青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）寄主范围广泛,能够引起200多种植物感染青枯病[1]。青枯病是茄子和马铃薯等茄科作物生产中主要的病害之一,该病害能造成严重的损失,甚至可以导致绝收。在我国,除西藏、黑龙江和内蒙古外,其余省份均有青枯菌的报道,尤其是在热带和亚热带地区,青枯病危害更为严重[2]。到目前为止,尚无有效的方法对其进行防控。而研究青枯菌的致病机理对防控青枯病具有重要意义。利用标记基因追踪病原菌在植物体内的入侵、定殖等侵染途径,是研究病原菌致病机理的有效手段和方法[3⇓⇓⇓-7]。目前在R. solanacearum中使用的标记基因有GFP[8⇓-10]、LUX[9,12]和GUS[13]等。标记基因在R. solanacearum中的表达主要有2种方式,一种是利用Tn5转座子将外源基因定点插入到R. solanacearum的染色体中[14],该方法插入的外源基因能稳定存在于R. solanacearum染色体中,不会由于环境条件的影响而丢失,但是该方法操作较为繁琐,且可能由于片段的插入导致R. solanacearum的基因功能丧失。Monteiro等[10]根据R. solanacearum演化型I和演化型II染色体序列特点,设计了特异引物开发了pRC系列载体,将标记基因定点插入到染色体中的假基因区域,直观地研究了R. solanacearum在马铃薯、番茄中的浸染途径。第二种方法是将含有标记基因的广宿主质粒转化R. solanacearum,以游离质粒表达标记基因,该方法操作简单且不会由于定点插入导致R. solanacearum的基因功能丧失[11]。但是目前报道适宜R. solanacearum的载体较少。
本研究将广宿主载体pBBR1MCS2-Tac- EGFP通过电转化法将其导入R. solanacearum中,分析pBBR1MCS2-Tac-EGFP在R. solanacearum中的稳定性以及R. solanacearum的致病力,研究结果将为进一步研究R. solanacearum在植物体内的入侵、定殖提供适宜的标记载体工具。
1 材料与方法
1.1 菌株
R. solanacearum菌株GMI10000（间接来源于已故法国农科院的Philippe Prior研究员的实验室）。广寄主载体pBBR1MCS2-Tac-EGFP由本实验保存,该质粒在工程菌中具有卡拉霉素（kan）抗性,由Tac启动子驱动EGFP的表达（图1）。马铃薯品种脱毒苗‘陇薯7号’由本实验室保存。
1.2 pBBR1MCS2-Tac-EGFP电击转化及检测
利用电转化方法将pBBR1MCS2-Tac-EGFP转化R. solanacearumGMI1000菌株。GMI1000感受态的制备和电转化方法参考张治飞[13]的方法。电击转化后取100 μL的菌液涂布于含有50 mg/L卡拉霉素的NA固体培养基上（葡萄糖5.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,牛肉浸膏3 g/L,琼脂粉7 g/L）,30 ℃培养48 h。
利用LUYOR-3415RG双波长荧光蛋白激发光源在440 nm激发光下检测转化子EGFP的表达。根据EGFP最大开放阅读框抗性基因设计引物（EGFPF：ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTT TC,EGFPR：TTATTTGTAGAGCTCA TCCATGC C）并且委托广州天一辉远基因科技有限公司进行合成。PCR体系为：2×PCR Mix（康为世纪）12.5 μL,EGFPF（10 μmol/L）1 μL,EGFPR（10 μmol/L）1 μL,无菌水9.5 μL,菌液1 μL。PCR反应程序：95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃ 5 min,PCR产物电泳检测。将阳性克隆命名为GMI1000-Tac-EGFP。
1.3 遗传稳定性评价
将GMI1000-Tac-EGFP转接至不含卡拉霉素的NA培养基上,连续转接培养20次,分析pBBR1MCS2-Tac-EGFP在GMI1000的遗传稳定性。在第2次、第10次和第20次转接培养时,将GMI1000-Tac-EGFP从平板上用无菌水冲洗,悬浮至OD600=0.8左右,然后利用Tecan Spark测定荧光强度,激发波长485 nm,发射波长为535 nm,其中Gain值设定为80。
1.4 荧光强度测定
