.52 | 4.07 | 5.63 | 4.43 |
| K 2 | 5.08 | 6.37 | 4.72 | 5.75 | 3.95 | |
| K 3 | 4.42 | 4.23 | 7.58 | 4.35 | 4.55 | |
| K4 | 5.82 | 4.30 | 3.05 | 3.68 | 6.48 | |
| R | 1.72 | 2.14 | 4.53 | 2.07 | 2.53 |
注：K1、K2、K3、K4表示每个因素在4个水平下花粉萌发率和花粉管平均长度的平均值,R代表因素在不同水平下的极差。 | |
Note: K1, K2, K3, K4 mean the average rate of pollen germination and average length of pollen tube at four levels of each factor respectively; R represents the extreme difference at the level of the same factor. |
3 讨论
3.1 湿度对花粉活力的影响
花粉活力是影响初始坐果率和产量的重要因素,花粉活力受环境因素影响较大,其中湿度是重要因素之一[18]。水分是花粉中淀粉、脂肪水解等各种生理生化反应的良好溶剂,但花粉长时间泡在水中不利于进行呼吸作用,还会使营养物质浸出,同时泡水还会破坏花粉壁[19];干燥处理会影响花粉的含水量,研究表明花粉含水量是影响花粉活力的重要因素之一,适当干燥有利于花粉的保存,但干燥时间过长会对花粉细胞造成水胁迫,难以维持其正常的生理活动[20,21]。本研究也证实了这一点,长时间（时间>6 h）泡水或干燥严重影响花粉活力。邓鑫州等[19]通过研究泡水时间对望谟油茶和岑溪软枝油茶花粉萌发率的影响,发现泡水后严重影响花粉萌发率,泡水10~ 30 min的花粉平均萌发率仅为6.3%,显著低于未泡水的花粉,且萌发的花粉管质量较差;蔡坚等[22]通过研究不同干燥方式对普通油茶花粉萌发率的影响,发现不同干燥方式处理花粉3 h均会提高花粉萌发率,烘箱25 ℃处理效果最佳。本研究发现随泡水和干燥时间的延长花粉活力逐渐下降,但短暂的泡水（时间≤3 h）对花粉活力影响不大,与其结果不一致,可能是由于本研究中采用的是TTC法检测花粉活力,检测方法不同导致的结果差异,采用不同方法检测花粉活力有待研究。
3.2 贮藏条件对花粉活力的影响
花粉对温度反应敏感,在自然条件下很容易失去活力[25],低温贮藏会对花粉活力产生显著影响,可减缓其代谢活动、降低酶活性和呼吸作用等,使花粉活力下降的速率变慢,从而使花粉保存较长时间[26]。许多学者针对油茶花粉的贮藏特性进行了研究,花粉活力通常随贮藏时间的延长而降低,并因贮藏方法不同而异。邹锋等[14]研究发现,采用4 ℃贮藏时,攸县油茶、长尾红山茶、广宁红山茶、多齿红山茶花粉可有效保存7 d,石果红山茶、扁果红山茶、厚叶红山茶花粉可有效保存14 d,溆浦大红花和长毛红山茶花粉可有效保存21 d;蔡坚等[22]比较室温、4 ℃和-20 ℃贮藏普通油茶花粉时发现,-20 ℃贮藏花粉活力保存效果最佳,显著好于前二者;本研究发现新鲜花粉在室温和4 ℃时花粉活力下降较快,分别在贮藏20 d和90 d后失去活力,在-20 ℃贮藏90 d时活力仍有79.74%,在-80 ℃贮藏180 d后花粉活力仍有69.64%,说明温度越低花粉保存时间越长,与前人研究结果一致,因为低温环境下花粉的能量代谢会降低[27],但具体保存时间有所差异,可能与树种、树龄、树体营养状况有关[14]。