将GMI1000-Tac-EGFP转接至NA液体培养基中,28 ℃过夜培养至OD600=0.8左右,6 000 r/min离心10 min,收集菌液,用无菌水进行重悬浮至OD600=1.0。然后用无菌水进行4倍梯度稀释。利用Tecan Spark测定荧光强度,激发波长485 nm,发射波长为535 nm,其中Gain值设定为80。使用Excel软件进行线性回归分析。
将苗龄为20 d左右的‘陇薯7号’组培苗移栽于7 cm × 7 cm的营养钵中,25~28 ℃培养20 d左右后用于人工接种GMI1000-Tac-EGFP。在接种后7 d,取马铃薯茎基上1 cm茎段用于R. solanacearum数量分析。将茎段在75%酒精消毒后置于0.2 mL的无菌水中浸泡1 h。取200 μL测定荧光强度,分析 R. solanacearum的克隆数。同时取500 μL利用平板稀释法统计菌落数,具体方法参考郜刚 [15]的方法。3次生物学重复。
1.5 致病力分析
将苗龄为20 d左右的‘陇薯7号’组培苗移栽于7 cm × 7 cm的营养钵中,25~28 ℃培养20 d左右后用于人工接种。将GMI1000-Tac-EGFP和野生型GMI1000用无菌水稀释至1×108 CFU/mL,进行伤根接种,每株接种20 mL菌液。同时以无菌水为对照。每次处理10株,3次生物学重复。接种后置于培养箱,28~30 ℃光照培养,统计萎蔫症状出现的时间。
1.6 利用GMI1000-Tac-EGFP分析R. solanacearum动态侵染过程
马铃薯‘陇薯7号’组培苗培养20 d后进行接种。接种后置于培养箱,28~30 ℃光照培养。在接种后每24 h利用LUYOR-3415RG双波长荧光蛋白激发光源在440 nm激发下检测EGFP表达,并且拍照记录。
2 结果与分析
2.1 pBBR1MCS2-Tac-EGFP成功转入GMI1000
图2 GMI1000-Tac-EGFP菌株PCR检测M：DL2000 maker;+：pBBR1MCS2-Tac-EGFP质粒;1~5：GMI1000-Tac-EGFP克隆;-：GMI1000。 Fig. 2 PCR detection of GMI1000-Tac-EGFP strain M: DL2000 maker; +: pBBR1MCS2-Tac-EGFP plasmid; 1-5: GMI1000-Tac-EGFP clone; -: GMI1000. |
2.2 GMI1000-Tac-EGFP稳定表达EGFP荧光
为进一步分析pBBR1MCS2-Tac-EGFP在GMI1000中的遗传稳定性,将不同移植时间的菌液涂布于平板上,培养观察绿色荧光的表达情况,发现在移殖培养2次、10次和20次后,其荧光强度之间差异不显著（图4）。结果表明,pBBR1MCS2- Tac-EGFP载体能够在GMI1000中稳定遗传。
2.3 EGFP荧光值与GMI1000-Tac-EGFP数量线性相关
与平板稀释法相比,利用EGFP荧光定量分析细菌的克隆数具有高效快捷的优点。图5结果表明,在4.0×106~1.0×109 CFU/mL的范围内,EGFP的荧光强度值与GMI1000-Tac-EGFP的数量呈线性相关关系,R2为0.9954。当GMI1000- Tac-EGFP稀释至约9.0×105 CFU/mL时,EGFP荧光值接近于无菌水的荧光值,此时EGFP的荧光强度较弱,未能进行有效检测。因此在4.0×106~1.0×109 CFU/mL范围内,可以利用EGFP荧光值计算R. solanancearum的数量。
根据EGFP荧光值与GMI1000-Tac-EGFP数量的线性关系,统计得到GMI1000-Tac-EGFP数量为9.75×108 CFU/g,而平板计数法统计得到的数量为8.95×108 CFU/g（图6）。虽然利用EGFP荧光值估算的GMI1000-Tac-EGFP数量大于平板计数法统计得到的数量,但是二者差异不显著。因此可以利用EGFP荧光值计算R. solanancearum的数量。
2.4 pBBR1MCS2-Tac-EGFP不影响GMI1000致病力
通过致病力试验,发现GMI1000-Tac-EGFP和GMI1000接种马铃薯6 d后,叶片开始出现萎蔫状（图7）,而无菌水对照叶片正常。结果表明,pBBR1MCS2-Tac-EGFP不影响GMI1000的致病力。
2.5 R. solanacearum侵染马铃薯动态变化过程
通过GFP荧光能够动态直观地观察R. so lanacearum在马铃薯中的动态变化过程（图8A）。‘陇薯7号’接种1 d后,在其根部能观察到微弱的荧光,证明在接种1 d后,R. solanacearum已经进入到马铃薯根部（图8B）。随着培养时间的增加,GFP荧光强度越来越强,并且分布的部位也越来越广,R. solanacearum在马铃薯植株内不断繁殖和扩散。接种后第4天,在马铃薯的茎部检测到GFP荧光,表明R. solanacearum已经进入到马铃薯茎部;接种后6 d整个茎均有GFP的分布,接种后7 d,叶片的叶脉也有GFP荧光,此时R. solanacearum在整个植株内均有分布。在接种后5 d马铃薯的部分叶片出现萎蔫症状,接种后7 d整个植株萎蔫。这是由于R. solanacearum在马铃薯的维管束中大量积累,堵塞导管水分的运输,最终导致马铃薯萎蔫。
图8 利用GMI1000-Tac-EGFP分析R. solanacearum侵染马铃薯动态变化过程A：R. solanacearum侵染马铃薯动态变化过程;B：接种后1 d R. solanacearum已经进入到马铃薯根部;bar=50 μm。 Fig. 8 Analysis of dynamic infection progress ofR. solanacearum in ptotato A: Dynamic infection progress ofR. solanacearum in ptotato; B: R. solanacearum inoculation the potato root after 1 d inoculation. bar=50 μm. |
3 讨论
本研究利用电转化法成功将pBBR1MCS2- Tac-EGFP广寄主载体导入R. solanacearum GMI1000菌株中,并且GMI1000-Tac-EGFP能够在马铃薯中稳定表达。赵志文等[11]以pBBR1MCS-5载体为骨架构建了pBBR1MCS5- pRipAK-GFP载体,将其转化R. solanacearum、番茄细菌性斑点病菌和柑橘溃疡病菌,结果表明该载体能够在这3种病原菌中稳定表达。同时在荧光显微镜下,GMI1000-Tac-EGFP整个细胞呈现绿色,棒状,近椭圆形[9,11]。标记基因是否影响病原菌对植物的致病力是标记基因能否应用于病原菌的首要条件之一。而由于马铃薯组培苗较为幼嫩,在植株的根和茎秆均能检测到强烈GFP荧光。因此以pBBR1MCS为骨架载体适宜标记R. solanacearum。
启动子对下游基因的表达起着关键的调控作用。目前利用在R. solanacearum上使用的标记基因主要为R. solanacearum内源启动子,如RipAK、hrpG、hrpB、Exopolysaccharid等基因的启动子[10-11,21],植物叶绿体PsbA启动子[9]以及细菌的lac启动子[11]。这些启动子均能驱动标记基因的高效表达,而其他外源启动子驱动标记基因在R. solanacearum中的表达尚未见报道。Tac启动子是一个由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子,在大肠杆菌中有高效的表达效率。在本研究中,GMI1000-Tac-EGFP在培养基上和植物体内均能发出显著的GFP荧光,证明Tac在R. solanacearum中也有较强的启动活性,可以用于驱动外源基因在R. solanacearum的表达。而这些启动子的表达效率的比较尚未见报道。在鱼腥藻中,PsbA启动子驱动效率与Tac启动子无明显差异[22],但是在R. solanacearum中的表达效率是否有差异有待进一步的研究。
利用GFP标记R. solanacearum在植物病原菌互作中得到了应用。首先是分析R. solanacearum在浸染植物的过程。在自然条件下R. solanacearum通过伤口等侵染植株,然后通过木质部向地上部分运输,并且在导管中大量繁殖,最终导致植物萎蔫[4,12,21]。R. solanacearum大量粘附在其根系表面,并在皮层形成浸染点,或者通过根尖、侧根和根部伤口侵入植株根部（接种后1 d）;然后迅速进入根部维管束组织（接种后2~3 d）,并向上浸染,进入茎部维管束组织和叶片（接种后4~5 d）,导致马铃薯导管堵塞,最终导致表现出萎蔫（接种后6~7 d）[5,13,22 -23]。本研究中,‘陇薯7号’接种1 d后,在其根部能观察到微弱的荧光,在接种后第4天马铃薯的茎部检测到GFP荧光,第7天时叶片的叶脉也有GFP荧光,这与前人的研究结果基本一致[5,13,22 -23]。其次是利用GFP荧光值分析病原菌的细胞数量。与传统的平板稀释法[23]、QPCR定量法[24]相比,该方法具有简单、快捷、时间短和成本低等优势。本研究中,在4.0×106~1.0×109 CFU/mL范围内,EGFP的荧光强度值与GMI1000-Tac-EGFP的数量呈线性相关关系,并且荧光强度计数法与平板稀释法二者计算的R. solanacearum克隆数之间差异不显著,因此可以利用EGFP荧光值分析R. solanacearum的细胞数量。