在贮藏过程中,花粉内营养物质被不断消耗,活性氧自由基增多,花粉细胞易受水分胁迫,适宜的含水量有利于其贮藏的生理活动[20],但含水量过高,在低温下细胞内结冰过多,会造成细胞膜受损,影响保存后的生活力[28],适当干燥可以减少水介导的酶解反应,从而延长花粉贮藏时间[29]。普通油茶、多齿红花油茶、广宁红花油茶、浙江红花油茶、攸县油茶等5种油茶花粉常温干燥贮藏,活力迅速下降[30];王玉娟等[31]研究发现-20 ℃真空干燥条件下贮藏的花粉能保存9个月左右;张鹏等[32]研究发现花粉干燥后比未经干燥的25 ℃和4 ℃下贮藏时间明显加长,-20 ℃干燥和-80 ℃干燥在贮藏90 d花粉仍能保持80%以上的活力,能够满足高州油茶花粉的长期贮藏要求。但本研究中在-20 ℃和-80 ℃低温贮藏90 d时,干燥花粉活力均在80%以下,新鲜花粉活力均在80%以上,显著低于新鲜花粉,可能由于本研究中采用的干燥方式未能准确控制花粉含水量,过度脱水对花粉细胞造成了一定的损伤,影响了其花粉活力[33],准确控制含水量的干燥方式对低温贮藏花粉活力的影响有待进一步研究。
3.3 花粉离体萌发的影响因素
3.3.1 培养基组分对花粉萌发的影响 花粉萌发和花粉管生长过程需要多种成分参与,蔗糖是花粉粒萌发及花粉管壁合成的主要营养物质,参与跨膜运输,可在代谢过程中为呼吸作用和淀粉合成提供原料,为花粉萌发和花粉管生长提供所需的能源和碳源[36],同时还可以在一定程度上维持花粉细胞外界环境的渗透压,保证花粉萌发形态[37],是影响植物花粉萌发的重要因素。蔗糖浓度过高,会使培养基的渗透势降低,导致细胞发生质壁分离、花粉管破裂甚至细胞脱水死亡[38];蔗糖浓度过低,会发生吸胀作用,均会降低花粉萌发率[39],本研究也证实了这一点,随着蔗糖浓度水平的提高,花粉萌发率和花粉管生长均呈先升高后降低的趋势。在离体萌发过程中,不同花粉萌发的最适蔗糖浓度随自身花粉所储存的营养物质不同而有所区别[40],不同油茶花粉萌发时所需蔗糖浓度不同,以50~250 g/L居多,本研究陆川油茶花粉离体萌发的最佳蔗糖浓度为150 g/L,与黄国文等[41]研究普通油茶花粉萌发的结果一致。
已有报道认为Mg2+能够影响花粉萌发[48],在适宜浓度下能够促进花粉的萌发。本研究在进行单因素试验时发现MgSO4浓度为0.05 g/L时,花粉萌发率显著高于MgSO4浓度为0时的花粉萌发率;正交试验结果显示MgSO4浓度为0.04 g/L时花粉萌发率最高,MgSO4浓度为0.05 g/L时花粉管平均长度最长,再次证实这一观点。
3.3.2 温度和pH对花粉萌发的影响 花粉的萌发需要适宜的条件,pH和培养温度对花粉萌发和花粉管生长都有显著的影响[38]。不同植物花粉萌发的适宜pH和温度条件也不尽相同,只有在其适合的范围内才能顺利萌发,低于或者高于适宜范围,都会对花粉萌发和花粉管生长产生不利影响[49]。温度对于不同油茶品种花粉萌发的影响差异较大,岑溪软枝油茶1号、2号和3号花粉萌发的最适温度分别是20 ℃、25 ℃和30 ℃,桂3和桂24油茶花粉萌发的最适温度均为20 ℃[50],普通油茶花粉萌发的最适pH为6.0,最适温度为25 ℃[41, 51],本研究陆川油茶花粉萌发的最适pH为6.2,最适温度为25 ℃,与其略有差异,再次证明不同植物花粉萌发的最适范围不同。在花粉萌发过程中,花粉内部的酶及化学物质会对温度作出反应,从而影响花粉的萌发,本研究中温度对于花粉萌发率和花粉管生长的影响作用均较强,陆川油茶授粉期处于11—12月,外界温度低于花粉萌发的最适温度,严重影响花粉的萌发,可能是导致授粉成功率低、座果率低的原因之一。
综上所述,本研究认为,短暂的泡水（时间≤ 3 h）对花粉活力的影响不大,但长时间（时间>6 h）泡水或干燥严重影响陆川油茶的花粉活力,采用喷雾法进行人工授粉时应注意控制时间,与其他处理相比,采集新鲜花粉直接贮藏于-80 ℃冰箱较利于陆川油茶花粉保存,花粉离体萌发的最适条件为：蔗糖150 g/L,H3BO3 0.15 g/L,MgSO4 0.04 g/L,pH 6.4,25 ℃。研究结果为今后陆川油茶花粉的收集、贮藏提供了理论依据,也为有效解决花期不遇的问题、保障人工杂交育种工作的有效开展提供技术指导。